大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景:目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少.目的:采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点.方法:全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化.结果与结论:培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性.扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃.     

全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨的定向诱导及鉴定

背景:许多分离纯化骨髓间充质干细胞操作繁琐、费用昂贵,且对细胞的活性影响较大,许多研究都致力于寻找有效且价格低廉的培养鉴定方法。目的:采用全骨髓贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞经体外进行成骨诱导和分化,并进行细胞鉴定。设计:观察对比实验。单位:青岛大学医学院。材料:实验于2005-11/2007-03在青岛大学医学院口腔研究室及分子生物学实验室完成,选用20只生后三四周Wistar大鼠,SPF级,雌雄不拘,体质量120～150g,由青岛市实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司,碱性磷酸酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,逆转录试剂盒为PROMEGA产品,引物由上海生工公司合成。方法:采用全骨髓培养法分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后分瓶,以5×10~7L~(-1)的密度接种于6孔培养板,诱导分化组加入诱导分化培养液,对照组加入等量基础培养液培养。①倒置相差显微镜观察细胞诱导分化结果及钙结节形成情况。②采用钙结节Von Kossa染色、钙结节茜素红染色进行诱导后细胞的生物学特性检测。③采用重氮盐法染色观察碱性磷酸酶活性。④RT-PCR检测细胞内成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。主要观察指标:①细胞诱导分化结果。②大鼠骨髓间充质干细胞诱导后细胞的生物学特性。③碱性磷酸酶活性。④成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。结果:①诱导分化组加入诱导分化培养液后,9d后开始密集重叠生长,21～28d出现较多散在的致密圆形矿化结节。对照组细胞虽密集重叠生长,但不形成矿化结节。②诱导分化组成骨诱导21～28d形成明显的圆形或卵圆形肉眼可见的钙化结节。Von Kossa染色为黑色沉淀,茜素红染色为橙红色结节状,对照组未见钙结节形成。③诱导分化组诱导2周细胞碱性磷酸酶活性明显增高,对照组活性较弱。④诱导分化组经诱导后成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达均较强。结论:大鼠的骨髓间充质干细胞经全骨髓培养法体外诱导和分化,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多表明细胞功能活跃。     

抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景:成骨细胞来源于骨髓中的间质干细胞,但骨髓间充质干细胞经过高度扩增后,细胞群会出现生长速率减慢等变化,并出现没有分裂倾向的扁平状细胞.目的:进一步验证在一定诱导条件下,体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-03/10在南方医科大学解剖实验室完成.材料:4周龄SD大鼠3只.由南方医科大学实验动物中心提供.成骨诱导过程所使用的抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠为美国Sigma公司产品.方法:采用密度梯度离心+贴壁筛选法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,融合后用EDTA及胰蛋白酶消化,按1:3传代培养.取生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,调整细胞数量为1×107L-1,分为2组:对照组加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基,诱导组加入成骨诱导液进行培养,成骨诱导液为含50 mg/L抗坏血酸、0.1 μmmol/L地塞米松、0.5 mmol/L β-甘油磷酸钠、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生物学特性,成骨诱导前后细胞碱性磷酸酶活性,诱导后矿化结节的形成.结果:刚接种的骨髓间充质干细胞呈圆形;原代培养24 h后大部分细胞贴壁生长,呈短梭形、三角形、多边形;72 h时贴壁细胞分裂增殖,逐渐呈长梭形;至第5天可见明显细胞集落形成:第9～10天细胞达80%以上融合;传代后细胞贴壁和增殖速度加快.呈有规则的方向性排列.与诱导前比较,骨髓间充质干细胞成骨诱导7d后碱性磷酸酶活性明显提高(P<0.05).连续成骨诱导20 d后.诱导组可见多个散在分布的圆形不透明钙化结节,对照组未见矿化结节沉积.结论:在抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导下,大鼠骨髓间充质干细胞可定向分化为成骨细胞.     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,I型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,I型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

