聚合酶链反应标记输血传播病毒（TTV）地高辛霉探针的初步应用

用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）制备地高辛素标记的输血传播病毒（ＴＴＶ）探针,并与巢式ＰＣＲ法比较。结果 该探针具有ＴＴＶ特异性,其灵敏度为１０ｐｇ ＤＮＡ。应用该法检测１０８份非甲￣庚型肝炎病人的血清标本,应用该法检测１０８份非甲￣庚型肝炎病人的血清标本,ＴＴＶ ＤＮＡ阳性率为１８．５％（２０／１０８）;检测２２份病人的粪便标本,ＴＴＶ ＤＮＡ阳性率为２７．３％（６／２２）。该法与ｎＰＣＲ法的总符合率     

输血传播病毒(TTV)的研究进展

输血传播病毒(TTV)是1997年日本学者发现的一种与输血后肝炎相关的DNA病毒.本文将各国学者有关这一问题的病毒学、流行病学、临床表现及检测技术等方面的研究进展作一简要综述.     

输血传播病毒(TTV)研究近况

继1995年发现庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)后,最近,又发现了一种经输血传播的DNA病毒,臂命名为输血传播病毒(Transfusion Transmitted Virus,TTV),本文对该病毒的有关研究近况进行了综述。     

经输血传播病毒(TTV)研究进展

病毒性肝炎是一类由肝炎病毒引起的以肝脏损害为主的疾病．其强的致病性与传染性，严重危害人类的健康。目前研究表明，导致人类肝炎的嗜肝病毒甲型至庚型病毒之外，临床上仍有3．5％～15％的肝炎患者的肝炎病毒血清标志表现为全部阴性，即所谓非甲一非庚型肝炎，这提示在已经认识的肝炎之外，仍存在未被发现的病原体。     

输血传播病毒（TTV）研究近况

继１９９５年发现庚型肝炎病毒（ＨＢＶ／ＧＢＶ－Ｃ－后，最后，又发现了一种经输血传播的ＤＮＡ病毒，暂命名为输血传播病毒。本文对该病毒的有关研究近史进行了综述。     

聚合酶链反应结合斑点杂交测定乙型肝炎病毒DNA的评价

分别以Ｄｏｔｂｌｏｔ，ＰＣＲ－ＥＢ，ＰＣＲ－Ｄｏｔｂｌｏｔ法测定了１４６例慢性乙型肝炎患者血清ＨＢＶＤＮＡ。结果显示在ＨＢｅＡｇ组，ＰＣＲ－Ｄｏｔｂｌｏｔ阳性率（１００％）显著高于ＰＣＲ－ＥＢ（９４．８％），在ＨＢｅＡｂ组，ＰＣＲ－Ｄｏｔｂｌｏｔ的检出率为５４％，ＰＣＲ－ＥＢ为３８％。两者总检出率分别为８４．２％和７５．３％，统计学处理差异显著。有３例ＰＣＲ－ＥＢ再现生信号，但ＰＣＲ－Ｄｏｔｂｌｏ     

聚合酶链反应结合地高辛标记探针杂交检测宫颈组织癌人乳头瘤病毒

应用聚合酶链反应结合地高辛标记探针杂交方法检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）。应用１对通用型引物检测３６例新鲜活检宫颈癌组织中ＨＰＶ，凝胶电泳分析与聚合酶链反应结合印迹杂交（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ）及聚合酶链反应结合斑点杂交的检测阳性率分别为６６７％、６９４％、６９４％，结果基本一致。应用３对通用型引物检测宫颈癌组织中ＨＰＶ，ＨＰＶ的检测阳性率分别为７２２％（２６／３６）、７５０％（２７／３６）、６３２％（１２／１９），总的检测阳性率为９１７％（３３／３６）；在β球蛋白基因阳性的２７例宫颈癌组织中，总的检测阳性率为９００％（２４／２７）。说明聚合酶链反应结合地高辛探针检测ＨＰＶ方法可应用于宫颈癌的分子流行病学研究。     

