非分型流感嗜血杆菌Haps蛋白表达量影响因素的探索

目的优化非分型流感嗜血杆菌HapS蛋白质片段表达与分泌量的条件。方法用BHI液体培养基培养非分型流感嗜血杆菌(NTHi),观察不同培养时间对NTHi培养液光吸收值的影响和HapS蛋白质片段分泌量的变化;NTHi在BHI培养液中培养18 h后,加入IPTG诱导不同时间,观察其对HapS蛋白质片段分泌量的影响。结果增加NTHi在BHI中的培养时间,培养液的光吸收值呈下降趋势,其培养上清提取的蛋白质样品经SDS-PAGE电泳没有显示出HapS蛋白质片段(110KD)的条带;加入IPTG诱导80min后,提取的蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后,显示出有明显的110KD的条带。结论增加培养时间不能增加NTHi的细菌总数和HapS蛋白质片段的表达与分泌量,而IPTG能诱导NTHi细菌hap基因的表达,明显增加HapS蛋白质片段的分泌量。     

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯化

目的：从猪肾中提取RNA,从中克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶（GNE）基因,并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达。方法：从猪肾中提取总RNA,通过RT-PCR克隆出GNE基因,经测序,感受态大肠杆菌E.coli DH5a转化,质粒抽提,鉴定以及大肠杆菌BL21（DE3）转化表达,通过His-tag亲和纯化（Ni Sepharose 6 Fast Flow）,G-25柱脱盐,SDS-PAGE电泳检测。结果：RNA提取物经紫外分光光度计检测OD260/OD280=1.77,说明无明显的蛋白质和酚污染。RT-PCR扩增目的片段,测序证明该基因的ORF为1 206 bp,编码402个氨基酸组成的酶蛋白（GNE）。SDS-PAGE显示,纯化蛋白为45 kD的单一条带,与基因序列推测值一致。结论：GNE基因已被成功地克隆和表达。     

蝎毒促增殖肽在大鼠骨髓间充质干细胞上靶蛋白的初步研究

目的研究蝎毒促增殖肽Bmkpp在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的靶点。方法采用Sepha-dex G-50凝胶层析和CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换层析从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化出蝎毒促增殖肽Bmkpp,RP-HPLC检测,酶解-质谱鉴定;提取大鼠BMSCs全蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白后上样到Bmkpp亲和层析柱,洗脱收集靶蛋白峰,超滤离心法脱盐浓缩;SDS-PAGE电泳分析洗脱蛋白。结果分离纯化出Bmkpp和其相邻的峰4,RP-HPLC检测分离纯化的Bmkpp纯度达95%。酶解质谱法鉴定其与Bmkpp标准品的主要成分一致。一步亲和层析洗脱峰均为2个,电泳结果显示胞浆洗脱蛋白条带较多,但细胞膜无结合蛋白条带。改变盐浓度分步梯度洗脱全蛋白共得4个峰,1 mol/L NaCl盐浓度分步洗脱全蛋白于13、14、40、260 kD处有4条较明显的电泳条带。结论 Bmkpp在BMSCs上作用于多个靶点并有其特异性的靶标。     

抗体Fc片段的离子交换法制备和印渍法鉴定

免疫球蛋白经羧甲基纤维素(CM22)柱交换,并用增加盐浓度分段洗脱,可分得4个蛋白峰。其中,用0.1M醋酸钠缓冲液洗脱出的3个蛋白峰具Fc性质,而用0.225M醋酸钠缓冲液洗脱的蛋白质不与葡萄球菌A蛋白(SPA)相结合。将具Fc性质的组分合并,由木瓜蛋白酶消化后,各蛋白质片段再经CM22柱分段洗脱,得到5个蛋白峰。分离出的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至滤膜上。膜上各蛋白质用SPA-HRP探针作酶分析,从而鉴定IgG的Fc片段。实验提示,0.225M醋酸钠缓冲液洗脱出的蛋白蜂是抗体Fc片段。     

