clock基因干扰质粒的构建及干扰效率测定

目的：构建clock基因的干扰质粒，为深入研究clock基因在信号转导通路中的作用提供有效手段。方法：采用M-folder生物软件选择2个clock基因干扰位点，并根据3个干扰片段及一个阴性对照片段，定向克隆到pGenesil-1干扰载体并测序验证。将干扰质粒及对照质粒分别转染至NIH3T3细胞，并通过检测RT-PCR产物量以获得干扰效率。结果：RT-PCR产物捡测结果显示干扰质粒pGenesil-1／clock-Ⅱ干扰效率最高，其clock表达量降低了74％，而pGenesil-1／clock-Ⅰ干扰组clock表达量只降低了2％。结论：成功构建了对clock基因具有显著干扰效率的pGenesil-1／clock-Ⅱ干扰质粒，为进一步研究clock基因的功能奠定了基础。     

HMGN2基因干扰质粒构建及干扰效率测定

目的：构建HMGN2基因的干扰质粒,为深入研究HMGN2基因在信号通路中的作用提供有效手段。方法：根据文献选择两个HMGN2基因的干扰位点,合成两个干扰片段定向克隆到psilencer-4．1的干扰载体并测序验证。将干扰质粒转染至A549细胞,并通过检测RT-PCR产物量以获得干扰效率。结果：RT—PCR产物检测结果显示干扰质粒psilencer-4．1-HMGN2—2干扰效率最高,其HMGN2表达量降低了70％左右。结论：成功构建了对HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer-4．1-HMGN2干扰质粒,为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。     

TIPE3 干扰质粒对SW480 结肠癌细胞生长的作用及相关机制探讨

目的:通过TIPE3 干扰质粒转染SW480 结肠癌细胞,验证干扰TIPE3 表达对SW480 结肠癌细胞生长的影响并探讨相关机制。方法:构建TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ 干扰质粒,通过脂质体转染法成功将干扰质粒导入SW480 细胞,通过RT-PCR、Western blot 检测重组质粒的干扰效率。应用CCK-8 方法检测SW480 细胞生存率。AnnexinV-FITC/ PI 流式细胞法检测细胞凋亡。使用Western blot 检测细胞增殖、凋亡相关分子的表达情况。结果:成功设计、构建和筛选具有生物活性且干扰效率最佳的TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ 干扰质粒。CCK-8 检测证实干扰SW480 结肠癌细胞TIPE3 表达可以抑制细胞生长。流式结果显示,TIPE3-shRNA3 干扰组的凋亡率为(27.99±1.087)%,显著高于正常细胞组(12.10±2.213)% 及转染空载质粒组(11.44±0.277 0)%。证实了降低TIPE3 表达可以增加SW480 对aDR5ScFv 所诱导的细胞凋亡敏感性。Western blot结果显示干扰TIPE3 表达可以活化caspase3 蛋白,降低p-AKT、p-PDK1、PCNA 等分子的表达。结论:干扰TIPE3 的表达对 SW480 结肠癌细胞具有促进凋亡,抑制增殖的作用。     

小鼠HMGN2干扰质粒psilence-cmv-4.1-HMGN2构建及体内干扰效果鉴定

目的:构建小鼠HMGN2干扰质粒psilence-cmv-4.1-HMGN2,以进一步明确HMGN2的生物学作用。方法:将HMGN2-shRNA片段退火后与小鼠psilence-cmv-4.1链接,饲养孕小鼠,尾静脉注射法导入shRNA表达质粒,提取8.5d胚胎RNA,用RT-PCR检测胎HMGN2的表达量进行鉴定。结果:测序结果显示psilence-cmv-4.1-HMGN2干扰质粒构建成功,RT-PCR结果显示HMGN2在8.5d胎儿表达较高广泛表达,且Psilencer-cmv-4.1-HMGN2尾静脉注射后有明显的抑制效果。结论:成功构建对8.5d胎鼠HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer-4.1-HMGN2干扰质粒,为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。     

BACE1基因RNA干扰质粒的构建及干扰效果的鉴定

目的构建BACE1基因干扰质粒,并研究其在neuro．2a细胞中的表达,为以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的质粒。方法选择人、小鼠和大鼠的BACE1基因共有序列为干扰靶点,设计3组连接有GFP的干扰质粒,将构建好的质粒转染nellro-2a细胞,通过RealtimeRT—PCR及Western—blotting的方法分别在RNA及蛋白质水平上检测BACE1的表达,以分析其干扰的效率。结果经酶切及测序证实,插入的DNA片段序列与设计序列完全一致。与空质粒对照组相比,3个干扰靶点对BACE1基因的表达均有不同程度的抑制作用。其中pYr-1．1-siBACE1在mRNA水平及蛋白质水平干扰效果均最好。结论成功构建了BACE1基因的干扰质粒pYr-1．1-siBACE1,并能有效抑制neuro．2a细胞内源性BACE1基因表达,为靶向BACE1基因的治疗提供了有力的工具。     

