胸腺肽促进人脐静脉血管内皮细胞增殖及合成VEGF的初步研究

目的探讨胸腺肽(thymosinαl,Tα1)对促进人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical veinvessel endothelial cells,HUVECs)增殖的影响以及刺激血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的合成情况。方法体外培养HUVECs细胞系,采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)法测定HUVECs的增殖情况,以流式细胞仪检测细胞周期,Western blot检测VEGF在HUVECs的合成。结果浓度为2.5、5、10μg/ml的Tα1作用于HUVECs后,其对应的D(492)值、增殖率分别为(0.498±0.027)、(96.2±4.5)%,(0.737±0.018)、(182.0±5.8)%,(0.745±0.021)、(185.0±6.2)%与对照组比较,明显增高(P<0.01)。S期细胞增多。Western blot检测结果显示实验组VEGF条带灰度值/内参灰度值(0.29±0.01)与对照组(0.12±0.06)相比,显著上升(P<0.05)。结论Tα1能促进HUVECs的增殖及增强血管内皮细胞内VEGF的合成...     

碘对血管内皮细胞表达VEGF影响的研究

目的 研究碘对血管内皮细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法 在含有不同浓度碘离子(I-)环境中培养血管内皮细胞,使用Western-blot和RT-PCR法检测VEGF的表达情况.结果 不同浓度的I-作用于血管内皮细胞后,VEGF表达未出现上调(P>0.05).结论 碘不促进血管内皮细胞合成VEGF,碘促进血管内皮细胞增殖与VEGF上调无关.     

碘促进血管内皮细胞增殖作用与MEK1相关性及碘对血管内皮细胞表达VEGF影响的实验研究

目的研究碘促进血管内皮细胞(VEC)增殖的机制.方法(1)使用丝裂原活化蛋白激酶激酶1(MEK1)抑制剂作用与含有碘离子(I-)培养环境中的VEC,以CCK-8法检测细胞增殖情况;(2)在不同浓度环境中培养VEC,使用免疫印迹法和RT-PCR法检测血管内皮生长因子(VEGF)表达情况.结果MEK1抑制剂作用于含有I-培养环境中的VEC后,细胞相对增殖率低于KI组(P<0.01).不同浓度的I-作用于VEC后,VEGF表达未出现上调(P>0.05).结论碘促进血管内皮细胞增殖可能与MEK1激活有关,碘不促进VEC合成VEGF.     

川芎醇对血管内皮细胞增殖与损伤保护作用的研究

目的:研究川芎醇促血管内皮细胞增殖与对血管内皮细胞氧化损伤的保护作用。方法:用过氧化氢致人胎儿脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)损伤,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活数量。结果:川芎醇在浓度0.1～1.5mmol·L-1具有促进正常HUVECs增殖的作用,并且浓度依赖性地拮抗过氧化氢抑制血管内皮细胞的增殖,其活性较川芎嗪强。结论:川芎醇具有促血管内皮细胞增殖及保护血管内皮细胞损伤的作用。     

不同拉伸力加载培养对人血管内皮细胞增殖情况的影响和意义

目的 探讨外在不同强度机械拉伸力加载对体外培养人血管内皮细胞生长的影响和相关生长因子的表达情况,以及其在临床负压治疗中的指导意义.方法 对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞加载不同拉伸力干预,实验分6组,分别加载FX-5000T应力系统不同大小拉伸力(拉伸度分别为0、5%、10%、15%、20%、30%)后,利用CCK-8 法检测细胞增殖情况,qRT-PCR检测血管形成因子相关基因VEGF、Flk-1、Tie-2 表达水平,提取相关蛋白 WB检测Flk-1、Tie-2 蛋白表达水平.结果 各应力加载培养组细胞活性下降,且应力越高细胞活性越低;各应力组细胞内VEGF、Flk-1、Tie-2基因的表达呈不同程度下调趋势,且应力越高,VEGF、Flk-1、Tie-2的表达越低;各应力组细胞内Flk-1、Tie-2的蛋白表达呈下调趋势,且呈现一定的剂量依赖性,即应力越高,Flk-1、Tie-2的蛋白表达越低.结论 外在拉伸力对人血管内皮细胞生长增殖有一定影响,且长时间超生理范围的拉伸力对人血管内皮细胞的增殖有明显抑制作用.     

