家兔虹膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的比较直接分离和体外培养的继二代有色素家兔虹膜色素上皮(IPE)细胞移植于无色素家兔视网膜下间隙后的存活状况。方法分别选用经酶-显微解剖-酶分离法直接分离的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,和经过体外培养至继二代的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,制成相同密度的IPE细胞悬液。采用术中检眼镜定位的外路移植法将其植入无色素家兔视网膜下间隙。术后每日直接检眼镜观察眼底,并分别于术后的第1、2、4、8、12、16周对兔眼移植区作光镜检查。结果两种不同方式制备的有色素家兔虹膜色素上皮细胞均可在无色素家兔视网膜下间隙存活。其中,经体外培养的虹膜色素上皮细胞移植后呈较均匀的单层排列。植入的虹膜色素上皮细胞在观察期内均未见明显炎症和排斥反应。结论检眼镜定位的外路法可以将供体家兔IPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间隙,经体外培养的继二代家兔虹膜色素上皮细胞存活形态好于直接分离的家兔虹膜色素上皮细胞。     

兔视网膜色素上皮细胞移植术后急性排斥反应的病理学研究

目的：研究视网膜色素上皮细胞移植后排斥反应的发生及其控制过程。方法：以经巩膜外路移植方法行家兔同种异体视网膜色素上皮细胞移植,应用光镜及电镜观察移植后１４ｄ受体视网膜及移植细胞的病理学改变和免疫抑制剂对其影响。结果：单纯移植组移植排斥反应变化明显;免疫抑制剂组无排斥反应的变化。结论：家兔同种异体间视网膜色素上皮细胞移植有急性排斥反应的发生,但在控制排斥反应的情况下,移植细胞可保持原有形态     

兔视网膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的 用改良的二步酶法制备视网膜色素上皮（RPE）细胞悬液，不做玻璃体切割，直接进行视网膜下间隙的移植。方法 用酶I（含220kU/L)透明质酸酶和0.1%胰蛋白酶）分离视网膜神经上皮层与RPE之间的联系，再用酶Ⅱ（含0.25%胰蛋白酶）将RPE从玻璃膜上分离下来获得悬浮的RPE细胞，用特制的移植针头通过人为造成的局限性视网膜脱离区将其移植入受体视网膜下间隙。结果 术后2周供体RPE细胞呈单层排列于受体视网膜下间隙并存活，未见明显炎症反应。电镜观察术后5周供体RPE细胞位于受体Bruch膜上并与受体感光细胞外节盘膜形成镶嵌关系。结论 改良的内路法可以将供体RPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间膜，并至少存活7周。     

经外路途径行异种视网膜片移植的实验研究

目的：探讨经外路途径行视网膜下腔的全层异种视网膜移植的方法，并对移植结果进行初步观察。方法：用明胶包埋小鼠视网膜制成视网膜移植片，九只兔按外路手术方法将植片植入视网膜下腔。移植术后1-23天摘除动物眼球，石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜观察。结果：明胶包埋的视网膜移植片可以被植入宿主视网膜下腔中，视网膜移植片平铺于宿主视网膜下腔中，植片外层与宿主视网膜色素上皮层相贴、存活，未见明显免疫排异反应。结论：视网膜下腔是较为理想的视网膜移植的受位；明胶包埋的异种视网膜植片可作为供体进行移植；移到视网膜下腔的异种视网膜能够存活，这一结果为今后异种视网膜移植研究奠定了基础。     

原发性视网膜色素变性的视网膜移植及基因治疗

视网膜移植是指将同种异体的感光细胞或视网膜色素上皮细胞移植于受体视网膜下腔 ;大量研究证明移植物可对受体视网膜细胞起到营养作用并增加其数量 ,同时视网膜色素变性致病基因的认识逐渐清楚明确 ,可通过补充外源性基因或清除异常基因等方法 ,在基因水平上治疗视网膜色素变性     

原发性视网膜色素变性的视网膜移植及基因治疗

视网膜移植是指将同种异体的感光细胞或视网膜色素上皮细胞移植于受体视网膜下腔；大量研究证明移植物可对受体视网膜细胞起到营养作用并增加其数量，同时视网膜色素变性致病基因的认识逐渐清楚明确，可通过补充外源性基因或清除异常基因等方法，在基因水平上治疗视网膜色素变性。     