猪Toll样受体7基因人工miRNA表达质粒的构建与筛选

目的 构建猪Toll样受体7(TLR7)基因的人工miRNA (amiRNA)特异性表达载体,筛选有效amiRNA.方法 RT-PCR扩增猪TLR77基因的1984 ～2648 bp序列,构建融合表达载体pTLR7-EGFP.设计针对猪TLR7的5对amiRNA,构建重组干扰质粒pcDNA5-miRTLR7.将pcDNA5-miRTLR7和pTLR7-EGFP共转染NIH-3T3细胞,通过RT-PCR检测amiTLR7的表达,以荧光显微镜观察和流式细胞术分析干扰效率.结果 5个amiTLR7都成功表达,且均能沉默NIH-3T3细胞中TLR7基因的表达,抑制效率为36.99％到97.28％,其中amiTLR7-3效果最佳.结论 成功构建了针对猪TLR基因的amiRNA表达质粒,筛选出了沉默猪TLR7基因的最佳干扰序列.     

p100基因RNA干扰质粒载体的构建与鉴定

目的:构建p100基因RNA干扰质粒载体,并检测其对多巴胺能的MN9D细胞系中p100蛋白表达的抑制作用。方法:设计并合成2条针对小鼠p100基因的RNA干扰片段,退火后分别连入pSilencerTM3.1-H1质粒并分别命名为Sip100#1、Sip100#2,酶切和测序鉴定正确后,将以上重组质粒及阴性对照质粒分别转染MN9D细胞,运用Western Blot方法检测各组细胞胞浆内p100蛋白的表达水平。结果:(1)酶切和测序结果证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pSilencerTM3.1-H1质粒;(2)与对照组相比,转染MN9D细胞48 h后Sip100#1组及Sip100#2组p100蛋白的表达水平受到明显抑制,其中Sip100#1组下降58%,差异有统计学意义(P0.01)。结论:本研究成功构建出小鼠p100基因靶向RNAi质粒载体,并能有效抑制MN9D细胞内p100蛋白的表达,为进一步研究p100蛋白所在信号通路对多巴胺能神经细胞的作用提供了工具。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

TNFAIP8 与胃癌耐药关系的初步研究

目的:探讨TNFAIP8 与胃癌耐药性的关系。方法:选取47 例进行新辅助化疗患者手术前后的标本,免疫组化检测TNFAIP8 蛋白的表达;Western blot 检测胃癌细胞株SGC-7901 及其顺铂耐药细胞株SGC7901/ DDP 中TNFAIP8 蛋白表达差异,利用RNA 干扰技术降低顺铂耐药细胞株中TNFAIP8 的蛋白表达后,MTT 检测其对顺铂的敏感性有无变化。结果:TNFAIP8 在新辅助化疗前后的表达差异不大,在新辅助化疗无效组中的表达较有效组高(P<0.05);SGC7901/ DDP 细胞中TNFAIP8 蛋白的表达高于SGC7901 细胞,siRNA-TNFAIP8 质粒转染SGC7901/ DDP 细胞后蛋白表达显著下降,MTT 结果显示降低TNFAIP8 蛋白表达,细胞对顺铂的IC50 较SGC7901/ DDP 显著下降(P<0.05),敏感性提高。结论:TNFAIP8 参与了胃癌的化疗耐药性。     

大鼠TCR Vβ8.2基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建含大鼠TCR Vβ8．2基因的重组真核表达质粒，并检测其在体内外的表达。方法：以RT-PCR法分离Lewis大鼠脾淋巴细胞中的TCR Vβ8．2基因片段，插入到真核表达载体pTARGET中，构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ8．2，并转化E．coli JM109，经蓝白斑筛选阳性菌落，进行菌落PCR和测序鉴定。将重组质粒以肌注法免疫BALB／c小鼠，采集注射部位股四头肌处的肌肉，用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCRVB8．2基因在注射部位的转录和表达：通过脂质体介导，将再组质粒导入COS-7细胞中进行瞬时表达，用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达。结果：测序鉴定证实，TCR Vβ8．2基因已被正确插入到pTARGET载体中，并检测到在肌肉组织和COS-7细胞内重组蛋白的表达。结论：成功地构建重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ8．2，并在体内体外均可检测到其转录和表达，为进一步进行TCR VβDNA疫苗的研究奠定了基础。     