大鼠损伤神经组织中Tropic 1808基因相关蛋白的亲和层析法纯化

目的：纯化大鼠损伤坐骨神经组织中Tropic 1808基因特异表达的蛋白。方法：将Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体与CNBr-activated Sepharose 4B交联，用亲和层析的方法，提取在大鼠损伤坐骨神经组织中Tropic1808基因特异表达的蛋白，并将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析。结果：(1)经层析系统紫外检测，新生层析后洗脱，在280nm波长处获得两个不同的紫外吸收峰。（2）亲和层析的洗脱液，经冷冻浓缩，SDS-PAGE分析，出现43.0kDa.320kDa,31.0kDa和14.4kDa蛋白条带，其中在32.0kDa的蛋白条带与预期的Tropic1808基因在组织中的编码蛋白基本相符，而43.0kDa.31.0kDa,14.4kDa蛋白，预测为Tropic1808基因在大鼠损伤坐骨神经组织中表达的相关蛋白。结论：用亲和层析的方法，获得了大鼠损伤坐骨神经组织中Tropic1808基因特异表达的相关蛋白，为进一步研究其结构和功能提供了实验依据。     

广西眼镜蛇毒中Natrin蛋白的分离及纯化

目的:从广西眼镜蛇毒中分离出Natrin蛋白.方法:广西眼镜蛇毒经SephadexG75凝胶、CM Sepharose CL-6B离子交换层析及FPLC mono-S柱层析分离纯化出Natrin蛋白.结果:从广西眼镜蛇蛇毒中分离纯化得到的Natrin蛋白,经SDS-PAGE电泳测定其分子量为25 ku,质谱测定其分子量...     

重组人类Tau蛋白的大量制备及鉴定

目的:重组人Tau蛋白的大量制备。方法:将携带人类全长Tau蛋白基因的质粒转入工程菌E.ColiBl21,经IPTG诱导表达后,通过差速离心、离子交换层析、凝胶过滤层析方法纯化Tau蛋白,以SDS-PAGE电泳和Western印迹法进行鉴定。结果:纯化Tau蛋白的得率约为43.3%。在SDS-PAGE上呈均一的蛋白条带,其相对分子质量约为60 000。结论:本实验以较高产量成功地纯化了重组Tau蛋白,纯化的蛋白质可以满足制备Tau抗体的需要,且其生物活性保存较好,可用于Tau蛋白生化特性的研究。     

膀胱癌T-24细胞系中细胞角蛋白20的分离纯化及鉴定

目的分离纯化细胞角蛋白20(Cytokeratin20,CK20)并加以鉴定,为进一步研制抗CK20单克隆抗体奠定基础。方法培养人膀胱肿瘤T-24细胞系并用免疫组化检测CK20表达,然后大量培养并收集细胞,超声波细胞粉碎后,先用萃取、高速离心、透析等方式进行蛋白初分离,然后利用以DE52为介质的阴离子交换层析分离纯化CK20蛋白,以电泳示踪,最后采用SDS-PAGE、HLPC和Western-blotting加以鉴定。结果在阴离子交换层析时出现3组洗脱峰,CK20主要存在第二组峰中,该峰在SDS-PAGE和Western—blotting上均呈现单一条带,HLPC分析显示CK20蛋白主峰呈正态分布,仅处一个较低峰度的蛋白质杂峰。结论该纯化方法简便、可行、效果好、获得的蛋白纯度高,提取的蛋白可确认为CK20并且具有较高的免疫生物活性。     

小鼠腹水中抗人食管癌单克隆抗体的纯化

研究目的从小鼠腹水中纯化抗人食管癌单克隆抗体。处理方法小鼠腹水通过羟基磷灰石柱层析后(层析环境温度15℃,起始缓冲液pH6.8,0.01MPB。流速1ml/min,线性梯度洗脱液500ml,0.1～0.5MPB)。由酶联免疫过滤法(EIF)鉴别出抗体活性部分。然后以SDS-PAGE鉴定所得抗体的分子量及其纯度(10％聚丙烯酰胺凝胶,电极缓冲液pH8.3,上样量约50/μg,电流3.5mA/管,考马斯亮兰R-250染色)。研究结果层析洗脱液经紫外监测A_(280nm)得出三个吸收峰;由EIF作抗体活性鉴定,确证第3个峰为活性部分;SDS-PAGE中于分子量约75KD及30KD处显示两个单一色带,相当于该单抗的重链和轻链。结论本法纯化所得抗人食管癌单克隆抗体纯度良好。     

