铜绿假单胞菌外毒素A表达载体的构建及可溶性表达

目的 实现铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因的可溶性表达。方法 用基因重组技术构建pMAL-PEA原核分泌型表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,然后利用直链淀粉树脂对表达蛋白进行亲和层析纯化。结果 酶切鉴定及测序结果表明pMAL-P2X载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的20％。表达产物经超声处理后,80％的融合蛋白存在于上清液中,说明实现了PEA的可溶性表达。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳,显示为一条蛋白带,分子量约为112kD。结论成功地对PEA全基因进行了可溶性表达和纯化,获得了稳定表达的工程菌,为深入研究：PEA的致病机制和制备用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。     

铜绿假单胞菌外毒素A基因的克隆与原核表达

为建立铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(Exotoxin A,ETA)的原核表达方法,采用PCR技术扩eta基因,将其插入pET-28a载体构建重组质粒pET-28a-eta,并对重组质粒进行双酶切、PCR及测序鉴定。转入BL21(DE3)中诱导表达,检测目的蛋白大小及反应原性,然后进行表达条件的优化及其表达形式检测。结果表明,所扩增eta基因大小为1917 bp,与GeneBank参比序列一致性在98.70%;蛋白分析表明,rETA大小为74 KDa,具有和天然毒素相似的反应原性。目的基因在37℃、0.6 mmol/LIPTG诱导3 h获得最佳表达。该蛋白在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但主要以包涵体为主。该研究为进一步开展ETA的批量纯化提供了前提条件。     

铜绿假单胞菌的分布及耐药性比较观察

目的:分析铜绿假单胞菌在临床感染中的分布及耐药性,为临床合理选用抗生素和控制院内感染提供依据。方法:按常规方法对临床各种标本进行细菌培养、分离、鉴定;结果按临床实验室标准化研究进行分析。结果:从痰标本中分离的铜绿假单胞菌菌株最多,占70.4%;药敏结果显示铜绿假单胞菌对18种抗生素耐药率在55.3%～100%。结论:铜绿假单胞菌已成为医院感染的主要致病菌,应不断为临床提供最新的耐药性资料,以更好地控制铜绿假单胞菌感染。     

铜绿假单胞菌临床分离与耐药性监测

目的了解住院病人铜绿假单胞菌耐药性与耐药趋势。方法分析我院2004年1月-2006年12月住院病人所分离的该菌，并监测抗菌药物的耐药性变化。结果3年分离出37株铜绿假单胞菌，该菌在临床各病区分布情况：重症监护室（ICU）32，4％（12／37）、感染科（呼吸科）18．9％（7／37）、骨科16．2％（6／37）、普外科16，2％（6／37）、内一科（神经、消化、血液、肿瘤、综合科）10．8％（4／37）、其他科5．4％（2／37）。其中痰标本51．4％（19／37）、咽拭子21．6％（8／37）、分泌物16．2％（6／37）、血液5．4％（2／37）、其他5．4％（2／37）。该菌对抗菌药物活性较好的是庆大霉素、氧氟沙星、阿米卡星、哌拉西林／他唑巴坦，耐药率分别为2．7％、16．2％、32，4％、32．4％。耐药率较高的是头孢他啶、头孢噻肟、哌拉西林，分别为56．8％、51．4％、51，4％。结论我院住院病人该菌监测结果显示对喹诺酮类、氨基糖甙类、β-内酰胺酶抑制荆复合药物保持较好的敏感性，8-内酰胺酶类头孢抗生素耐药性呈升高趋势，需加强对铜绿假单胞菌耐药率的连续监测。     

空军总医院铜绿假单胞菌感染及耐药性分析

目的 了解2006年1月～2007年12月医院铜绿假单胞菌感染分布及对不同抗生紊药物的耐药情况,以指导临床合理用药.方法 使用法国梅里埃公司的VITEK 2细菌鉴定仪,以K-B法分离菌株进行药物敏感实验.分析软件使用WHONET 5.4.结果 2007年与2006年比较铜绿假单胞菌感染无增加趋势,但耐药率普遍增高,耐药率低的抗生素依次为头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、阿米卡星、美罗培南、亚胺堵南、哌拉西林.结论 铜绿假单胞菌仍是我院主要致病菌,极易耐药,应严格控制院内感染的发生.     