聚合酶链反应和地高辛标记的核酸杂交技术用于钩端螺旋体的检测

目的为钩端螺旋体快速诊断和流行病学调查建立一种比较理想的方法.方法根据钩端螺旋体赖株DNA合成一对flaB引物,用PCR技术对钩端螺旋体菌株、疫区现场动物标本等进行flaB基因扩增,用地高辛（DIG）标记flaB基因探针,用琼脂糖凝胶电泳和斑点杂交技术进行检测.结果纯化钩端螺旋体DNA 5pg经flaB-PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳可以目测.用DIG标记的flaB探针可以检测到5fg及以下的DNA扩增产物.疫区70份蛙肾标本,分离细菌8株,阳性率11.43%.flaB扩增阳性14份,阳性率20%;DIG标记探针斑点杂交检测,阳性19份,阳性率为27.14%.结论PCR-斑点杂交是一种灵敏、特异、快速的钩端螺旋体检测方法,既可用于快速检测和早期诊断,也可用于疫情监测和流行病学调查.     

输血传播病毒（TTV）感染的研究

目的: 了解输血传播病毒 (TTV) 在广西人群中感染情况, 探讨TTV 在肝炎发病中的作用与地位。方法: 用套式聚合酶链反应检测血清中TTVDNA,用ELISA或RT—PCR法排除非甲—庚型肝炎病毒。结果:正常献血员TTVDNA阳性率为16.4% (12/73), HBV感染者TTV DNA阳性率为4.3% (2/46), 显著低于正常献血员(χ2 = 3.97, P< 0.05), 非甲—庚肝炎患者TTV DNA阳性率为35.4% (6/17), 与正常献血员无显著性差异(χ2 = 3.0, P> 0.05), TTV感染在男女性别中无显著性差异, 但在30～50岁人群中感染率(17/78) 显著高于其他年龄段(4/58) (χ2 = 4.92, P< 0.05)。结论: 广西存在TTV 感染,且中年人群高于其他年龄段人群,TTV与HBV可有存在互相抑制或干扰作用, 但TTV可能不致病或具轻微致病性     

巢式聚合酶链反应检测SEN病毒方法的建立及初步应用

目的：研究建立巢式聚合酶链反应（nPCR）检测SEN病毒D和H亚型的方法,并将其应用到流行病调查。方法：选择SENV开放读码框1（ORFⅠ）核苷酸序列设计合成特异性引物,建立检测SEN病毒D和H型感染的巢式PCR方法,对216例无偿献血者、65例甲肝患者、152例乙肝患者、79例丙肝患者和83例非甲～非戊肝患者进行了SENV感染的检测。结果：该方法特异性和灵敏度均较高,检测结果显示健康献血者、甲肝、乙肝、丙肝和非甲～非戊型肝炎患者SENVD和/或H总感染率分别为29.1%、38.5%、55.3%、54.4%、38.5%。SENV D和/或H在健康献血者中总感染率显著低于乙肝和丙肝患者（P〈0.01）。甲肝、乙肝、丙肝和非甲～非戊型肝炎患者总感染率无显著性差异（P〉0.05）。结论：巢式PCR方法可用于检测SENV感染。我国部分地区无偿献血和肝炎等患者中存在SENV感染,其致病性有待进一步研究。     

我国不同人群输血传播病毒感染调查

目的　了解不同人群输血传播病毒 (TTV)的感染状况。方法　采用套式PCR法检测血清标本中TTVDNA ,并对其中 1株TTV的部分基因序列进行了测定。结果　不同人群TTVDNA阳性率分别为 :正常体检人群 10 .3% ,献血员 43.7% ,吸毒者 15 .6% ,血液透析病人5 4.4% ,妓女 65 .0 % ,慢性丙型肝炎病人 2 5 .0 % ,非甲～庚型肝炎 0 / 11。结论　TTV在各类人群中均有较高的感染率     