尼古丁对人RPE细胞及HUVEC的影响

目的探讨尼古丁对人视网膜色素上皮(RPE)细胞和血管内皮细胞(HUVECs)中血管内皮生长因子(VEGF)表达及形成新生血管能力的影响。方法 MTT法检测尼古丁对两种细胞增殖的影响;划痕及成管实验检测其对HUVECs迁移、成管的影响;RT-PCR和Western blotting法检测两种细胞经尼古丁处理后VEGF、PEDF mRNA及蛋白的表达。结果尼古丁促进HUVECs增殖、迁移、成管(P<0.05),但对ARPE-19细胞增殖无影响(P>0.05),且高浓度(100μmol/L)时抑制细胞增殖(P<0.01)。尼古丁以剂量和时间依赖方式促进两种细胞VEGF mRNA及蛋白的表达,抑制PEDF mRNA及蛋白的表达,上调VEGF/PEDF基因表达的比率(P<0.05)。结论尼古丁可上调ARPE-19细胞和HUVECs中VEGF/PEDF基因表达的比率,促进HUVECs增殖、迁移、成管。     

microRNA-126对VEGF介导血管生成的调控作用

目的 研究microRNA-126(miR-126)对血管内皮细胞生长发育的影响,探寻miR-126可能参与的血管生成过程.方法 常规培养脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs).构建miR-126过表达载体并转染HUVECs;实验分为:正常细胞组,空载慢病毒转染组,miR-126过表达慢病毒转染组(n=6);于转染第6天后用qRT-PCR检测内皮生长负性调节因子spred1、Pik3R2的mRNA表达水平,Westem blot检测spred1、Pik3 R2的蛋白表达水平.结果 转染第6天后,对qRT-PCR及Western blot检测结果进行分析,过表达组中spread1、Pik3R2的2(-△△Ct)值较其余两组低;过表达组中spred1/GAPDH和Pik3 R2/GAPDH值也均小于其余两组,差异具有统计学意义(P＜0.05).spred1、Pik3R2的mRNA表达水平明显下调,其蛋白表达水平也明显降低.结论 miR-126能促进VEGF的内皮细胞增殖及血管生成作用.     

VEGF121转染对诱导后血管内皮细胞增殖的影响

目的 探讨VEGF基因转染对VEGF诱导后血管内皮细胞生物学功能的影响,为组织工程血管构建提供血管内皮细胞的可能性.方法 应用VEGF体外诱导兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化成血管内皮细胞后,再通过脂质体介导的方法将pCDI/VEGF121转染分化后的血管内皮细胞,通过MTT及流式细胞仪检测转染前后细胞的增殖与凋亡能力.结果 诱导培养2周后兔骨髓基质细胞转化为血管内皮细胞,VEGF基因转染血管内皮细胞后表达VEGF蛋白,转染后细胞增殖能力增加,凋亡能力下降.结论 转染VEGF是促进VEGF诱导血管内皮细胞增殖的有效途径,可望为组织工程血管构建提供血管内皮细胞衬层,为人工血管内皮化开辟一种新的途径.     

抗VEGF抗体对骨肉瘤OS-732细胞血管生成及其肿瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的：探讨阻断血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)的血管生成作用对骨肉瘤OS-732细胞及血管内皮细胞增殖、凋亡的影响。方法：应用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,通过解剖显微镜血管计数,光镜HE染色,原位末端标记及PC-NA免疫组化检测观察VEGF抗体对骨肉瘤血管生成及肿瘤增殖,凋亡状态的影响。结果：VEGF抗体组肿瘤区血管数目及瘤细胞数显著低于PBS对照组,肿瘤细胞凋亡指数显著高于PBS对照组,增殖指数两组差异不明显,同时VEGF抗体组凋亡的微血管内皮细胞增多,增殖期微血管内皮细胞少见。结论：VEGF抗体能显著抑制骨肉瘤OS-732血管生成,抑制内皮细胞增殖,促进内皮细胞凋亡,可能是VEGF抗体发挥抗血管生成作用的途径之一,并可能通过抑制血管形成而促进肿瘤细胞凋亡,最终达到抑制瘤细胞生长的作用。     

重度子痫前期患者脐静脉血清中VEGF及sFlt-1的表达及其对内皮细胞损伤的影响

目的 探讨重度子痫前期患者脐静脉血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和可溶性血管内皮生长因子受体1(soluble fms-like tyrosine kinase receptor 1,sFlt-1)表达的特点,及其对内皮细胞损伤的影响.方法 采用ELISA试剂盒定量检测10例正常妊娠及10例重度子痫前期患者脐静脉血清中sFlt-1及VEGF的蛋白表达水平.分别将两组血清在体外干预人脐静脉内皮细胞株(EVC-304)生长,利用:①荧光标记的牛血清白蛋白检测内皮细胞的单层屏障功能;②MTT法检测内皮细胞的增殖能力;③硝酸还原酶法检测内皮细胞的一氧化氮合成能力;以评估两组血清对内皮细胞功能的影响.结果 ①与正常妊娠组相比,重度子痫前期组患者脐静脉血清中sFlt-1蛋白水平明显升高;而游离VEGF蛋白水平明显降低,两者呈负相关.②与正常妊娠组相比,重度子痫前期组脐静脉血清可使内皮细胞功能明显受损,包括:(1)通过单层内皮细胞的牛血清白蛋白浓度升高,即内皮细胞的单层屏障功能受损;(2)内皮细胞增殖能力明显被抑制;(3)培养液中NO浓度明显降低.③内皮细胞功能损伤程度与重度子痫前期组脐静脉血清中sFlt-1/VEGF水平成正相关.结论 子痫前期患者血清中sFlt-1和VEGF表达失衡,与子痫前期内皮细胞损伤密切相关,可能是参与子痫前期发生发展的重要机制之一.     

肝细胞生长因子促血管内皮细胞增殖及迁移的研究

目的:探讨重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移的影响及其促血管生成作用.方法:从脐静脉体外分离培养HUVEC,采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)观察rhHGF对HUVEC的增殖作用,倒置显微镜观察HUVEC的迁移,透射电镜观察超微结构的改变及流式细胞仪检测细胞周期的改变.结果:(1)rhHGF对培养的HU-VEC有显著的促增殖和迁移作用,且成浓度和时间依赖性.(2)rhHGF促使HUVEC细胞超微结构的改变,线粒体和粗面内质网增多,常染色质增多(3)细胞周期分布改变:S期、G2/M期细胞增多.结论:rhHGF能显著促进HUVEC的增殖和迁移,提示其可能具有促血管生成作用.     

人参三七组方对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子分泌及其受体2表达的影响

目的：探讨益气活血中药人参三七组方对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）及其受体2（vascular endothelialgrowth factor receptor-2,VEGFR-2）表达的影响。方法：体外培养HUVEC,分为高剂量人参三七组方（0.4 mg/mL）组、中剂量人参三七组方（0.2 mg/mL）组、低剂量人参三七组方（0.1 mg/mL）组,另设碱性成纤维细胞生长因子（bovine basic fibroblast growth factor,bFGF,320 U/mL）阳性对照组和只加培养液的空白对照组。酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中的VEGF含量,免疫细胞化学法检测VEGFR-2阳性细胞数及其光密度值,蛋白印迹法检测VEGFR-2蛋白的表达。结果：与空白对照组比较,高剂量人参三七组方组和bFGF组细胞上清液中VEGF含量增加（P〈0.05）,VEGFR-2阳性细胞数及光密度值增加,细胞中VEGFR-2蛋白表达增强。结论：促进HUVEC分泌VEGF和表达VEGFR-2可能是人参三七组方促血管生成的基础。     