色素上皮细胞移植的研究现状

目前,视网膜变性疾病还没有一种真正有效的治疗方法,色素上皮细胞移植取得了初步成效,对此进行综述。1色素上皮细胞移植手术方法目前主要限于动物实验,临床只有小样本的实验报告。细胞来源包括视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithe lium,RPE)和虹膜色素上皮细胞(irispigmentepithelium,IPE)。移植方法主要有两种[1]:(1)外路法:分离并剪断上直肌,暴露近黄斑区的后巩膜,作厚近全层的巩膜瓣,用特制针头刺破其下的脉络膜约4mm,将RPE细胞注入视网膜下腔。(2)内路法:经睫状体扁平部作切口,先行玻璃体切割,再用特制针头刺破中央凹颞上方的视网膜,注入平衡液造成小范围的网脱,然后植入RPE细胞。2色素上皮细胞移植结果2.1视网膜色素上皮细胞的移植动物实验:运用上述方法将RPE细胞移植于视网膜下,10天后感光细胞内节变长,14天后外节变长,21天后大多数RPE细胞贴附于Bruch膜上,28天后移植区视网膜外核层增厚,感光细胞数目增加。RPE细胞和宿主感光细胞外节紧密接触,具有顶部和基底部的极性特征,且能吞噬感光细胞脱落的外节膜盘。临床实验:Algvere[2]将人胚胎视网膜色...     

视网膜移植术后紧密连接蛋白表达的研究

目的探讨视网膜色素上皮移植术后供体细胞与宿主细胞间紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达情况。方法采用CFDA-SE(10μmol/L)标记供体视网膜色素上皮细胞,通过玻璃体显微手术将细胞悬液植入同种异体青紫蓝兔视网膜下腔,移植术后应用眼底彩色照相机、光学相干断层扫描仪(optical coherence tomography,OCT)、荧光素眼底血管造影术(fluorescence fundusangiography,FFA)观察记录移植术后眼底情况,并分别在不同时间点处死实验动物,在荧光显微镜下观察标记细胞的位置并作紧密连接的结构蛋白ZO-1和occludin的免疫组化分析。结果细胞在接种后2h开始贴壁,1d后光镜下可见黑色圆形贴壁细胞。部分贴壁的细胞胞浆向外延伸,细胞内色素颗粒仍聚集于胞核周围,充盈整个胞浆。传2～3代后细胞中色素颗粒逐渐减少、脱失。荧光显微镜下观察,抗细胞角蛋白染色阳性率几乎达100%,证明培养的细胞是RPECs。免疫组化结果显示,在受体视网膜组织中,occludin及ZO-1阳性染色定位于RPECs的细胞膜和(或)靠近胞膜的细胞质内,接近顶部1/3处,呈棕黄色的颗粒状、点状结构,与紧密连接位于上皮细胞侧面顶端的分布一致。移植后30、60d时SZO-1/S(F=224.29,P%<0.05)、S occludin/S(F=273.90,P<0.05)与正常眼比较,差异有统计学意义。结论视网膜色素上皮移植术后可嵌插于宿主视网膜色素上皮之间并形成新的血视网膜外屏障。     

兔胚胎全层视网膜移植到大鼠视网膜下腔的研究

目的观察兔胚胎全层视网膜移植物,包括神经上皮和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE),在正常Wistar大白鼠和视网膜变性(Royal college of surgeons,RCS)大鼠视网膜下腔的发育状况,从而探讨异种胚胎全层视网膜移植方法的可行性.方法采用17只孕3周兔胚胎作为移植供体,酶法分离得到全层视网膜片(包括神经上皮和RPE),将其移植到20只Wistar大鼠和14只RCS大鼠的右眼视网膜下腔;分别于术后3 d、1、2、4周处死宿主,应用视网膜组织切片进行HE染色和免疫组化染色,观察供体视网膜的生长发育状况.结果兔胚胎视网膜能在两种大鼠视网膜下腔发育为典型的"玫瑰花结"及视网膜各层结构.结论兔胚胎视网膜在大鼠视网膜下腔能进行分化和发育.异种胚胎全层视网膜移植是可行的,但移植方法还需进一步探索和完善.     

经脾脏注射未成熟树突状细胞对大鼠小肠移植免疫耐受的诱导作用

目的:研究经脾脏注射末成熟树突状细胞(iDC)对大鼠小肠移植免疫耐受的诱导.方法:健康成年F344大鼠为供体,SD大鼠为受体.随机分为4组(n=10),A组(阴性对照组):移植前7天,受体经阴茎背静脉注射生理盐水1ml;B组(阴性对照组):移植前7天,受体经脾脏注射生理盐水1ml;C组(iDC阴茎背静脉注射组):移植前7天,受体经阴茎背静脉注射供体的iDC,细胞数为2 X 106个;D组(iDC脾脏注射组):移植前7天,受体经脾脏注射供体的iDC,细胞数为2 X 106个.4组1周后行大鼠异位节段性小肠移植术.观察各组受体存活情况,移植小肠采用病理学检查及细胞凋亡检测.结果:D组大鼠移植小肠存活时间为(17.50±1.05)天,较A组(7.17±1.17)天、B组(7.33±1.51)天、C组(12.83±2.79)天显著延长:D组移植小肠炎性细胞浸润、黏膜组织结构破坏程度和黏膜细胞的凋亡数目明显低于A、B、C组.结论:经脾脏注射供体来源的iDC,可在一定程度上诱导受体产生免疫耐受,显著延长受体大鼠小肠移植术后的存活时间.     