深圳市一般人群输血传播病毒感染的现况研究

目的　探讨深圳市一般人群中输血传播病毒 (TTV)感染情况及其影响因素。方法采用多阶段随机抽样抽取研究对象 ,并用套式聚合酶链反应法 (nPCR)检测该人群血清中TTVDNA。结果　深圳市一般人群中TTVDNA总阳性率为 11.86% ,男女阳性率分别为 14 .67%和9.41% ;年龄组间TTVDNA阳性率差异无显著性 ,单因素和logistic回归分析未显示肝病史、近期手术史、注射史、拔牙史及乙型肝炎疫苗接种等因素与TTVDNA感染有关 ;HBsAg、抗 -HBs和抗 -HBc与TTV感染无统计学意义。但不同职业人群TTVDNA阳性率差异有显著性 ,地税干部和中小学教师TTVDNA阳性率高于其他人群。结论　深圳市一般人群中TTV感染率较高 ,尤其是地税干部和中小学教师 ,但其流行因素尚需进一步研究     

江西省九江市健康婴儿中TTV感染的调查

目的 了解九江市健康婴儿血清中输血传播病毒(TTV)感染状况及传播途径。方法用改良非编码区聚合酶链反应(UTR PCR)和N22 PCR法,分别检测婴儿和献血员血清中TTVDNA。结果 用改良UTR PCR检测86例婴儿中51例(53.5％)TTV DNA为阳性,59例献血员中TTV DNA全部阳性。而N22 PCR在这两类人群中阳性检出例数分别为14例(16.3％)和22例(37.3％)。在<30天龄、1～6月龄和7～12月龄婴儿中,TTV DNA检出率分别为0、33.3％、95.0％(UTR PCR)和O、7.4％、30.0％(N22 PCR)。结论 用UTR PCR检测表明,九江市95％的半岁以上婴儿及100％成人都感染有TTV,而用N22 PCR在相同人群中检测的结果明显偏低,两种方法的检出率差异有显著性;婴儿中TTV的原发感染可能是出生后从环境中获得,并且随其年龄增长感染逐渐增多,半岁后可接近同一地区健康成人的感染水平。     

输血传播病毒对妊娠结局的影响

目的:探讨TTV感染对妊娠结局的影响。方法:应用半巢式聚合酶链反应技术检测113例孕产妇血清及其新生儿脐血的TTV—DNA。结果:孕产妇TTV阳性率13.3%(15/113),新生儿TTV阳性率7.8%(9/113)。孕产妇TTV阳性者及阴性者的分娩结局比较,无显著性差异。结论:孕产妇及新生儿间存在母婴垂直传播,孕妇感染TTV后未见不良妊娠结局,远期影响尚需观察。     

河北地区TT病毒感染与不同型别病毒性肝病的关系

目的分析健康人群及肝病患者TTV感染状况。方法采用TTV（N22）区核苷酸序列设计引物，建立半巢式聚合酶链反应（Semi—nested PCR）方法，对309例7种不同人群血清检测TTV DNA。结果TTV在非甲一非戊型肝炎、肝硬化患者、丙型肝炎、急性甲型肝炎、急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎和健康人群中感染率分别为75．00％（15／20）、75．00％（27／36）、61．90％（13/21）、58．06％（18／31）、52．78％（38／72）、45．61％（26／57）和38．89％（28／72）。肝硬化患者及非甲非戊型肝炎感染率明显高于健康人群（P〈0．01），也明显高于急、慢性乙型肝炎患者（P〈0．05）。21～30岁年龄组TTV感染率（39．06％）显著低于51～60岁年龄组感染率（68．75％）（P〈0．01），其他年龄间无差异。急性甲型肝炎、急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎与丙型肝炎之间无统计学意义，性别之间亦无统计学意义。结论TTV在河北地区健康人群及肝病患者中有较高的感染率，TTV感染与不明原因ALT升高有一定的关系。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测唾液HBV-DNA含量