ICU铜绿假单胞菌耐药性分析

目的:研究ICU铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率及对其他抗菌药物的耐药率,为临床选择合适抗生素提供依据.方法:收集2006-01～2008-12本院细菌室分离的铜绿假单胞菌,采用琼脂扩散法作敏感试验.结果:2006年分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率为20%,2007年为32%,2008年为42.5%.痰标本分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌最多见 ,占68.7%, ICU分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌最多见,占68.2%.结论:ICU铜绿假单胞菌对碳青霉烯类的耐药率逐年增加,并对多种抗菌药耐药,应引起高度重视.     

不同科室铜绿假单胞菌耐药情况分析

目的了解部分临床科室铜绿假单胞菌分布和对抗菌药物耐药性变化趋势。方法采用VITEK自动微生物分析系统或K-B琼脂扩散法,对分离出的554株铜绿假单胞菌进行药敏试验。结果2001年1月-2003年12月部分临床科室分离出的铜绿假单胞菌占阳性标本44．7％～57．2％。在常用15种抗菌药物中,铜绿假单胞菌耐药率大于60％占53．3％;其中对阿莫西林／克拉维酸钾,头孢曲松钠,氨苄西林／舒巴坦,头孢噻肟钠耐药率分别是93．9％、86．2％、85．7％、78．5％。在部分科室中,铜绿假单胞菌株耐药率低的药物是阿米卡星、头孢哌酮钠／舒巴坦、头孢吡肟、亚胺培南一西拉司丁钠。在分离出的554株铜绿假单胞菌株中,397株对5种以上抗菌药物出现耐药,占分离菌株的71．7％。结论掌握临床各科室铜绿假单胞菌的耐药变迁情况,为临床合理用药提供依据。     

铜绿假单胞菌院内感染的耐药性分析

目的了解铜绿假单胞茵的医院感染现状及其耐药性变化,为临床防治提供依据。方法分析2008～2011年铜绿假单胞菌医院感染病例;统计分2008～2011年铜绿假单胞茵的耐药性变化。结果铜绿假单胞茵感染主要发生在重症监护病房（24．9％）和呼吸内科（17．0％）;感染部位主要是呼吸系统（76．9％）和创口（16．0％）,亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和头孢他啶连续4年耐药率均〈14％。结论危重患者是铜绿假单胞茵感染的易感人群;加强耐药性监测,合理应用抗茵药物十分重要。     

医院铜绿假单胞菌感染分布与耐药性分析

目的 了解医院铜绿假单胞菌（PAE）的感染分布及其耐药性,为临床治疗提供依据.方法 回顾性分析本院2002～2008年间413株PAE的标本来源、感染科室分布及耐药状况.结果 413株PAE中,270株来自痰、咽拭子及支气管灌洗液（65.38%）,67株来源于创口分泌物（16.22%）,35株来自胸腹水（8.47%） 普通外科占26.88%,神经外科占21.07%,呼吸科占19.61%,干部病房占16.71%.药敏结果显示,PAE对亚胺培南和丁胺卡那霉素的耐药率最低,但亚胺培南的耐药率有上升趋势,由2002年的5.69%上升到2008年的21.22%.结论 本院PAE临床分离株多来自于痰、咽拭子及支气管灌洗液标本,以普通外科、神经外科、呼吸科和干部病房多见 PAE对多种抗菌药物的耐药率较高,多重耐药性明显.临床应加强对PAE耐药性的监控,防止耐药菌株的传播流行.     

铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL的纯化表达及活性评价

目的 构建铜绿假单胞菌凝集素PA-ⅠL基因的重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并评价其生物学活性.方法 以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板设计引物,构建pET-28a (+)-PA-ⅠL重组表达质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达,用Ni 亲和层析法对目的蛋白进行纯化.流式细胞术评价重组表达的PA-ⅠL蛋白对细胞表面Gb3/CD77的结合活性,菌落平板计数法评价重组蛋白在细菌黏附宿主细胞过程中的功能.结果与结论 SDS-PAGE电泳显示,纯化后的PA-ⅠL蛋白具有较高的纯度,重组表达的PA-ⅠL蛋白能与细胞表面的糖鞘脂Gb3/CD77结合,且呈浓度依赖性抑制PA的PAO1对宿主细胞的黏附.     

人血管生成素-1原核表达载体的构建与表达

目的　构建人血管生成素 - 1的原核表达载体 ,并进行表达。方法　利用PCR技术扩出人血管生成素 - 1基因片段 ,并克隆到PQE - 31载体中 ,转化E .coliM 15菌株后进行诱导表达。结果　构建了PQE31Ang - 1原核表达载体 ,在M 15中进行了高效表达。结论　通过原核表达得到人血管生成素 - 1蛋白 ,其具有良好的抗原性 ,为进一步的生物活性和应用研究奠定了基础     

2014年－2015年沈阳市康平县桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染监测分析

目的：分析桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染监测结果,为保证桶装饮用水的水质安全提供科学管理依据。方法随机抽取2014年～2015年沈阳市康平县200份桶装饮用水,其中120份为饮用纯净水,45份为饮用矿物质水,35份为饮用天然矿泉水,对200份桶装饮用水的资料进行分析,结合处理方式的不同将其分为两组,一组（88份）为经过饮水机处理,另一组（112份）为未经过饮水机处理。按照国家相关标准对200份桶装饮用水中的铜绿假单胞菌进行检测。观察分析200份桶装饮用水中铜绿假单胞菌的检测结果。结果对200份桶装饮用水进行铜绿假单胞菌检测发现,总共有60份（30.00％）检出铜绿假单胞菌,其中饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率为23.33％,饮用矿物质水铜绿假单胞菌的检出率为57.78％,饮用天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率为17.14％;200份桶装饮用水中细菌总数的不合格率为39.50％,大肠菌群的不合格率为14.50％,将铜绿假单胞菌的检出率和细菌总数的不合格率进行统计分析可知,组间无差异,P＞0.05;将铜绿假单胞菌的检出率和大肠菌群的不合格率进行统计分析可知,组间存在差异,P＜0.05;同时研究发现,经过饮水机处理的桶装饮用水铜绿假单胞菌检出率为45.45％,显著高于未经过饮水机处理的桶装饮用水（17.86％）,组间比较结果存在差异, P＜0.05。结论2014年－2015年沈阳市康平县桶装饮用水中存在铜绿假单胞菌污染现象,为保证水质安全以及保障消费者的生命健康,相关部门应加强对桶装饮用水水质的监督管理。     

IL-1Ra和IL-10真核表达质粒载体的构建及其表达检测

目的:构建人IL-1Ra和人IL-10真核表达质粒载体并检测其表达。方法:用双酶切方法切取PCDI-IL-1Ra和PCDI-IL-10质粒中包含人IL-1Ra和人IL-10 CDS全长序列的cD-NA片段,并分别连接到真核表达质粒pcDNA3.1上,然后用壳聚糖转染上述质粒到原代软骨细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达。结果:成功将人IL-1Ra和IL-10 CDS全长序列的cDNA片段克隆到真核表达载体,mRNA水平检测到目的基因的表达明显提高。结论:真核表达质粒可以用于外源基因的原代软骨细胞导入和表达,为进一步的基因治疗研究提供依据。     

马疱疹病毒1型ORF30基因原核表达载体的构建

马疱疹病毒1型(Equid herpesvirus 1,EHV-1)是引起孕马流产的主要病原体之一,也与死胎、新生幼驹死亡、青年马鼻肺炎以及一种名为马疱疹病毒性脑脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy,EHM)的神经系统疾病有关。近些年来,EHM出现的频率越来越高,对养马业和赛马业的危害很大。最新研究结果显示,神经致病性毒株与编码病毒DNA聚合酶催化亚基的ORF30基因单核苷酸点突变有着很高的相关性。为了获得马疱疹病毒1型DNA聚合酶,并制备DNA聚合酶的多克隆抗体,本研究以EHV-1-XJ2015毒株基因组DNA为模板,扩增ORF30基因编码区,并连接于pMD19-T载体上,用BamHI和HindIII双酶切后,将酶切产物插入表达pET-28a(+)中,转化入大肠杆菌DH5感受态细胞,构建ORF30基因的原核表达载体pET-28a(+)-ORF30。通过酶切、PCR扩增和测序等方法对阳性重组质粒进行了鉴定。结果表明,构建的重组质粒pET-28a(+)-ORF30经BamhⅠ和HindⅢ双酶切后,经1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果与预期相符,表明目的片段成功插入载体pET28a(+)中。通过采用特异性引物对重组质粒pET28a(+)-ORF30进行PCR鉴定,产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察,得到一条大小约1074bp的清晰条带,与目的基因大小相符,表明重组质粒pET28a(+)-ORF30构建成功。本研究为进一步探讨马疱疹病毒1型ORF30基因遗传变异对DNA聚合酶功能的影响奠定了基础。     

我院铜绿假单胞菌临床分布及耐药性的变迁

目的探讨近三年四川遂宁地区铜绿假单胞菌的临床分布及耐药谱的变迁,为临床合理选用抗菌药物提供依据。方法应用ATB细菌鉴定药敏系统鉴定细菌,K-B法做体外药敏试验,统计分析四川省遂宁市中心医院2008年1月～2011年1月三年间铜绿假单胞菌的检出率,各科室的分布状况和耐药情况。结果456株铜绿单胞菌分布最多的是重症监护病房（ICU）和呼吸科（两者共占62.7%）,来自痰标本有276株占62.1%。3年来的分离率有逐年增加的趋势。对抗生素的耐药性也有逐年上升的趋势,结论铜绿假单胞菌是临床感染的主要病原菌之一,应对其加强耐药性监测,合理使用抗菌药物。     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

小鼠感染铜绿假单胞菌后肺组织后TLR2和TLR4基因表达的变化及意义

目的：通过建立小鼠铜绿假单胞菌感染的模型,探讨小鼠感染肺炎衣原体后肺脏组织Toll样受体2和4mRNA表达变化及意义。方法：BALB/c雄性小鼠48只,随机分为实验组和对照组,实验组气管内接种铜绿假单胞菌,对照组接种无菌生理盐水,再分别按预定的处死时间1、3、5、和7 d,取肺脏组织,应用RT-PCR检测肺组织TLR2和TLR4的mRNA表达变化。结果：小鼠感染铜绿假单胞菌后,引起TLR2和TLR4 mRNA表达明显变化。结论：肺铜绿假单胞菌感染与TLR表达的变化密切相关,TLR mRNA的变化增强了机体非特异免疫能力,并随着铜绿假单胞菌感染程度的加重与减轻TLR2和TLR4的mRNA的表达变化上调或下降。     

重构型人caspase-8基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体，转染大肠杆菌并诱导其表达。方法：将人caspase—8催化结构域基因及两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase—8基因克隆人原核表达载体pBV220，转染大肠杆菌并诱导表达。结果：成功构建了三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体。转染大肠杆菌后，经温度诱导，重构型人caspase—8基因获得了高效的表达。结论：在大肠杆菌中成功表达了三种重构型人caspase—8基因。