国产肉桂和大叶清化桂的鉴别比较及其挥发油成分研究

对国产肉桂与大叶清化桂的性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别进行了比较,并测定了二者不同部位挥发油含量,论证了大叶清化桂皮中桂皮醛含量要高于国产肉桂,其质较优。     

当归实时荧光定量PCR内参基因筛选

目的 通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)筛选当归Angelica sinensis不同材料中稳定表达的内参基因。方法 以不同生长期、春化温度、组织部位以及抽薹/未抽薹植株为材料,对转录组数据库获得的13个候选内参基因和1个已报道的肌动蛋白基因的表达水平进行qRT-PCR检测,利用ge Norm、NormFinder、BestKeeper、?Ct和RefFinder等软件分析表达水平的稳定性。结果 不同材料中14个候选内参基因的稳定性存在显著差异,ACT7、UBC32、UBC26和UBC7分别为不同发育阶段、春化温度、组织部位和抽薹/未抽薹植株中最稳定的内参基因;EEF1G为所有样品中最稳定的内参基因,其次为RPL3和UBC26。结论 为进一步检测当归产量和品质形成过程中的基因表达提供重要参考。     

肉桂配伍应用八法述略

肉桂为樟科常绿乔木植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl和大叶清化桂C.cassia Presl var.macro-phyllum Chu的干皮或枝皮,为临床常用的温里中药。肉桂味辛、性热,有毒,归心、脾、肾经。其功能回阳救逆、补火助阳、散寒止痛(见《中药学》统编五版教材),可与多种中药配伍应用,以治疗不同疾病。根据文献整理与分析,肉桂的常见主要临床配伍应用,可归纳为八个方     

巴戟天实时荧光定量PCR内参基因的选择

目的选择合适的内参基因,用于巴戟天不同组织和不同处理的叶中目标基因表达量的分析检测。方法以巴戟天不同组织和不同处理的叶为材料,根据巴戟天转录组数据,选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)、微管蛋白α(tubulinalpha,TUA)和肌动蛋白(Actin)基因等10个内参基因作为候选基因。利用实时荧光定量技术,并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件分析内参基因的表达稳定性,从而筛选出巴戟天不同组织和不同处理叶中表达稳定的内参基因。选择合适的内参基因对巴戟天的1-脱氧木酮糖-5磷酸合成酶(DXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在不同组织和不同处理的叶中相对表达量进行分析。结果内参基因GAPDH和泛素(UBQ)在巴戟天不同组织中表达最稳定,GAPDH+UBQ的双内参组合能够更加准确地分析目的基因在巴戟天不同组织的相对表达量,而在不同处理的叶中GAPDH和Actin表达稳定性最好,选择GAPDH+Actin的双内参组合可以确保目的基因相对分析表达结果的可靠性。在巴戟天不同组织中,DXS目的基因的相对表达量为根<茎<叶,DXR的相对表达量为茎<根<叶。在巴戟天不同处理的叶中,DXS和DXR基因的相对表达量相对于未处理的叶(CK)都有所提高。结论筛选得到的稳定内参基因为后续巴戟天相关基因表达研究奠定基础,使用2个稳定内参的组合对目的基因进行均一化处理有利于提高目的基因表达分析的准确性。     

显齿蛇葡萄实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

目的筛选适用于显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)的内参基因。方法设计简并引物,采用RT-PCR从显齿蛇葡萄中克隆6个候选内参基因片段,包括肌动蛋白基因(Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18 S核糖体rRNA基因(18 S-rRNA)、α-微管蛋白基因(α-Tubulin)、β-微管蛋白基因(β-Tubulin)和多聚泛素酶基因(UBQ)。应用qRT-PCR技术检测这6个候选内参基因在显齿蛇葡萄不同组织器官中(茎尖、嫩叶、成熟叶、老叶、茎和根)的表达情况。借助Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种统计学软件综合评价6个内参基因的表达稳定性。通过苯丙氨酸解氨酶基因(Ag PAL)的表达分析对筛选出的内参基因进行稳定性验证。结果 18 S-rRNA、GAPDH和Actin的表达稳定性较好,适合作为显齿蛇葡萄不同组织基因表达研究的内参基因,以这3个基因为内参基因分析Ag PAL基因的相对表达量,结果发现它们在各组织器官中的表达变化趋势基本一致。结论确定显齿蛇葡萄qRT-PCR分析的合适内参基因,为后续相关基因表达研究奠定基础。     

