弓形虫RH株表面抗原P30基因重组质粒的构建及鉴定

目的：构建弓形虫RH株表面抗原P30基因的重组表达质粒,为下一步免疫与诊断研究制备高纯度P30重组蛋白奠定基础。方法：自弓形虫RH株感染小鼠腹水中收集速殖子,用酚／氯仿法提取基因组DNA,用PCR法扩增编码P30的基因片段(经电泳切带纯化),定向插入到PQE-30表达质粒中,转化入TG1宿主菌,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切、PCR扩增和DNA序列分析等方法对插入片段进行鉴定。结果：阳性重组质粒PQE30-P30经Sal HindⅢ双酶切下的插片及PCR扩增产物均与原插入的P30基因片段大小一致为976bp,通过序列测定证实插入片段为编码P30的基因片段。结论：成功构建弓形虫表面抗原P30基因的重组质粒PQE30-P30。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒,方法 根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上,下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3．0,并转入DH5ct宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA—MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA—MIC3．     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的：构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT－6的重组卡介苗，方法：分别以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原（α－Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列，将esat-6基因与大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组，得到重组质粒pME,再将BCGα－Ag信号肽序列克隆至pME中，得到重组质粒pSME。结果：质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实，克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261，结论：重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT－6，该质粒的构建成功为改造卡介苗，发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

弓形虫529 bp重复序列基因的PCR阳性质控质粒的构建

目的：构建含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒,为基于该基因的弓形虫病分子生物学诊断建立标准阳性对照品。方法：以弓形虫RH株基因组DNA为模板,对529 bp的基因片段进行扩增,将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转入大肠埃希菌DH-5α中,提取重组质粒PCR及测序鉴定。以弓形虫529 bp基因为靶基因设计的检测引物,扩增弓形虫基因组DNA及质粒DNA。结果：PCR产物序列与GENBANK中弓形虫529 bp基因序列完全一致。以弓形虫基因组DNA和质粒DNA为模板,成功扩增出预期的249bp基因片段。结论：成功构建可作为标准阳性对照品的含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒pMD-18-Tox,为经济实用的弓形虫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

白念珠菌钙调蛋白基因单点突变重组质粒的构建和鉴定

目的；构建白念珠菌钙调蛋白基因（CMD1）单点突变重组质粒，为进一步探讨CMD1突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础。方法：采用PCR定点突变法，将CMD1编码C端3个苯丙氨酸（F89、F92和F141）的碱基分别定点突变成编码丙氨酸的碱基，构建CMD1单点突变重组表达质粒，并进行序列测定。结果：测序结果证实，所构建的3个重组质粒均含有相应的CMD1定点突变后的序列，F89^ ：TTC→GCT；F92^ :TTT→GCC；F141^ :TTT→GCC。结论：成功构建了3个CMD1单点突变重组表达质粒，为后续研究奠定了基础。     

弓形虫p30-Rop2复合基因大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒的构建

目的：构建弓形虫p30—Rop2复合基因大肠杆菌／分枝杆菌穿梭表达质粒。方法：利用PCR技术从已构建的pET30-p30-Rop2质粒扩增p30-Rop2复合基因片段，亚克隆于大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3-p30-Rop2，并进行双酶切鉴定和测序分析。结果：成功构建pSTM3-p30-Rop2重组穿梭表达载体，测序结果发现有一个碱基发生突变，但没有改变开放阅读框。结论：pSTM3-p30—Rop2穿梭质粒的成功构建为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件。     

弓形虫MIC8基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫微线体MIC8的真核表达重组质粒。方法设计合成弓形虫MIC8引物,运用PCR方法扩增其基因片段克隆至真核表达质粒pCDNA3．1,从而构建重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8。结果PCR扩增弓形虫MIC8基因序列正确,构建的重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8经PCR、HindⅢ和XbaⅠ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒3-pCDNA3．1－MIC8,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

IL-2/pUC19重组质粒的构建

目的：构建IL－2／pU19重组质粒。方法：从PHA刺激的Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取IL－2基因；将克隆质粒pUC19和IL－2基因行BamHI和EcoRI双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得预期的IL－2条带，测序证实为正确的IL－2序列。结论：应用克隆质粒pUC19可方便高效地构建IL－2／pUC19重组质粒。     