前梯度蛋白2干扰质粒的构建及其对鼻咽癌细胞生物学功能的影响

目的:构建前梯度蛋白2(AGR2)基因干扰重组质粒及建立AGR2基因沉默的鼻咽癌细胞及动物模型,检测AGR2对鼻咽癌细胞的生物学功能的影响。方法:首先以real-time PCR和Western blot验证AGR2在鼻咽癌细胞系5-8F和6-10B中的表达,以高表达AGR2的5-8F细胞作为干扰转染的目标细胞;设计及构建shRNA表达载体pSR-GFP/Neo-AGR2-shRNA,将其转染至5-8F鼻咽癌细胞系中,通过Transwell小室迁移及侵袭实验来检测其迁移和侵袭功能的变化。结果:与6-10B细胞比较,AGR2在5-8F中的表达显著上调(P0.05);干扰鼻咽癌细胞5-8F中的AGR2可使细胞迁移和侵袭功能明显减弱(P0.05),使其体外成瘤能力显著降低(P0.05)。结论:AGR2在鼻咽癌细胞系5-8F中明显高表达;pSR-GFP/Neo-AGR2-shRNA可成功干扰5-8F中AGR2的表达;AGR2可抑制5-8F细胞的迁移、侵袭及体内成瘤能力。     

RNA干扰EP—CAM基因表达对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：利用RNA干扰技术抑制人胆囊癌GBC-SD细胞中上皮细胞黏附分子（EP-CAM）基因的表达,探讨抑制EP-CAM基因后对GBC-SD细胞增殖、凋亡的影响.方法：构建靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒,转染GBC-SD细胞,用RT-PCR和Western Blot分别检测EP-CAM基因的mRNA及蛋白的表达情况,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果：靶向EP-CAM的miRNA重组质粒pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1构建成功,重组质粒能显著抑制靶基因EP-CAM的mRNA及蛋白表达.与对照组比较,干扰后的细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05）,但细胞增殖活性受到明显抑制（P＜0.05）.结论：靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒能有效抑制EP-CAM基因的表达,抑制GBC-SD细胞的增殖.     

shRNA抑制Nanog基因的表达对胃癌细胞SGC-7901分子生物学行为的影响

目的:利用RNA干扰技术构建并筛选出对Nanog基因有抑制作用的重组质粒pshRNA-Nanog,转染入胃癌细胞SGC-7901中,检测其对Nanog表达的影响及其对胃癌细胞SGC-7901的增殖、周期、凋亡以及迁移的影响。方法:构建出针对人Nanog基因构建出的干扰质粒pshRNA-Nanog,在脂质体的介导下将其转染胃癌细胞SGC-7901,通过荧光显微镜,RT-PCR和Western blot法检测其表达,筛选出抑制率最高的一组;将筛选出的转染效率最高的一组pshRNA-Nanog重组质粒转染胃癌细胞SGC-7901中,通过CCK-8检测其胃癌细胞SGC-7901增殖情况,流式细胞仪分析SGC-7901周期变化和凋亡情况,Transwell迁移实验验证Nanog对SGC-7901的迁移能力以及侵袭实验验证Nanog对SGC-7901侵袭能力的影响。结果:成功构建并筛选出了对胃癌细胞SGC-7901干扰效果最明显的一组重组质粒;细胞的增殖受到抑制,胃癌细胞侵袭能力及迁移能力减弱,细胞周期停滞在S期,细胞的凋亡明显增加。结论:Nanog基因与胃癌细胞的增殖能力、周期及凋亡、迁移和侵袭能力有密切的关系。     

AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

重组质粒pEGFP-ING4的构建及其对MCF-7细胞凋亡的影响

目的检测ING4(inhibitor of growth 4)对MCF-7细胞凋亡的影响。方法从人胎盘总RNA中克隆人ING4基因,构建其真核表达质粒pEGFP-ING4转染MCF-7细胞表达ING4后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;荧光定量RT-PCR检测ING4、NF-κB、caspase-3、IL-8、Bcl-2及Bax基因的表达。结果构建的重组质粒转染可见目的蛋白融合表达,与对照相比MCF-7细胞凋亡率增高;ING4、caspase-3及IL-8基因的表达上调,NF-κB与Bcl-2/Bax基因的表达下调。结论成功从人胎盘组织克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达;ING4在人MCF-7细胞中能引起凋亡相关基因的改变并促进MCF-7细胞的凋亡,这为进一步研究ING4的抗肿瘤机制奠定了基础。     