背景：细胞学研究表明,骨髓间充质干细胞在绝经后骨质疏松症的发病过程中起有重要作用。目的：观察去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨分化。方法：将6月龄雌性SD大鼠双侧卵巢切除建立骨质疏松模型。实验分为4组：正常干细胞组、骨质疏松干细胞组、正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组。全骨髓贴壁法培养正常和骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞至第3代细胞用于实验。倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞周期、增殖指数。加成骨诱导液进行成骨诱导,检测各组骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性,茜素红染色法比较各组钙结节的形成。结果与结论：正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组均具有成骨细胞的形态特征,但骨质疏松干细胞成骨诱导组形态变化相对缓慢。正常干细胞组细胞增殖指数高于骨质疏松干细胞组（P〈0．05）;成骨诱导组碱性磷酸酶活性均明显高于相应的正常或骨质疏松干细胞组（P〈0．05）;正常干细胞成骨诱导组明显高于骨质疏松干细胞成骨诱导组（P〈0．05）。成骨诱导组茜素红染色均呈阳性,相应的正常或骨质疏松干细胞组呈阴性;且正常干细胞成骨诱导组染色强于骨质疏松干细胞成骨诱导组。提示去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力和成骨分化能力明显降低,可能与去卵巢大鼠骨质疏松的发生相关。     

改良体外培养方法及诱导剂配比条件下骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞取材方便,易于体外扩增,其体外培养方法及诱导分化仍需要改良.目的:对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方法及诱导剂配比进行改良,观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能.设计:观察实验.单位:解放军广州军区广州总医院医学实验科.材料:实验于2004-07/2006-06在解放军广州军区总医院医学实验科干细胞组织工程实验室完成,选用20只成年SD大鼠,清洁级,雌雄不拘,体质量140～180 g,由解放军广州军区广州总医院动物实验中心提供.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.β-甘油磷酸纳,地塞米松,维生素C均为美国Sigma公司产品,羊抗大鼠骨钙素抗体购自美国DSL公司,S-P免疫组化试剂盒为福建迈新生物技术开发有限公司产品.方法:采用改良法进行细胞的培养及诱导细胞成骨.①骨髓间充质干细胞分离及培养:大鼠麻醉后处死分离双侧股骨、胫骨骨髓制备单细胞悬液接种于培养瓶中,培养后48及96 h半量更换培养液,以去除未贴壁的造血细胞,以后每3 d换液1次,进一步去除未贴壁的细胞,待细胞汇合约80%时,用0.25%胰蛋白酶消化,按1:2传代培养.将第2代骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板和玻璃平皿中,48 h后吸去基础培养液.②骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化:应用含终浓度分别为10 mmol/L、10-7 mol/L、50 mg/L的地塞米松、β-甘油磷酸纳和维生素C的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化.主要观察指标:①应用改良的培养方法及自行配比的培养液诱导分化后10 d采用钙钴法测定碱性磷酸酶活性.②培养后12 d采用免疫组织化学法检测骨钙素分泌情况.③诱导培养后2周采用Von kossa染色检测细胞矿化作用.结果:①碱性磷酸酶活性:经诱导后细胞碱性磷酸酶染色明显,胞质中刚性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀,碱性磷酸酶活性部位呈棕黑色.②骨钙素分泌情况:细胞经诱导后骨钙素阳性较明显,胞核呈蓝色,胞浆呈棕色.③细胞矿化作用:细胞经诱导培养后呈复层生长,并出现不透明结节,Von kossa染色可见黑色的矿化结节颗粒,颗粒大小不均一,提示有矿化基质沉积.结论:改良法可成功培养及诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨.     