川续断Actin、Tubulin和GAPDH基因的克隆及表达稳定性分析

目的 从川续断Dipsacus asper中克隆并筛选出稳定的内参基因用于实时荧光PCR（qRT-PCR）的分析校正,为今后川续断功能基因的表达分析及调控机制研究提供基础。方法 从川续断转录组数据库中筛选并克隆肌动蛋白（Actin）、微管蛋白（Tubulin）、GAPDH基因家族内参基因的核心片段,以不同产地、不同组织部位和不同发育时期的川续断植株为材料,通过qRT-PCR获得各基因的表达信息,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT、RefFinder共5个内参评价软件分析各基因的表达稳定性,综合评价并筛选出最佳的川续断内参基因。结果 克隆获得10个候选内参基因核心片段,分别属于Actin、Tubulin、GAPDH 3大基因家族,各家族基因序列间同源性较高;稳定性综合分析结果显示,DaACT103在不同产地及不同组织部位的表达稳定性较强且表达量相对较高,DaTUB5在不同发育时期的表达稳定性较强且表达量相对较低。结论 DaACT103和DaTUB5均可作为川续断的内参基因,其中,DaACT103适用于作为具有较高表达丰度基因的内参基因;DaTUB5适用于作为表达丰度较低基因的内参基因。     

罗汉果内参基因筛选和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶时空表达分析

目的筛选罗汉果Siraitia grosvenorii基因表达分析的内参基因,研究苷V生物合成关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)时空表达特性。方法克隆罗汉果看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、微管蛋白(α-tubulin)、肌动蛋白(β-actin)和泛素(UBQ5)的基因片段,评价了4个基因在不同部位(叶、茎和果)及果实发育不同时期的稳定性,筛选内参基因,分析HMGR的时空表达特性。结果 UBQ5表达最稳定,适宜作为内参基因;叶片的HMGR相对表达量较低,茎和果实相对表达量较高;果实不同发育时期,HMGR的相对表达量呈现先升高再降低然后再升高再降低的波动式变化,70 d后HMGR的相对表达量最高,然后依次是5、30、10、50 d。结论 UBQ5是适宜的内参基因。叶片、茎和果实中,HMGR的相对表达量差异明显。果实发育不同时期,HMGR的相对表达量呈波动式变化,与苷V合成积累变化规律相似。     

基于实时荧光定量PCR分析的北柴胡内参基因的筛选及验证

目的筛选出在北柴胡不同生长时期及不同器官中表达均稳定的内参基因并进行验证。方法利用实时荧光定量PCR获得18个候选内参基因所有Ct值,通过3种不同算法(Bestkeeper、Norm Finder、Ge Norm)的软件对内参基因稳定性进行分析,采用皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)分析3个软件给出的稳定性排名结果。结果所有候选内参基因的Ct值相对宽泛,ADF1b、ADF5、ADF7、e IF2b和ACT2为最为合适的内参基因,而e IF6被认为稳定性最差的内参基因。3个软件计算结果均呈现显著性相关。结论采用实时荧光定量PCR结合3种不同算法进行北柴胡内参基因的筛选及验证是可行的。在北柴胡柴胡分子遗传研究中,发掘到的内参基因对目的基因进行均一化处理有助于提高目的基因表达分析的精确性及可信度。     