胎兔视网膜色素上皮移植的初步研究

目的:观察受体Bruch膜和视网膜色素上皮(retrial pigment epithelial,RPE)受损情况下供体RPE细胞的增殖、分化和凋亡状况。方法:制备有色素胎兔RPE细胞悬液,移植至破坏了Bruch膜和RPE细胞的12只成年新西兰大白兔的视网膜下腔。左眼作为实验组,右眼作为对照,于术后3、7和14d, 采用Ki-67免疫组化和TUNEL染色,并提取RPE细胞DNA作琼脂糖凝胶电泳,观察Ki-67阳性RPE细胞及移植的RPE细胞和受体ONL细胞的凋亡百分率,行统计学分析。结果:术后随着时间的延长,实验组或对照组Ki-67阳性RPE细胞数显著增加(P<0.05);术后14 d实验组或对照组的TUNEL染色ONL核阳性百分率较术后3 d显著减少(P<0.05);术后实验组TUNEL染色阳性和细胞核深染的RPE细胞无显著增加(P>0.05);细胞核深染的RPE细胞百分率明显高于TUNEL阳性的细胞(P<0.01)。对照组未见TUNEL阳性的RPE细胞。术后14d,移植的RPE细胞DNA电泳出现典型的凋亡带。结论:在受体Bruch 膜、RPE受损状态下,供体的RPE细胞具有良好的增殖和分化能力。     

家兔视网膜色素上皮移植细胞ACP酶的功能研究

将长耳白兔视网膜色素上皮细胞（ＲＰＥ）悬液植入到青紫蓝兔视网膜下腔，然后移植细胞的结构及酸性磷酸酶（ＡＣＰ）的活性恢复过程进行了动态观察分析，包括用直接检眼镜、透射电镜、酶组织化学及计算机图像分析系统等方法与手段。结果：移植细胞的超微结构及毗邻关系在术后第１４ｄ恢复正常，ＡＣＰ酶的活性在术后第３ｄ开始恢复，第７ｄ恢复加速，第２１ｄ恢复正常。提示：移植的ＲＰＥ细胞能够成活，其结构的恢复先于功能恢复，并能代替原位细胞执行生理功能。     

视细胞移植术后视网膜色素上皮的结构变化

获得纯化的由大肠杆菌表达的小鼠 Ｆａｓ配体（Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ,ＦａｓＬ）。方法：以质粒 ｐＥＴ－１５ｂ为载体,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达小鼠的ＦａｓＬ,用金属螫合亲和层析法纯化。结果：转化菌中,重组质粒是稳定的,异丙基－β－Ｄ硫代半乳糖苷可诱导小鼠ＦａｓＬ的表达 ,金属螫合亲和层析法可以初步纯化此蛋白。结论：在大肠杆菌中表达出小鼠的ＦａｓＬ,并得到初步纯化。     

Long-term studies on allotransplantation of rabbit retinal pigment epithelial cells double-labelled with 5-bromodeoxyuridine and natural pigment

Ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ（ＲＰＥ）ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ,ａｔｒｏｐｈｙａｎｄｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｈａｖｅｂｅｅｎｉｍｐｌｉｃａｔｅｄａｓｔｈｅｃａｕｓｅｏｆｍａｎｙｒｅｔｉｎａｌｄｉｓｅａｓｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｇｅ?..     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性。方法采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定。透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况。结果纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%。原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体。结论通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料。两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异。     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养

目的：将猪视网膜色素上皮(RPE)细胞进行体外培养，为研究RPE细胞的功能及治疗有关眼底疾病提供细胞来源。方法：采用胰酶2次消化法分离猪RPE细胞，15％DMEM培养液培养，每天倒置显微镜观察细胞生长情况，并作流式细胞仪分析培养细胞的细胞周期。以免疫组织化学法鉴定培养细胞的来源。结果：离体培养细胞初期呈圆形，富含黑色素，12～24h贴壁呈圆形、梭形及不规则形。传代后细胞渐趋透明。免疫组化证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。细胞周期分析提示体外培养的RPE细胞保持正常的繁殖能力。结论：培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源。     

兔视网膜色素上皮细胞培养和鉴定

目的：进行兔视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞的体外培养，探讨RPE培养与鉴定方法，为研究其生理功能、生化特征和病理过程提供细胞模型。方法：用改良的眼杯固定法，将其固定在眼球托上，用胰酶直接消化视网膜色素上皮面，收取RPE细胞。作细胞形态学、免疫组织化学、免疫荧光鉴定。结果：RPE细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含丰富黑色素颗粒，多巴氧化酶呈阳性反应．免疫组织化学染色和免疫荧光染色提示角蛋白表达强阳性。结论：培养的大量细胞可用于RPE的体外实验研究，多巴染色是鉴定RPE细胞一种较好的方法。     

人视网膜激光光凝后荧光血管造影和超微结构研究

目的　探讨激光对人视网膜损伤后荧光血管造影和超微结构改变及修复过程 ,为激光治疗视网膜病变提供理论基础。方法　因眼眶恶性肿瘤需作眶内容物剜出的 7例病人 ,征得合作和签署同意书后 ,术前 1、3和 7d用 、 、 级光斑光凝视网膜 ,分别于 1、3和 7d行眼底血管荧光造影照像。摘除眼球用 2 0 g/ L 多聚甲醛固定 ,作成超薄切片 ,透射电镜观察照像。结果　荧光血管造影 :光凝后第 1d可见荧光明显渗漏 ,光斑越大 ,渗漏越显著。光凝后第 3d渗漏减轻 ,中心出现小的遮蔽荧光。光凝后第 7d渗漏消失 ,中心区遮蔽荧光增强。超微结构 :光凝后第 1d, 级光斑 ,部分色素上皮细胞肿胀、坏死 ,部分感光细胞排列紊乱或溶解消失 ,外核层细胞数减少。 级光斑 ,色素上皮和感光细胞大量溶解破坏 ,外核层部分细胞坏死核凋亡 ,外网状层结构紊乱。 级光斑 ,视网膜全层受损。光凝后第 3d,细胞水肿减轻 ,碎屑减少 ,吞噬细胞出现 ,色素上皮细胞和 Müller细胞开始增生。光凝后第 7d,增生的色素上皮细胞和 Müller细胞修复视网膜破坏区。 至 级光斑视网膜结构紊乱逐渐加重。结论　光疑引起视网膜荧光渗漏、视网膜色素上皮细胞、神经元细胞的坏死和凋亡 ,全层超微结构的破坏 ,继后色素上皮细胞和Müller细胞增生修复破坏区     

神经干细胞与大鼠RPE细胞间的线粒体转运及对RPE细胞凋亡的影响

目的 研究小鼠神经干细胞(neural stem cells, NSCs)C17.2细胞系与从RCS大鼠变性视网膜中原代分离视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)的线粒体交换方式及其对RPE细胞特性的影响.方法 分离RCS大鼠RPE细胞并进行培养和鉴定.分别用线粒体特异性标记物Mitotracker-red和Mitotracker-green标记RPE细胞和小鼠NSCs细胞的线粒体,将两种细胞共培养,激光共聚焦显微镜下观察两种细胞之间隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNT)的形成及线粒体转运方式.采用流式细胞仪检测与NSCs共培养后RPE细胞的反应性活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平、细胞周期和细胞凋亡水平的变化.结果 来源于RCS大鼠视网膜的第3代RPE细胞生长状态良好,RPE65及Bestrophin蛋白阳性率细胞均大于95%.与NSCs共培养24 h后,可见RPE细胞与NSCs间TNT的形成,NSCs中的线粒体向RPE细胞方向单向运动,接受NSCs转运的线粒体后,RPE细胞的ROS水平降低(P<0.01);RPE细胞的增殖能力增加,处于S期的细胞比例明显增加(P<0.01),细胞增殖指数(PI)显著增加(P<0.05);RPE细胞早期凋亡细胞比例显著降低(P<0.05).结论 NSCs可通过与相邻的变性RPE细胞之间形成TNT并向其转运线粒体而改善变性RPE细胞的存活.     

兔异体异位下丘脑-垂体移植的实验

目的 探讨幼兔的下丘脑－－垂体异体异位移植后,细胞成活及内分泌重建的可能性,方法 以徒手定向穿刺成兔垂体区,射频毁损垂体建立去垂体动物模型,将制备好的幼兔下丘脑－垂体组织植入模型兔的臀部肌肉内,放免测定术后１,３及８ｗｋ血清Ｔ４,ＰＲＬ,ＧＨ水平。结果 垂体去除组上述激素水平持续下降,移植组术后８ｗｋ上述激素恢复到术前水平,术后３ｗｋ移植物ＨＥ染色见垂体及下丘脑细胞结构良好,术后８ｗｋ透射电镜下见