可注射型富血小板纤维蛋白促进人脐静脉内皮细胞成血管能力的体外实验研究

目的 探究可注射型富血小板纤维蛋白(injectable platelet-rich fibrin, iPRF)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)成血管分化能力的影响。方法 CCK-8实验检测HUVECs增殖能力并筛选最佳浓度的可注射型富血小板纤维蛋白提取液(injectable platelet-rich fibrin extract, iPRFe);划痕实验和小管形成实验分别检测HUVECs迁移能力和成血管分化能力;实时定量PCR检测成血管相关基因的mRNA表达。结果 0.4 mg/mL浓度的iPRFe促进HUVECs增殖效果最佳;iPRFe对HUVECs迁移和小管形成有显著的促进作用,还能明显提高血管生成素(angiogenin, ANG)、C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4)、血小板衍生生长因子受体A(platelet-derived growth factor receptor A, PDGFRA)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达水平。结论 iPRF可以促进HUVECs增殖、迁移和成血管能力,有望成为用于牙髓再生的新材料。     

不同培养基对人脐静脉内皮细胞体外培养效果的影响

目的研究不同培养基对人脐静脉内皮细胞体外培养生长的影响,探讨内皮细胞的最佳体外扩增培养条件。方法取健康产妇分娩后脐带,用胶原酶Ⅰ消化后得脐静脉内皮细胞,进行原代培养,并用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,传代培养时则分别采用RPMI-1640培养基和EGM-2培养基,倒置显微镜观察两种培养条件下细胞的生长状态,同时利用流式细胞仪检测其生长周期,对比培养效果。结果 EGM-2组内皮细胞生长良好,2d后贴壁生长的细胞可达90%。EGM-2组S期细胞比例为(29.07±1.48)%,RPMI-1640培养基组S期细胞为(17.58±3.49)%,二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 EGM-2培养基更适合人脐静脉内皮细胞的体外传代扩增培养。     

骨髓单个核细胞培养上清促进内皮细胞增殖作用

目的：探讨体外培养骨髓细胞分泌促血管生长因子的能力及培养上清对内皮细胞增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法分离出大鼠骨髓单个核细胞进行体外培养,并连续收集4周培养上清。酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定上清中血管内皮细胞生长因子（VEGF）;以含有不同浓度上清的培养液培养人脐静脉内皮细胞,分析单个核细胞培养上清对内皮细胞增殖的影响。结果：加入单个核细胞培养上清各组MTT比色光密度值较对照组明显增加（P<0.05）。第1,2,3,4周骨髓单个核细胞体外培养上清中VEGF分别为（24.40±7.99,89.28±5.13,115.24±10.08,157.00±15.64）pg/ml。结论： 骨髓单个核细胞培养上清可促进体外培养的人脐静脉内皮细胞增殖,体外培养的骨髓单个核细胞可持续分泌VEGF。     

妊娠相关血清蛋白-A对内皮细胞生理功能的影响

目的：观察妊娠相关血清蛋白-A（PAPP-A）在体外对内皮细胞生理功能的影响。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞株(HUVEC),随机分为4组。分别给予不同浓度(0,50,100及200ng/mL)的PAPP-A刺激,于0,12,24和48 h收集上清液和细胞,用硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）的浓度,用免疫组织化学法测定内皮素-1（ET-1）的表达。结果：在不同的时间点,随着PAPP-A浓度的增加,上清液NO的浓度逐渐降低,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。随着PAPP-A浓度的增加,ET-1的表达呈浓度依赖性增加,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论：PAPP-A可能通过减少内皮细胞NO的分泌,上调ET-1的表达来影响内皮细胞的功能。     