目的:采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法准确地定量检测血清、唾液中乙型肝炎病毒(HBV)的数量和免疫指标,进而全面评估唾液乙肝DNA在乙型肝炎的预防、诊断及治疗方面的意义。方法:采用FQ-PCR法检测200例乙型肝炎患者血清、唾液中HBVDNA的含量。结果:(1)经FQ-PCR检测,200份标本中血清HBVDNA含量>103copies/ml的有180例(90%),相应的唾液中HBVDNA含量>103copies/ml的有145例(72.5%),同时病毒含量>105copies/ml标本中血清168例(84.0%),唾液98例(49.0%),血清HBVDNA与唾液HBVDNA水平之间存在显著相关(r=0.79,P<0.001)。(2)在不同的血清免疫指标组合中乙肝病毒含量也不相同,在HBeAg( )组与HBeAg(-)组中,血清与唾液的病毒含量与阳性率均存在HBeAg( )组明显高于HBeAg(-)组,在HBeAg( )组中血清、唾液HBVDNA平均水平分别为7.13、5.01 logcopies/ml。血清、唾液病毒含量在两组不同免疫组合中差别均有统计学意义(P<0.01)。结论:(1)乙型肝炎患者除了血清外,唾液中也存在具有感染性的高病毒载量HBVDNA,可能成为传染源之一。(2)唾液中定量检测HBVDNA与血液中HBVDNA含量存在明显相关性,在一定程度上也能反映HBVDNA在体内复制情况。     

乙型肝炎病毒的液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用探讨

目的 利用液相杂交技术,将核酸杂交技术进行简化,建立乙型肝炎病毒(HBV)的液相杂交的聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA)方法.方法 以HBV为目的靶DNA,引物P15'端标记Bio-PCR扩增37个循环.PCR扩增产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合,85cC 2.5 min,60C1 min进行杂交,杂交后产物均经过链霉素亲和素酶标板进行固定,经过酶标仪记录抗地高辛标记抗体,结合、显色.结果 液相杂交酶联免疫检测条件的优化:地高辛的探针浓度为2.4 pmol/次,液相杂交时间为2.5min,固相杂交时间为100 min,检测结果差异无统计学意义(P＞0.05);本试剂对87份“HBsAg+、HbeAg+、抗HBc+”标本的阳性检出率为91.95％; 72例“HBsAg+、抗-Hbe+、抗HBc+”标本的阳性检出率为68.06％,其他免疫检测指标组合标本为16份.结论 HBV的液相杂交技术应用于聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA),该杂交技术的实验操作简便,快速,适合于临床实验室的检测.     

人乳头状瘤病毒亚型PCR/RDB基因分析方法的建立及初步评价

目的建立一种基于PCR和RDB技术的临床实用、价格低廉、能对目前已知的绝大多数高危型及常见的低危型人乳头状瘤病毒(HPV)进行基因分型的检测方法(PCR/RDB法),并对该方法用于HPV分型检测做出方法学评价。方法根据HPV基因序列设计可扩增包含目前常见的HPV型别的通用引物,并根据14种HPV高危亚型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)和7种低危亚型(6、11、42、43、44、53、CP8304)的序列特点设计针对这21种HPV型别的型特异性探针。21种HPV亚型标准毒株PCR产物与HPV型特异性探针进行杂交,建立一次性对21种HPV亚型进行分型的PCR/RDB检测方法。将PCR/RDB法用于213例经杂交捕获法(hybird capture,HCⅡ)检测为高危型HPV阳性样本的HPV型别诊断。结果建立的PCR/RDB法均能鉴定出21种HPV亚型,无假阳性和假阴性结果,未出现交叉反应;含有相当于10个以上HPV分子的质粒标准品均能成功获得PCR产物检测的阳性结果;盲法分析结果显示,195例经HCⅡ法检测为高危型HPV阳性的样品被PCR/RDB检测出具体的HPV型别,共检测出13种高危型HPV亚型,检出率分别是32.31%(16型)、23.08%(52型)、17.95%(58型)、11.79%(31型)、10.26%(68型)、9.74%(33型)、8.21%(18型)、6.15%(66型)、3.08%(59型)、2.05%(45型)、2.05%(39型)、1.54%(56型)、1.03%(51型)。单一HPV亚型感染及2种、3种和4种HPV亚型混合感染构成比分别为59.46%、30.81%、8.65%和1.08%。18例未能检测出HPV的具体型别,PCR/RDB法与HCⅡ法的高危型HPV检测结果的符合率为91.5%(195/213)。结论PCR/RDB法与HCⅡ法高危型HPV检测阳性符合率高,并可一次性分析出21种HPV型别,是一种准确、高效、经济的HPV型别检测方法,可用于HPV的常规基因型分型诊断及人群筛查。     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA假阴性结果原因分析