不同传代倍数胎儿间充质干细胞的成骨分化能力观察

目的:观察不同传代倍数胎儿骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的能力,为骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用提供部分实验参数。方法:实验于2004-03/10在安阳市人民医院检验科和安阳肿瘤医院临床实验室完成。采用全髓直接接种法分离培养13～18周胎龄水囊引产新鲜胎儿股骨骨髓(获提供者知情同意标本用于此实验)。贴壁细胞达90%以上融合时消化传代。传代细胞部分以1×109L-1的细胞密度接种于含体积分数为0.1的胎牛血清的L-DMEM的培养基中继续培养,传代;部分在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松,β-甘油磷酸钠及抗坏血酸向成骨细胞诱导分化。如此连续传10代。倒置显微镜下观察细胞形态、细胞化学染色检测成熟成骨细胞的标志酶碱性磷酸酶的表达、全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶活性,鉴定不同代次培养细胞成骨分化能力。结果:①碱性磷酸酶染色阳性百分率:传代7代以内胎儿骨髓间充质干细胞成骨分化能力无显著差异,均在87.5%以上(P>0.05);以第3代最强达93.4%。第8代后逐渐减弱,为72.7%～51.3%。②碱性磷酸酶活性:传代7代以内无差异(P>0.05),以第3代最高,为(2307.1±15.0)nkat/L,第8代后逐渐降低,至第10代仅为(905.2±10.0)nkat/L。结论:不同代次的骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的能力不同,8代以后明显减弱。提示脱离了体内环境后,骨髓间充质干细胞逐渐老化。做为组织工程的种子细胞,骨髓间充质干细胞体外培养不宜超过7代。     

骨髓间充质干细胞定向诱导条件下向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化的关系

目的:观察骨髓间充质干细胞在定向诱导分化条件下向成骨细胞、脂肪细胞分化的特征及相互关系。方法:实验于2004-10/2005-04在泸州医学院心肌电细胞实验室完成。日本大耳兔10只,经兔髂嵴无菌抽取骨髓,采用Percoll液进行梯度离心法和体外细胞贴壁分离培养法相结合对兔骨髓间充质干细胞进行分离、纯化,将获得的原代和传代培养的骨髓间充质干细胞,分别用含成脂诱导剂和含成骨诱导剂的改良的伊格尔培养基进行实验组(向脂肪细胞和成骨细胞的定向诱导培养,对诱导培养后的细胞进行生长形态学特征观察)照组(采用不加成脂、成骨诱导剂的伊格尔培养基),两组,对进行成脂及成骨诱导后的苏丹脂肪染色、碱性磷酸酶活性检测、胞外矿化基质测定,并进行细胞成脂和成骨率比较。结果:从10只实验动物中均成功提取到骨髓间充质干细胞,其中有2只动物的骨髓间充质干细胞在原代培养时出现污染,8只获得成功进入结果分析。①在经过21d成脂诱导培养后实验组的许多细胞胞浆内均出现较多的高折光性的脂滴,苏丹脂肪染色呈橘红色,同时Kossa法也检测出少许成骨分化,其比例为70%(28/40)干细胞可转化为含有脂滴的脂肪细胞;10%(4/40)干细胞转化为含有钙结节的成骨细胞。②经过21d向成骨诱导培养后实验组出现一些细胞基质逐渐堆积、并出现基质矿盐沉积,VonKossa法测定形成的钙结节,同时苏丹脂肪染色也检测出少许向脂肪细胞分化,其比例为40%(16/40)细胞可转化为成骨细胞,20%干(8/40)骨髓间充质干细胞可转化为脂肪细胞。③对照组用苏丹脂肪染色后显示5%(2/40)骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞,用VonKossa法测定矿化结节形成比例和碱性磷酸酶活性测定结果成骨率10%(4/40)。结论:在适当诱导条件下骨髓间充质干细胞可一部分转化为脂肪细胞,另一部分转化为成骨细胞,两者分化存在一定关系:分化的脂肪细胞多,则成骨细胞少;分化的成骨细胞多,则脂肪细胞少。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景:骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论.目的:建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点.方法:采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养10 d,绘制细胞生长曲线.于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Von kossa染色.结果与结论:采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞.对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组(P<0.05).实验组细胞Von kossa染色为阳性,对照组为阴性.说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞.