福建省人感染HSN1禽流感病毒血凝素基因测定和分析

目的了解我省人感染高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因的特点以及和其他毒株序列间的关系。方法从采集自两例福建省感染者的标本中扩增H5N1禽流感病毒血凝素基因并作序列测定，获得的序列同其他H5N1禽流感病毒的血凝素基因进行比较并作进化分析。结果获得福建省的两例感染者中的H5N1禽流感病毒血凝素基因，并推导出该基因的氨基酸序列。结果表明，两株病毒的血凝素基因在蛋白酶水解位点均含有多个连续的碱性氨基酸，符合高致病性禽流感病毒的特征。经Blast程序检索发现，我省两例感染者与国内其他省份的感染者携带的病毒血凝素基因具有很高的相似性，提示国内的H5N1禽流感病毒感染者的病毒来源可能有一定的关系。结论通过对两例福建省感染者标本中的H5N1禽流感病毒血凝素基因进行序列测定，了解病毒基因的部分特点。通过序列比较分析为分子流行病学调查提供线索，但还需对其他基因序列以及病毒的致病性等生物学特征作进一步分析。     

福建省人感染H5N1禽流感病毒血凝素基因测定和分析

目的了解我省人感染高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因的特点以及和其他毒株序列间的关系。方法从采集自两例福建省感染者的标本中扩增H5N1禽流感病毒血凝素基因并作序列测定,获得的序列同其他H5N1禽流感病毒的血凝素基因进行比较并作进化分析。结果获得福建省的两例感染者中的H5N1禽流感病毒血凝素基因,并推导出该基因的氨基酸序列。结果表明,两株病毒的血凝素基因在蛋白酶水解位点均含有多个连续的碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒的特征。经Blast程序检索发现,我省两例感染者与国内其他省份的感染者携带的病毒血凝素基因具有很高的相似性,提示国内的H5N1禽流感病毒感染者的病毒来源可能有一定的关系。结论通过对两例福建省感染者标本中的H5N1禽流感病毒血凝素基因进行序列测定,了解病毒基因的部分特点。通过序列比较分析为分子流行病学调查提供线索,但还需对其他基因序列以及病毒的致病性等生物学特征作进一步分析。     

福建省人感染H5N6禽流感病毒与外环境禽流感病毒相关性分析

目的 分析福建省外环境H5亚型禽流感病毒分布情况及与人感染H5N6禽流感的关系,为人感染禽流感的科学防治提供依据。方法 收集2013-2017年福建省外环境常规监测标本信息,进行统计分析。从数据库下载相关禽流感病毒基因序列,进行基因同源性比对和系统进化分析。结果 外环境监测结果统计分析显示:2013-2017年共采集样本4 903份,H5亚型阳性率为4.24%,且不同的网络实验室(χ²=101.033)、监测场所(χ²=45.526)、标本类型(χ²=31.751)和季节(χ²=48.174)阳性率均存在统计学差异(P<0.05)。福建省首例人感染H5N6禽流感(A/Fujian-Sanyuan/21099/2017)病毒全基因序列与6株福建省外环境H5N6病毒的同源性在85.1%~98.5%,与病家院中采集的1株加强监测外环境标本的HA和NA基因同源性分别为100.0%和99.9%。系统进化分析显示:福建省人感染H5N6病毒HA基因与加强监测的外环境H5N6病毒的进化距离最近,与其余6株距离较远,处在不同的进化分枝中,其基因源于H5N8病毒;而NA基因则与7株外环境H5N6病毒的进化距离较近,源于H5N6病毒。结论 福建省冬春季外环境中禽流感活动较为活跃,应加强活禽交易市场的卫生管理工作。福建省发现的首例人感染H5N6禽流感与外环境禽流感病毒的重配可能存在一定的相关性。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达

目的构建大肠杆菌表达载体pET-NS1和昆虫杆状病毒转移载体pFast-NS1,将H5N1亚型禽流感病毒NS1基因分别在大肠杆菌和昆虫细胞中进行表达,表达产物用Western blot进行检测分析。方法酶切含有NS1基因的质粒pUC-NS1,分别克隆进大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和杆状病毒转移载体pFastBac HT A中,分别获得表达载体pET-NS1和pFast-NS1。将pET-NS1转化大肠杆菌BL21,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达;将pFast-NS1转化DH10Bac感受态细胞,提取重组Bac-NS1DNA,以M13为通用引物作PCR鉴定,阳性Bac-NS1用脂质体转染sf9细胞,72h后收集感染细胞。大肠杆菌表达产物和细胞表达产物分别裂解后作SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功构建了大肠杆菌表达载体pET-NS1和昆虫杆状病毒转移载体pFast-NS1,大肠杆菌和昆虫细胞中表达的融合蛋白Western blot都能检测到特异性条带。结论NS1基因在大肠杆菌和昆虫细胞中得到成功表达,为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备奠定了基础。     

2014年长沙市禽类场所环境H9N2亚型禽流感病毒分子流行特征分析

目的 了解2014年长沙市禽类场所环境中H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素(Hemag-glutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)和非结构蛋白(ron-structural,NS)基因的分子进化特征,为人感染H9N2亚型AIV防控提供实验室科学证据支持.方法 对2014年长沙市禽类场所中采集的501份环境标本(禽类饮水263份,污水221份,其他标本17份)利用real-time PCR方法进行A型、H5、H7和H9亚型流感病毒核酸检测,然后对单独H9阳性标本利用HA和NA基因通用引物进行RT-PCR扩增和核苷酸测序,病毒HA、NA及NS基因测序结果在线BLAST分析,利用Bioedit和Mega5软件进行氨基酸比对和进化树构建.结果 从501份环境标本中检出A型AIV核酸阳性标本350份,H9亚型核酸阳性标本191份,占总标本数量的38.12％,H5亚型核酸阳性标本177份(35.33％),H7亚型核酸阳性11份(2.20％),H5和H9亚型混合核酸阳性标本68份(13.57％).部分单独H9亚型核酸阳性标本经RT-PCR和核苷酸测序鉴定出阳性H9N2亚型病毒核酸标本23份,分子进化分析表明2014年长沙市禽类场所环境中的绝大部分H9N2亚型AIVHA、NA、NS基因来源于A/Chicken/Shanghai/F/98 (F98)类似株病毒,属于新的S基因型,HA蛋白受体结合位点(Receptorbinding site,RBS)第235位(对应H3流感第226位)氨基酸为Leu (L),表现为特异性结合人流感病毒受体特征,病毒HA、NA及NS蛋白关键分子位点表现为低致病性的分子特征.结论 2014年长沙市禽类场所环境中H9亚型AIV核酸阳性率最高,H9N2亚型AIV的HA、NA和NS基因表现为低致病性的分子特征,但具有容易感染人类的特征,需要迸一步加强监测.     

禽流感病毒血凝素基因研究进展

血凝素在禽流感病毒感染细胞过程中起到了关键作用,对血凝素基因的相关研究一直是禽流感研究的重点和热点。文章从禽流感病毒简介,血凝素基因的结构特点,血凝素基因编码的蛋白质结构与功能,血凝素裂解位点的研究情况等方面进行了综述。可以为禽流感的预防和治疗提供参考。     

云南边境禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因分子结构特征分析

目的分析2003-2008年云南边境禽流感H5N1亚型病毒血凝素(HA)基因分子结构特征。方法对2003-2008年在云南边境采集境外禽类样品420份,做H5/N1亚型特异性RT-PCR及多重RT-PCR检测,对阳性样品中H5N1病毒HA基因进行RT-PCR扩增,克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及系统发育分析。结果21份代表性病毒样品HA裂解位点序列存在4种不同排列方式,均具有高致病性禽流感病毒分子结构特征;HA受体结合位点、糖基化位点及表位关键性氨基酸位点存在变异;系统发育分析表明可划分为5个不同进化分枝(1、2.4、2.3.2、2.3.4、7)。结论2003-2008年云南边境外H5N1病毒间具有遗传差异,进化分枝2.3.4毒株为当地流行的优势毒株,不同进化分枝或同一进化分枝不同毒株HA基因存在变异。     

H9N2亚型禽流感病毒纤突蛋白基因的分析

目的　克隆禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ / 99(H9N2 )纤突蛋白血凝素基因和神经氨酸酶基因 ,并与同一亚型不同毒株的病毒进行比较。方法　本研究以自行设计的引物 ,一次性成功地扩增出KMⅢ毒株HA和NA全长基因cD NA ,并将它们克隆和测序。以获得的核苷酸序列和氨基酸序列与其它毒株的HA蛋白和NA蛋白比较。结果　HA基因由16 83bp组成 ,编码 5 6 0个氨基酸 ;NA全基因为 14 0 7bp、编码 4 6 9个氨基酸残基 ;HA1羧基端的氨基酸组成是 :R -S -S -R ,符合低致病力毒株的分子特征。它们的氨基酸组成虽有差异 ,但与血凝素和神经氨酸酶功能关系密切的氨基酸残基却高度保守。联机检索表明 ,KMⅢ的HA基因cDNA与其它H9N2亚型HA基因最大同源性在 82 %～ 96 %之间。NA基因cDNA与其它H9N2亚型NA基因的最大同源性在 88%～ 97%之间。结论　我们首次克隆和测序了KMⅢ毒株的HA基因和NA基因 ,并对它们进行了分析     

H9亚型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析

目的扩增、克隆H9N2 HA基因,并进行序列分析,为H9N2流感病毒种间及跨种传播机制研究奠定基础。方法设计特异性引物,扩增克隆H9N2亚型禽流感病毒,测序后进行序列分析。结果成功克隆出4株H9N2亚型禽流感病毒,全长均为1.7 kb,ORF为1 683 bp,编码560个氨基酸;联机检索,与参考毒株比对核苷酸和氨基酸同源性均在90%以上。结论成功克隆4株H9N2亚型禽流感病毒,序列分析显示其核苷酸和推导氨基酸与参考毒株高度同源。     

2016-2018年广州市H6亚型禽流感病毒外环境分离株HA基因遗传特征分析

目的 对广州禽类市场外环境H6亚型禽流感病毒进行分离和测序,分析HA基因遗传进化特点。方法 通过接种鸡胚分离H6亚型禽流感病毒,采用RT-PCR方法扩增HA基因全长序列并测序,通过DNA Star7.1和MEGA 4.0软件,分析HA基因遗传特征。结果 2016-2018年广州禽类市场外环境分离到6株H6亚型禽流感病毒,HA基因核苷酸同源性在81.0%~99.1%之间。基因序列特征分析显示,所有分离株裂解位点序列相对保守,只有1个碱性氨基酸插入,呈现低致病性禽流感病毒分子特点。受体结合位点均为226Q和228G,为禽类呼吸道上皮受体结合位点。2016年分离株发现183-NNT糖基化位点的缺失。进化分析显示,广州早期分离株属于广东常见的ST2853-like分支,但2018年监测发现了ST339-like新流行分支病毒。结论 广州地区H6亚型禽流感病毒尚为禽类低致病性病毒,本研究毒株HA基因变异较大, 2018年毒株出现多遗传分支进化趋势,因此需要继续监测H6亚型禽流感病毒的流行和变异。     

人感染禽流感病毒病例在我国的分布情况北大核心CSCD

禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)属于正黏病毒科、A型流感病毒属、单股负链RNA病毒。水禽是禽流感病毒的天然宿主,部分禽流感病毒亚型不但能引起禽类致病,还能导致人类患病甚至死亡,严重危害公众健康。迄今为止,在自然界中共发现16种HA亚型和9种NA亚型的禽流感病毒,本文就我国禽流感病毒感染人病例的发生分布情况进行分析研究,为预测禽流感病毒的发病规律和制定防控措施提供科学依据。     

人感染H6N1禽流感病毒HA基因的分子特征及进化分析

目的 检测人感染H6N1禽流感病毒HA基因的分子特征、致病机制、来源及进化。方法 从Flu和GISAID两大数据库中获得人感染H6N1及近缘禽流感病毒的HA序列,通过ML、MP、BI法构建系统发育树,推测进化速率和最近共同祖先(TMRCA)时间,并分析相关变异位点、糖基化位点及裂解位点。结果 人感染与台湾3株禽感染H6N1病毒聚成一支,最近共同祖先时间为2002年,目前正在流行,且进化速度很快。其氨基酸序列含有5个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点,裂解位点上游仅1个碱性氨基酸,拥有两个特异的变异位点P186L和A287T。结论 人感染H6N1禽流感病毒目前仍是一种低致病性禽流感病毒,其HA基因由家鸡的序列进化而来。由于其高的进化速率及病毒重配的可能性,应引起高度重视。     