栽培远志qRT-PCR内参基因筛选与P450s基因的时空表达分析

目的 筛选适用于不同生长年限和不同部位的栽培远志实时荧光定量PCR分析（quantitative real time PCR,qRT-PCR）的稳定内参基因,为远志体内各个基因表达分析提供合适内参基因。并对4个细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase,P450s）基因在上述远志样品中的差异表达进行分析,明确4个P450s基因在栽培远志中的时空表达分布。方法 通过qRT-PCR获取Tubulin 1、Tubulin 2、Elongation 1、Elongation 2、Actin 1、Actin 2、GAPDH和cdc-42 8个候选内参基因在上述远志样品中的熔解曲线与C_t值;利用软件geNorm和NormFinder对候选内参基因的表达稳定性进行评价;通过qRT-PCR分析4个P450s基因CYP709B2、CYP71AP39、CYP88A85、CYP714E38在上述远志样品中的相对表达情况。结果 geNorm分析结果表明,在远志（1~3年生）根、茎、叶、花中稳定表达的为Tubulin 2与Elongation 1;NormFinder结果显示,Elongation 1是最稳定的内参。CYP709B2、CYP71AP39基因在远志茎、叶（1~3年生）中的mRNA表达量最高,在根与花中的表达量则较少。而CYP88A85、CYP714E38基因则在远志根（1~3年生）中的mRNA表达水平较高。结论 Elongation 1适合作为栽培远志体内基因表达分析的内参基因。栽培远志中的P450s基因在远志根、茎、叶、花中的表达趋势不一致。     

当归香豆酸-3-羟化酶基因ASC3H的克隆及表达模式与阿魏酸含量相关性分析

目的：对当归中香豆酸-3-羟化酶基因（C3H）全长进行克隆,进行生物信息学与基因表达模式分析,结合当归根不同组织部位阿魏酸的含量,推测ASC3H基因功能。方法：基于前期转录组测序结果,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）克隆全长cDNA序列,运用生物信息学方法分析该序列特征,并利用Real-time PCR和高效液相色谱法（HPLC）分别测定当归不同组织中ASC3H基因表达量及阿魏酸含量。结果：克隆获得当归ASC3H全长基因（登录号MN2550298）,开放阅读框（ORF）长度为1 530 bp,编码509个氨基酸,理论相对分子质量为57.86 kDa,等电点8.36,为不含信号肽的亲水性不稳定蛋白,定位于叶绿体中,有跨膜区,具有多个磷酸化位点,含有细胞色素P450的保守结构域CGYDWPKGYGPIINVW＿P450(383～399 aa);多重氨基酸序列比对分析结果显示ASC3H与其他植物的C3H基因具有较高相似性,并与同科植物大阿米芹的同源性最高;Real-time PCR结果显示ASC3H基因在当归不同组织的表达量不同;HPLC结果表明阿魏酸成分在当归根...     

肉桂的化学成分研究

采用硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱、Sephadex LH-20及制备HPLC等多种色谱分离技术对肉桂乙醇提取物中的化学成分进行分离纯化,运用NMR、MS等波谱方法并结合已有文献对分离得到的化合物进行结构鉴定。结果从肉桂的乙醇提取物中分离得到12个化合物,分别鉴定为(2R, 3R)-5,7,3',4'-四甲氧基黄烷醇(1),(2R, 3R)-5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷醇(2),香豆素(3),肉桂酸(4),(E)-2-羟基苯丙酸桂酯(5),3, 3', 4, 4'-四羟基联苯(6),methylstictic acid(7),epi-boscialin(8),(1R,2S,3S,4S)2,3-环氧-1,4-二羟基-5-甲基-5-环己烯(9),4,5-二羟基-3-甲基-2-环己烯酮(10),顺式-4-羟基-蜂蜜曲菌素(11),2-羟基-4-甲氧基肉桂醛(12),其中化合物 5~11 为首次从该属植物中分离得到。     

多孔淀粉固化肉桂挥发油的考察

目的:评价多孔淀粉固化肉桂挥发油的特性。方法:采用多孔淀粉固化肉桂挥发油,考察多孔淀粉用量对桂皮醛收率、体外溶出度和受热稳定性的影响;采用差示扫描量热法和扫描电镜法对固化粉末进行物相表征。结果:多孔淀粉固化肉桂挥发油质量比2∶1,桂皮醛收率达92.6%;肉桂挥发油被固化后,桂皮醛体外溶出速率加快,受热稳定性提高。结论:多孔淀粉固化肉桂挥发油的生产工艺简单、操作方便,具有较高的应用价值。     