高糖及晚期糖基化终末产物环境对血管内皮细胞血管样结构形成的影响

目的观察高浓度葡萄糖和晚期糖基化终末产物（AGEs）干预对体外培养血管内皮细胞的损伤后愈合、血管样结构形成能力和相关血管化调控因子表达的影响。方法根据培养液中添加不同浓度的葡萄糖和AGES-BSA,将体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分为高糖组（30mmol／LD-葡萄糖）、AGEs组（150mg／LAGE-BSA）、高糖＋AGEs组（30mmol／LD-葡萄糖＋150mg／LAGE-BSA）和正常组（5mmol／LD-葡萄糖）,另设甘露醇组（30mmol／L甘露醇）,电子细胞基质阻抗判断法（ECIS）测定HUVECs损伤模型增殖曲线,倒置显微镜下观察HUVECs在Matrigel基质中血管样结构的形成情况;ELISA法检测细胞培养上清液中血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-2（Ang-2）的表达,荧光显微镜下观察HUVECs中血管生成素受体Tie2的表达。结果ECIS法测定结果显示：各组HUVECs增殖曲线形态相似,反映愈合率的斜率无明显差别。倒置显微镜观察发现：高糖组、AGEs组和高糖＋AGEs组形成血管样结构的长度显著小于正常组（P〈0．05或P〈0．01）。ELISA检测结果显示：与正常组比较,高糖组、AGEs组和高糖＋AGEs组细胞培养上清液中Ang-2水平显著升高,VEGF水平显著降低（P〈0．05）。荧光显微镜观察发现：Tie-2受体在正常组HUVECs的细胞膜和细胞质中均有表达,在AGEs组的HUVECs中仅表达于细胞核中。结论在高糖和（或）AGEs环境下,血管内皮细胞血管样结构形成能力受到抑制,其机制可能与Ang-2表达上调、VEGF表达下调以及Tie-2受体在细胞内不同部位的差异性表达有关。     

川崎病合并冠脉损伤患儿血清抑制HUVECs增殖并诱导其凋亡

目的：观察川崎病（Kawasaki disease, KD）合并冠脉损伤患儿血清对脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）增殖及凋亡的影响,以进一步了解KD患儿血管内皮细胞损伤的机制。方法：HUVECs分为正常血清组（Control组）、发热血清组（F组）、KD无冠脉损伤组（Non-CALs组）和KD合并冠脉损伤组（CALs组）。MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞术（flow cytometry, FCM）分析各组HUVECs的凋亡情况。结果：MTT比色结果显示,Non-CALs组和CALs组经血清干预后的细胞活性低于F组和Control组,且CALs组低于Non-CALs组,差异有统计学意义（P<0.01）。此外经KD患儿血清作用后,HUVECs的凋亡率增加,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）,且CALs组凋亡率高于Non-CALs组。结论：KD合并冠脉损伤患儿血清具有抑制HUVECs增殖并诱导HUVECs凋亡的作用。     

高渗液对缺氧／复氧人脐静脉内皮细胞内游离钙离子浓度的影响

目的：观察高渗液（HS）对缺氧／复氧的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）内游离钙离子浓度（［Ca²⁺］i）的影响,阐明高渗液治疗休克时对血管内皮细胞的保护机制。方法：体外分离和培养的HUVECs分为对照组和实验组,采用荧光探针技术,应用激光共聚焦显微镜,测定细胞内［Ca²⁺］i的变化,两组细胞先置于缺氧（95％氮气,5％CO₂）环境中8 h,然后将实验组细胞置于配制好的HS中15 min,再在常氧状态下（95％空气,5％CO₂）培养16 h。对照组细胞加对照液（M199培养液）15 min后同实验组。两组细胞分别于缺氧前（T₀）、缺氧后（T₁）、处理后（T₂）、复氧后1/2、2、8、16 h（T_3~6）测定细胞内Fluo-3荧光强度。结果：两组细胞荧光强度T₁与T₀比较显著升高（P<0.05）;实验组细胞荧光强度T₂低于实验组T₁及对照组T₂（P<0.05）,但仍高于T₀（P<0.05）,且复氧过程中逐渐降低,至T₅恢复到T₀水平;两组细胞T3时点荧光强度均高于各T₂时点（P<0.05）;实验组复氧过程中不同时点（T_3~6）荧光强度低于各自同一时间点的对照组（P<0.05）。结论：缺氧／复氧可以引发HUVECs内［Ca²⁺］i升高,而HS能减轻HUVECs内的钙超载,保护缺氧／复氧损伤的内皮细胞。