大鼠心肌素慢病毒RNA干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞分化的影响

目的: 构建大鼠心肌素(myocardin)慢病毒RNA干扰(RNAi)重组质粒,分析该RNAi质粒的干扰效果及其对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法: 设计并合成3对针对大鼠myocardin的shRNA片段,退火后将双链oligo-DNA克隆入慢病毒质粒载体pGCSIL- GFP获得重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd。以pEGFP-N1 / X124G表达载体构建含Flag标签的myocardin表达质粒pEGFP-N1- Myocd。将重组干扰质粒和过表达质粒共转染293T细胞,Western blotting分析Flag标签蛋白的表达,筛选出干扰效率最好的干扰质粒并大量扩增。干扰质粒转染大鼠主动脉VSMCs,RT-PCR和Western blotting检测myocardin及分化标志物SM22α的表达。结果: 成功构建大鼠myocardin的慢病毒干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd和过表达质粒pEGFP-N1-Myocd。上述2种质粒共转染293T细胞后,1号干扰质粒转染组Flag标签蛋白表达下降最显著。将1号质粒进行大包装,获得滴度为1×10¹² TU/L的慢病毒颗粒,该病毒转染VSMCs后,myocardin表达明显下调并伴随分化标志物SM22α表达的显著下降。结论: 成功构建大鼠myocardin慢病毒重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd;抑制基因myocardin表达后伴随VSMCs分化的表达下降,提示myocardin在VSMCs分化过程中的重要性。pGCSIL- GFP-shMyocd重组质粒的成功构建为后续研究特定病理条件下(如动脉粥样硬化)VSMCs表型转变的分子机制奠定了基础。     

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。     

雄激素受体基因慢病毒干扰载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的：构建敲减人雄激素受体（AR）基因的慢病毒质粒,转染Hep3B细胞使其表达目的蛋白并探索其对PTEN、p-AKT蛋白表达的影响。方法：设计合成3对针对AR基因特异性敲减的寡核苷酸片段,分别连接于重组慢病毒载体pLKO.1,构建3条AR干扰载体。利用验证正确的3个慢病毒载体转染293T细胞得到慢病毒上清液。采用RT-PCR和Western blot在5株肝癌细胞中挑选AR高表达的细胞系进行AR慢病毒上清液感染。RT-PCR和Western blot检测3条AR干扰质粒在Hep3B细胞内的表达及其对PTEN、p-AKT蛋白表达的作用。结果：测序鉴定证实3条AR慢病毒干扰载体构建成功,干扰Hep3B细胞后,RT-PCR和Western blot结果显示其中1条AR干扰后的mRNA和蛋白表达明显降低,细胞内PTEN蛋白表达升高,p-AKT表达降低。结论：成功构建3条AR干扰载体,其中1条干扰效率较高,能在Hep3B细胞中干扰AR的表达,感染细胞后上调抑癌基因PTEN的蛋白表达对p-AKT有抑制作用,提示AR和PTEN/AKT信号通路可能具有相关性。     

RNA干扰抑制MTA1基因对人乳腺癌细胞ERα表达及浸润能力的影响

目的 通过观察pGenesil-1肿瘤转移相关基因1(MTA1)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因的沉默效应,了解其对ERα表达及浸润能力的影响.方法 设计合成并构建重组质粒pGenesil-1MTA1,将该质粒分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞,荧光显微镜评估转染效率,RT-PCR检测MTA1和基质金属蛋白酶(MMP)-9 mRNA表达,免疫细胞化学检测ERα和MMP-9表达,Western blot检测ERα蛋白表达,用Boyden小室体外侵袭实验检测转染前后两株细胞侵袭力的变化.结果 成功构建重组质粒pGenesil-1MTA1,并成功转染入MDA-MB-231和MCF-7细胞(平均转染效率分别为82.5%和78.2%).两株细胞MTA1 mRNA表达均受到不同程度的抑制(分别为80.2%和58.7%).经干扰MTA1基因后MDA-MB-231细胞ERα蛋白表达得到逆转,呈阳性表达;MMP-9 mRNA表达下降;细胞体外侵袭力减弱(侵袭指数为27.2%±2.1%),与干扰前(76.3%±2.4%)相比差异有统计学意义(P＜0.05).而MCF-7细胞转染重组质粒并干扰MTA1基因后,ERα蛋白、MMP-9 mRNA表达和体外侵袭能力变化均无统计学意义(P＞0.05).结论 重组质粒pGenesil-1MTA1能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因表达,ERa在MDA-MB-231细胞得到逆转,表达阳性,其高侵袭能力减弱,使干扰肿瘤转移靶基因成为可能.     

hWAPL基因shRNA真核表达载体的构建及干扰效果的初步鉴定

目的:构建针对人半翼基因(hWAPL)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其转染效率.方法:根据hWAPL基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到带有卡那抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到CasKi细胞中,观察荧光表达,鉴定转染效率.RT-PCR检测结果表明,筛选到的短链hWAPL siRNA能有效抑制内源hWAPL的表达.结果:成功构建了表达shRNA的质粒及其阴性对照质粒,转染到CasKi细胞系中可以特异下调hWAPL mRNA表达,载体转染效率达50%以上.结论:RNAi能特异地下调CasKi细胞中hWAPL mRNA含量,抑制宫颈癌细胞恶性增殖,提示hWAPL可能成为宫颈癌基因治疗的一个新的靶点.