长沙市首例人感染H9N2禽流感病毒的HA基因序列特征分析

目的对长沙市首例人源H9N2禽流感病毒进行病毒分离与HA基因特征序列分析。方法用细胞培养法在可疑病例标本中分离H9N2禽流感病毒毒株,RT-PCR方法扩增禽流感病毒HA基因全长并测序,对所得结果进行氨基酸同源性与进化树分析。结果分离的毒株命名为A/Hunan/44558/2015,GenBank登录号为KX595338。毒株存在2处新发突变位点,HAT197D、HAD483N,第313位出现与湖南省人源H9N2毒株A/Lengshuitan/11197/2013相同的糖基化位点NCS。与A/Wild Chicken/Shanghai/C1/2014和A/Environment/Hunan/28028/2014的同源性分别为97.9%和97.6%。进化树分析分离的毒株处于Y280分支。结论发现病毒2处新的基因突变位点,与2014年湖南省环境源毒株同源性较高,存在基因交换重组,从分子水平揭示病毒HA基因的进化趋势。     

生物信息学在禽流感病毒研究中的应用

生物信息学自诞生之日起,其技术手段便在生物学、医学、农学和药学等领域的研究中得到广泛应用。虽然病毒学研究有其自身的特点和规律,但生物信息学已深入到禽流感病毒研究的各个层次,从微观的禽流感病毒基因组遗传变异到宏观的禽流感病毒的扩散等都有生物信息学的应用。本文简要综述了生物信息学在禽流感研究中的应用。     

2014-2016年广东省肇庆市人感染H7N9禽流感病毒基因组特征分析

目的 了解广东省肇庆市2014-2016年人感染H7N9禽流感病毒基因进化特征.方法 对肇庆市17例H7N9患者咽拭核酸直接进行8节段基因序列扩增与测定,用BioEdit5.0、MEGA6.0进行同源性和重要氨基酸位点分析,采用Neighbor-Joining法构建进化树,参比序列从GenBank下载.结果 7份H7N9病例标本获得8节段全基因序列,HA与A/chicken/Dongguan/695/2014 (H7N9)相似度最高,NA与A/ chicken/Dongguan/1075/2014 (H7N9)相似度最高;内部基因与2013-2014年广东东莞、深圳禽源H7N9及H9N2相似度较高.HA和NA基因与广东省东莞、广州、深圳等地市的H7N9序列同处于珠三角进化分支,与安徽、浙江、江苏等长三角分支的序列相似性低.HA蛋白受体结合位点发生G186V、Q226L变异,裂解位点序列均为PEIPKGR↓ GLF,含有2个碱性氨基酸;M2蛋白上发现耐药位点S31N,PB2蛋白上发现E627K突变,NA蛋白上未发现耐神经氨酸酶的位点变异.结论 肇庆市人感染H7N9病毒株可能来源于2013 2014年广东省珠三角地区禽源H7N9和H9N2,G186V、Q226L和E627K位点变异增强了对人的易感性.     

上海地区H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析

目的对分离自上海活禽批发市场的7株H9AIV(2002年1株、2006-2008年每年各2株)进行了HA序列的测定,以阐明这7株毒株HA基因的遗传变异及分子特征。方法采集鸡气管和泄殖腔样品,将H9亚型荧光RT-PCR试剂盒检测的阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了这7个毒株的HA基因,并将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定与同源性分析。结果HI试验表明这7株毒株均属于H9亚型禽流感病毒。核苷酸和其推导的氨基酸序列同源性比较结果表明,这7株毒株HA基因的核苷酸序列同源性为88.6%～99.6%,氨基酸序列同源性为89.1%～99.1%;7株分离株HA基因的裂解位点氨基酸顺序则均为RSSR↓GLF,为低致病性毒株;所有毒株的潜在糖基化位点均有7个;2002年的分离株与2006年早期的分离株在aa226和aa228位分别为Q和G,其余5株分离株在这两个位点分别为L和G。遗传发生关系分析,这7株分离株均属于Ck/Bei/1/94系。结论上海地区7株H9亚型分离株具有相同的起源,且分子特性相似,受疫苗免疫选择压力的影响不大。     

禽流感病毒的监测及诊断

禽流感病毒的天然宿主有水禽、野生鸟类和迁移性候鸟等。禽流感病毒主要感染家禽,并造成严重的经济损失,有的禽流感病毒的亚型还可感染人,是在人群中引发流感大流行的一个潜在危险因素。早期监测、快速准确检测和诊断禽流感病毒有助于预测、评估和了解禽流感病毒的变异趋势、流行传播规律,并及时应对突发的禽流感疫情。本文将简述禽流感病毒的监测及诊断方法。