肉桂不同部位及其挥发油的红外光谱宏观表征

目的:考察肉桂不同部位(树皮、嫩枝、叶)及其挥发油的红外指纹图谱差异,为研究其不同部位所含化学成分特征提供参考依据。方法:采用傅里叶变换红外光谱法及二阶导数红外光谱法。结果:肉桂的树皮、嫩枝、叶原粉末红外光谱整体峰形较相似,三者均含有草酸钙、多酚类及糖苷类成分;嫩枝和叶在1 653 cm-1和1 734 cm~(-1)附近的特征峰要明显强于皮,推测嫩枝和叶中饱和脂肪酸酯类成分和黄酮类成分的含量要高于皮。采用二阶导数放大后,发现在1 480~1 435 cm~(-1)和1 630~1 580 cm~(-1)时,嫩枝有2个特征峰,而叶在相应位置只有1个特征峰。树皮、嫩枝、叶挥发油红外光谱与桂皮醛的光谱相近,通过相关系数的计算,发现三者挥发油中桂皮醛含量大小依次为树皮嫩枝叶;在1 734 cm~(-1)处附近,嫩枝和叶挥发油的峰强要明显大于树皮,说明嫩枝和叶的挥发油中还含有其他结构的酯类化合物。通过比较二阶导数光谱中1 275 cm~(-1)处峰附近的高低,可以进一步区分嫩枝和叶的挥发油。结论:红外光谱及二阶导数红外光谱法,不仅可以分析肉桂不同部位及其挥发油的整体化学成分差异,还可以区分含有相似成分的不同部位。     

高效液相法测定黄连配伍肉桂前后肉桂酸的含量

目的 :定量测定黄连配伍肉桂前后肉桂酸含量的变化。方法 :色谱柱YWGC₁₈(4.6mm×200mm ,10μm) ,检测波长 280nm ,柱温室温 ,流动相乙腈0.01%磷酸 (27∶73) ,流速 1ml·min^-1。结果 :肉桂酸与其他组分具有良好的分离度 ,线性范围为 0.112～4.48μg ,加样回收率为 100.0% ,RSD =0.66%。 结论 :黄连与肉桂配伍后肉桂酸含量下降 ,且下降程度与黄连比例有关 ;本法可用于含肉桂复方中肉桂酸的含量测定。     

基于肉桂质量标志物（Q-Marker）预测的质量控制研究

目的建立一种基于肉桂Cinnamomum cassia质量标志物(quality marker,Q-Marker)预测的质量控制方法,并运用化学计量学综合分析不同产地肉桂质量差异。方法采用高效液相色谱法,通过同时测定肉桂中肉桂醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸及邻甲氧基肉桂醛5种Q-Marker含量,建立肉桂药材的指纹图谱,采用聚类分析、主成分分析等化学计量学手段对27批肉桂药材质量进行评价。结果建立了一测多评法,肉桂醇、肉桂酸及邻甲氧基肉桂醛与内参物肉桂醛的相对校正因子分别为0.135 7、0.211 5、1.592 7;建立了不同产地27批肉桂的HPLC指纹图谱及共有模式,并进行聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析。结果显示,27批不同产地肉桂可聚为5类,肉桂醛、香豆素是体现3个主产地间样品差异的主要标志性成分,并提示越南产的肉桂成分含量与中国广东、广西产的肉桂存在差异。结论建立的一测多评法能准确、简便地测定肉桂中Q-Marker的含量,不同产地的肉桂药材质量存在一定的差异性。为肉桂质量控制提供了更为科学、全面的依据和基础。     

肉桂的化学成分、药理作用及质量标志物(Q-marker)的预测分析

肉桂为我国传统常用中药材,主要分布于热带地区,道地产区包括我国广东、广西2省和越南部分地区。肉桂中化学成分类型丰富,包括挥发油、黄烷醇类、萜类、木脂素类、酚酸类、多糖类等成分,传统认为肉桂挥发油中的桂皮醛和桂皮酸为其主要药效成分。对肉桂资源、化学成分、主要药理活性进行总结,并在此基础上,分析挥发油、多酚类、二萜类等成分与药效的关系,分析生源途径、传统功效、现代药理作用与化学成分之间的关系。建议对肉桂进行挥发油、多酚类、黄烷醇类、二萜类等成分的定性、定量分析,进一步聚焦其中多酚类、黄烷醇类和萜类等成分化学物质组的深入研究,为明确肉桂的质量标志物(Q-marker)和制定科学的质量标准提供基础。     