蛋白质快速定量法及其在rhZP3纯化中的应用

目的建立层析过程中洗脱峰蛋白质含量的快速定量法.方法利用蛋白质的紫外吸收原理和层析软件的积分功能,即A280和峰面积计算层析过程中洗脱峰蛋白质含量.结果洗脱峰大小与蛋白质含量呈线性关系,洗脱峰蛋白质含量可用方程X＝Y/A进行估算,X为待测蛋白含量(mg),Y为洗脱峰面积(mAU×ml),A为1 g/L待测蛋白在层析系统的紫外吸收值(mAU).将其应用于重组人卵透明带ZP3蛋白(rhZP3)的纯化,用该方程估算的纯化蛋白含量与用Lowry法测定结果相似.结论该法简便、快速、重复性好,具有一定实用价值.     

石决明清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基活性的研究

目的：探讨石决明药效成分的抗氧化活性。方法：用CM-Sephadex C-25离子交换色谱（ion exchange chromatog-raphy,IEC）梯度层析分离石决明酸溶性提取物,得到各分离组分280 nm处光吸收曲线,SDS-PAGE方法分析各组分蛋白成分,最后测定了各组分的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH.）清除活性。结果：IEC梯度层析得到双峰洗脱曲线,具有较高OD280nm值的组分均显示出明显的SDS-PAGE蛋白电泳条带,DPPH.自由基清除能力实验结果表明,多个石决明IEC分离组分表现出良好的活性。结论：石决明除含有可能具有抗氧化活性的蛋白成分外,还存在可以清除DPPH.自由基的其他高活性物质。     

离子交换层析分离纯化重组人血清白蛋白

通过层析实验，比较了几种阴离子交换剂在不同温度、pH值、离子强度、进样流速、进样浓度下对人血清白蛋白的吸队与脱附性能，研究了它们对人血清白蛋白和卵清蛋白的分离能力，并考察了桩层析过程中吸附载体对重组人血清白蛋白和杂蛋白的分离选择性，实验结果表明：版号为DEAE Sepharose FF的载体不仅对重组人血清白蛋白具有良好的分离度，而且有较高的回收率。     

DIFFEKENTIAL CALCIUM－BINDING ABILITY OF FREE AND BOUND PROTEINS－SUGGESTIONOFAN0VELPROTEINS／C4B－BINDINGPKOTE

ＤＩＦＦＥＫＥＮＴＩＡＬＣＡＬＣＩＵＭ－ＢＩＮＤＩＮＧＡＢＩＬＩＴＹＯＦＦＲＥＥＡＮＤＢＯＵＮＤＰＲＯＴＥＩＮＳ－ＳＵＧＧＥＳＴＩＯＮＯＦＡＮ０ＶＥＬＰＲＯＴＥＩＮＳ／Ｃ４Ｂ－ＢＩＮＤＩＮＧＰＫＯＴＥＩＮ－ＢＩＮＤ－ＩＮＧＦＡＣＴＯＲＩＮＨＵＭＡＮＰ...     

快速蛋白液相色谱系统阴离子交换层析纯化人抗地高辛单链抗体

目的：将快速蛋白液相色谱系统（FPLC）与阴离子交换层析相结合，探索在大肠杆菌（E．coli）分泌表达的人抗地高辛（Dig）单链抗体（ADAscFv）的纯化条件。方法：①通过培养E．coli HB2151将人ADAscFv分泌表达至培养基中，离心制备培养基上清；②加入硫酸铵，收集其饱和度为0～50％的组分即为初步纯化的人ADAscFv；③将阴离子交换色谱柱与FPLC相连接后上样，分别采用含NaCl的Tris-HCl缓冲液进行线性浓度梯度洗脱及阶梯浓度梯度洗脱，紫外分光光度计自动检测洗脱峰；④通过ELISA及SDS-PAGE分别分析回收样品中人ADAscFv的抗原结合活性及纯度。结果：①2种洗脱方法均有6个洗脱峰；②ELISA显示，第2个洗脱峰回收样品中的抗原结合活性最高；③SDS-PAGE显示，第2个洗脱峰回收样品呈现与人ADAscFv分子量相符的单一条带。结论：该方法能有效地纯化在E.coli分泌表达的人ADAscFv。     