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus, HBV-DNA)产生假阴性结果的原因,以控制和减少假阴性结果。 方法依据第三版《临床检验操作规程》和2013版中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment,CNAS)-CL36《医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明》,对当天送检的79份HBV DNA定量项目出现HBV-DNA假阴性的临床标本进行复查,并通过试验研究对试剂、仪器、操作过程和环境等原因分别进行确认。首先,分析2015年5月13日检测的79份临床送检的HBV-DNA定量检测血清标本和质控品的仪器原始结果,排除试剂、仪器和人员问题;其次,5次重复实验验证HBV-DNA定量结果为10⁷ IU/ml的临床血清样本是否因主要操作步骤不规范导致HBV-DNA定量检测结果下降(偏倚>7.5%)。选择第一次检测结果在6次方以上的血清标本2份,平行做5个复孔,其中1份标本做5个复孔,即用取上清液时所弃沉淀分别以不弃掉沉淀、弃掉1/4沉淀、2/4沉淀、3/4沉淀和全部沉淀分为A0、A1、A2、A3、A4组,比较弃上清液中沉淀量对HBV DNA定量检测结果的影响。另1份标本5个复孔在加模板量时,以正常加2 μl为对照组A0,其他4孔分别加1.5、1、0.5、0.1 μl模板为A1、A2、A3、A4组,分析模板加样量的不同对HBV DNA定量检测结果的影响;第三,挑选第一次HBV DNA定量检测结果为不同次方的10份血清标本,其中5份分别加入1 μl除胶剂,另5份分别加入1 μl含氯消毒液,验证是否因除胶剂或含氯消毒液导致HBV-DNA定量检测出现假阴性结果(偏倚>7.5%)。 结果操作过程中弃上清液时,A1~A4组与A0比较,各孔的偏倚均<7.5%,无差异。加入不同量的模板,A1和A2与A0比较,无差异(偏倚均<7.5%),随着模板加入HBV DNA量的减少,A3和A4孔HBV DNA值逐渐降低,偏倚均>7.5%。加入商用除胶剂1 μl后的检测结果与初次检测结果比较,5份标本中,有3份标本检测结果偏倚>7.5%。加入含氯消毒液1 μl后的检测结果与初次检测结果比较,5份标本中有3份标本检测结果偏倚>7.5%,其中有1份标本结果由阳性(10⁷ IU/ml)变为阴性。 结论除胶剂和次氯酸气溶胶对荧光定量PCR的DNA模板扩增环节的抑制作用是产生荧光定量PCR检测HBV-DNA假阴性的主要原因,临床基因实验室应当注意使用除胶剂和次氯酸消毒液后通风与降低次氯酸在空气中浓度过高问题。     

献血员中TTV感染的检测及部分基因序列分析

目的　探讨湛江地区献血员中输血传播病毒 (TTV)的感染状况及部分TTV的基因序列。方法　采用SDS和蛋白酶K法提取 4 80份正常献血员、6 0份血清丙氨酸转氨酶 (ALT)异常献血员的血清标本DNA ,应用套式PCR方法检测TTV的感染状况 ,并对部分扩增出的阳性片段进行克隆测序 ,与国内外报道的序列进行同源性比较。结果　在 4 80份正常献血员血清标本中 ,5 2份 (10 83% )TTVDNA阳性 ;在ALT异常的 6 0份献血员血清标本中 ,15份TTVDNA阳性 ,阳性检出率为 2 5 % ,明显高于正常献血员人群 (χ2 =9 84 7,P <0 0 1)。序列分析结果显示 ,从献血员中随机选出的 5例TTVDNA阳性片段 ,其序列与日本株 (AB0 0 8394 )和中国株 (TTVCH1)相应位置核苷酸序列的同源性大于97% ,可能属同一基因型。结论　湛江地区献血员中存在TTV感染 ,输血可能成为TTV感染的传播途径之一。