基于二分类Logistic回归分析的桂枝等级预测研究

目的结合质量控制成分和生物活性对桂枝药材质量等级的影响,建立一种基于"成分-功效"研究思路的二分类模型,为桂枝的质量分级提供依据。方法采用超高效液相色谱法(UPLC),建立质控成分的含量测定方法,以DPPH和羟自由基清除实验来反映桂枝药材体外抗氧化活性,采用Logistic算法,将质控指标和抗氧化指标进行关联分析,最后建立用于桂枝分级的二元Logistic回归模型。结果建立了20批桂枝样品的UPLC指纹图谱,并对其抗氧化活性进行测定。采用主成分分析筛选出了4个质量控制成分香豆素、桂皮醇、肉桂酸、桂皮醛,并对其进行方法学验证。根据回归方程,初步将20批桂枝药材分为优、良、中、差4级。结论基于二元Logistic回归模型来描述桂枝饮片等级与影响因素之间的映射关系是可行的,可以更好地表达投料饮片等级分类标准,为中药桂枝的质量评价标准制定提供了新的思路。     

藏柴胡中三萜皂苷类成分的研究

该研究主要探究藏柴胡中的三萜皂苷类成分。采用大孔吸附树脂,MCI,硅胶,ODS,MDS柱色谱以及半制备高效液相色谱等分离纯化方法,从藏柴胡70%乙醇(含0.5%氨水)提取物中得到12个化合物。利用高分辨质谱、核磁共振等波谱手段鉴定其结构分别为柴胡皂苷b2(1),柴胡皂苷a(2),柴胡皂苷b1(3),柴胡皂苷d(4),hydroxysaikosaponin a(5),柴胡皂苷b3(6),柴胡皂苷c(7),柴胡皂苷i(8),柴胡皂苷f(9),chikusaikosidesⅡ(10),柴胡皂苷s(11),柴胡皂苷I(12)。12个化合物均属齐墩果烷型三萜皂苷类化合物,其中化合物1,3,5,8~9,11~12均为首次从该植物中分离得到。体外抗流感病毒实验表明在20μmol·L-1下,化合物2,4,6,8,11~12对流感病毒WSN33具有较明显抑制作用,其抑制率分别为91.3%,88.6%,53.4%,61.3%,77.3%,57.4%。     

基于毛蕊花糖苷含量分析陈皮和砂仁在熟地黄炮制中的影响性研究

[目的] 针对熟地黄的药性特点，深入研究熟地黄炮制过程中，陈皮与砂仁对其炮制过程中毛蕊花糖苷含量的影响，并建立超高压液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）法检测熟地黄中毛蕊花糖苷含量的方法，并根据其含量变化，验证其炮制方法的科学性与合理性，为丰富熟地黄的炮制品种并建立其质量控制标准提供参考。[方法] 参考熟地黄在全国各省市《中药炮制规范》中的炮制方法，采用其中具有临床实用特色的方法，即：陈皮制熟地黄、砂仁制熟地黄（酒蒸法和拌制法），并以2015版《中华人民共和国药典》中熟地黄的质量标准为参照指标，采用UPLC-MS检测技术对其炮制过程中毛蕊花糖苷的含量变化进行研究，并结合性状评分，进行综合评价及统计学分析。[结果] 检测的线性范围为（1~1 000 ng/mL，r=1），其精密度、重复性、稳定性、准确度均较好（RSD<3%）。本实验中炮制后的熟地黄其毛蕊花糖苷的含量均超过药典标准，在炮制过程中当性状达到药典及传统标准时，其毛蕊花糖苷的含量能保持在较高水平，以陈皮制熟地黄后的毛蕊花糖苷含量最高，炮制过程中含量变化最显著。[结论] 陈皮制熟地黄可明显稳定和控制毛蕊花糖苷在熟地黄炮制过程中的下降趋势。这对通过相应的炮制方法，在有效保存熟地黄指标性成分的同时，扩大熟地黄临床使用范围有积极意义。同时UPLC-MS法由于操作简便、速度快、准确度高，可用于熟地黄炮制过程中毛蕊花糖苷含量的检测。