DETERMINATION OF MIDDLE MOLECULES IN UREMIC PATIENTS

For the past few years, we have been engaged in isolating and separating middle molecules (MMs) from biologic fluids of healthy persons and uremic patients. Plasma or serum, ultrafiltrate, and peri- toneal outflow dialysate from uremic patients, as well as plasma from healthy subjects, were fractionat- ed by gel chromatography. Plasma or serum was pretreated with a 40 x l cm Sephadex G 50 column or by CXA ultrafilter. Fractionation of MMs was performed on a 100 x I cm Sephadex G 15 column, eluted with NH.HCO:} buffer. UV absorbance was measured at 206 nm, 225 nm, or both. All samples could be separated into about 10 peaks according to elution volume. Peak 2 and peak 3, corresponding to the elution volumes for vitamin B12 and oxytocin, were significantly higher in uremic than healthy sera. These two peaks were regarded as the main fractions containing uremic MMs. MMs measurement was used to: a) evaluate the efficiency of various dialyzers and hemoperfusion, b) evaluate the efficacy of continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD) and hemodialysis (HD) in the removal of MMs, c) calculate the total quan tity of MMs removed by CAPD, intermittent peri- toneal dialysis and ultrafiltration, and d) assess the efficacy of reused dialyzers. Subfractionation of MMs by thin layer finger prints technic was carried out. Identification of the separated substances is in progress.     

聚乙二醇修饰海葵神经毒素rhk2a的分离与纯化

目的对聚乙二醇化海葵神经毒素（mPEG-rhk2a）修饰产物进行分离与纯化。方法将聚乙二醇（PEG）化反应所得混合产物超滤除盐后,采用SP-650S强阳离子交换层析柱和CM-650S弱阳离子交换层析柱进行分离纯化,收集不同NaCl离子浓度下的梯度洗脱液,经超滤除盐、冷冻干燥、SDS-PAGE电泳检测,确定分离纯化mPEG-rhk2a的色谱条件。结果在保证mPEG-rhk2a稳定性的前提下,随着缓冲液pH值的降低,2种阳离子交换柱与mPEG-rhk2a的结合量均增加;在同一pH值下,强阳离子交换柱的结合情况更好。用SP-650S强阳离子交换层析柱进行分离纯化时,洗脱液中溶液电导率在57 ms/cm时,mPEG-rhk2a能被洗脱下来,而且盐离子浓度梯度变化越缓,mPEG-rhk2a修饰产物各洗脱峰的分离度越高;用CM-650S弱阳离子交换层析柱进行分离纯化时,修饰产物mPEG-rhk2a主要在穿透峰中出现。结论使用SP-650S强阳离子交换层析柱,用pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液与含0.5 mol/LNaCl的pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液（后者比例变化为0%→50%）进行梯度洗脱,修饰产物mPEG-rhk2a与未修饰的rhk2a得到了很好的分离。     

远志中β-咔啉系生物碱的HPLC测定

利用HPLC定量测定远志样品中的β-咔啉系生物碱:降哈尔满、哈尔满、perlolyrine、1-甲氧羰基—咔啉、1-乙氧羰基—咔啉、N_9-甲酰基哈尔满及1-丁氧羰基-咔啉。     

FMU100抗体的超高效液相色谱法定量检测方法的建立

目的 建立UPLC-protein A定量检测FMU100单克隆抗体的方法.方法 使用Waters UPLC超高效液相色谱仪,Applied Biosystem的PA ImmunoDetection Sensor Cartridge(2.1×30 mm,20μm)色谱柱,柱温30℃,检测波长280 nm,进样体积10μL,以流动相A(10 mmol/L PBS含0.15 mmol/L NaCl,pH 7.2)-流动相B(0.15 mmol/L NaCl,pH 2.6)进行梯度洗脱,流速0.5 mL/min.结果 在0.034~2.200 mg/mL浓度,线性相关系数r2为0.9999,浓度与峰面积间呈良好的线性关系;检测限为0.01 mg/mL,定量限为0.07 mg/mL;回收率为98.18%~99.16%;重复性RSD为0.1%~1.9%;在8 h内,每个2 h测定发酵液中抗体的含量,FM U100抗体峰面积RSD为1.8%;在流动相A pH变化±0.2、流动相B NaCl比例变化±5%、柱温变化±5℃ 、检测波长变化±5 nm、流速相对值变化±20%时,FM U100抗体峰峰面积RSD为1.7%(n=12);检测方法符合系统适应性要求.