TAZ基因重组质粒的构建与表达

目的构建重组质粒TAZ-pcDNA3.1及TAZ-pEGFP-C2,并应用Western Blot检测TAZ蛋白在细胞内的表达情况,初步探索TAZ分子促进细胞增殖和迁移的作用机制。方法通过PCR扩增获得TAZ基因片段,胶回收后连接T载体,蓝白斑筛选,转化,提质粒,酶切,用T4DNA Ligase连接,亚克隆进入pEGFP-C2和pcDNA3.1获得新的重组质粒,分别转染HEK293细胞,智能型荧光细胞监测仪观察TAZ分子在细胞内的分布情况,Western Blot检测其在细胞内的表达情况。结果重组质粒经双酶切鉴定和测序证明构建成功,荧光照片显示TAZ分子分布在细胞核和细胞浆中,Western Blot检测结果表明转染有重组质粒TAZ-pcDNA3.1的HEK293细胞中有大量TAZ蛋白表达。结论成功构建了两种重组质粒,并初步验证了TAZ蛋白的细胞定位,为进一步研究其促进增殖和迁移的作用机制奠定了基础。     

弓形虫重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定弓形虫1330-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M．s载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2，电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中，潮霉素筛选、PCR法鉴定阳性转化子，温度诱导表达鉴定。结果获得pSTM3-P30-ROP2重组穿梭表达载体，SDS—PAGE结果显示P30-ROP2复合基因表迭蛋白产物分子量约为66kDa。结论成功构建弓形虫复合抗原基因P30-ROP2重组耻垢分枝杆菌疫苗，为弓形虫病的防治提供了-种新方法。     

Construction of a recombinant plasmid harbouring the rhoptry protein 1 gene of Toxoplasma gondii and preliminary observations on DNA immunity

Objective To observe the immune responses elicited in BALB/c mice by a DNA vaccine. A ge ne encoding rhoptry protein 1 (ROP1) from Toxoplasma gondii (T. gondii) was cloned into vector pcDNA3.Methods Amplifyied gene fragments coding for ROP1 from the genomic DNA of T.gondii ZS2 were inserted into cloning vector, pUC18, and sub-cloned into pcDNA3. Mice wer e injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA by intramuscular inje ction and boosted after 2 weeks. pcDNA3 and normal saline were used as control . 30, 50 and 70 days after the second immunization, NK cell activity, T lympho cyte proliferation and sub-clusters and serum IgG antibody were assayed.Results The specific gene fragment coding for ROP1 was amplified and a pcROP1 recombinan t was constructed. At 30 days after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged evidently. NKC activity and the proliferation of spleen T ly mphocytes seen on MTT assay were higher in pcROP1 group than in the controls. T he number of CD4(+) T cells exhibited no obvious increase compared with that of the control, but CD8(+) T cells were obviously increased (P<0.05). At 90 d ays after vaccination, the titer of IgG antibody in the serum of vaccinated mice was positive (1∶100).Conclusion pcROP1 was constructed and it could elicit both cellular and humoral immune r esponses in immunized mice.     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。     

PEPCK启动子调控的报告基因表达质粒的构建

目的构建磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子调控的报告基因表达质粒,为评价PEPCK启动子对下游基因的转录调节创造条件.方法从载体质粒pPEPCK-int中截取大小为550 bp的大鼠PEPCK启动子片段,借助过渡载体质粒PBS-PEPCK,将PEPCK启动子片段插入pGL2-Basic-Luc报告质粒.结果通过酶切鉴定及基因测序,证明pGL2-PEPCK-Luc荧光素酶表达质粒构建成功,并能够在体外表达荧光素酶.结论 pGL2-PEPCK-Luc质粒可作为体外研究PEPCK启动子转录调节的新手段.     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的 利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析.方法 设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体.转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制效果.结果 酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用.COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%.结论 成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达.     

弓形虫致密颗粒蛋白的免疫反应性评价

目的对弓形虫的重组蛋白谷胱甘肽巯基转移酶致密颗粒蛋白(GSTGRA7)的免疫反应性进行评价。方法异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠埃希菌BL21(pGEX4T1/GRA7)表达,表达产物进行十二烷基硫酸钠(SDS)变性蛋白质电泳,分别以人抗弓形虫阳性血清和兔抗弓形虫阳性血清为一抗进行WesternBlotting分析。用GST亲和层析柱纯化重组蛋白,以此蛋白作为包被抗原,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果重组蛋白GSTGRA7能被兔抗弓形虫阳性血清、人抗弓形虫阳性血清所识别。该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫重组蛋白GSTGRA7具有良好的免疫反应性。