冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚冷冻复苏效果的比较

目的比较冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚冷冻复苏的效果。方法将接受体外受精-胚胎移植患者的剩余胚胎进行培养,所获得的囊胚分别进行程序冷冻法或冷冻环玻璃化法冷冻,比较囊胚复苏后的复苏率、妊娠率等指标。结果玻璃化冷冻复苏39个周期,115个囊胚、存活104个(90.4%),移植38个周期、74个囊胚,临床妊娠28个周期(73.7%),其中2例流产,2例足月分娩2个正常新生儿,24例继续妊娠。程序冷冻21个复苏周期,87个囊胚、存活37个(42.5%),移植15个周期、28个囊胚,临床妊娠6例(40%),其中流产1例,2例足月分娩3个新生儿,3例继续妊娠。玻璃化冷冻后的囊胚复苏率显著高于程序冷冻,复苏周期移植取消率显著低于程序冷冻,而临床妊娠率则明显高于程序冷冻,均有统计学差异(P<0.05)。但两种方法的流产率没有显著差异。结论使用冷冻环玻璃化法适于人类囊胚的冷冻保存,其复苏率和妊娠率均显著高于传统的程序冷冻法,复苏周期移植取消率低于程序冷冻法。     

The application of vitrification in human blastocyst cryopreservation: Analysis of clinical outcome of 117 cycles

Objective: To summarize the clinical outcomes of 117 human vitrified blastocyst transfer cycles and to determine the impact factors.Methods: In IVF-ET cycles, supernumerary embryos were cultured to 5-Day(D5) or 6-Day(D6), blastocysts of various stages were cryopreserved by vitrification using cryoloops. Survival rate and clinical pregnancy rate were observed.Results: A total of 312 blastocysts were thawed in 117 frozen embryo transfer cycles, the survival rate was 90.7% (283/312) after thawing. After the transfer of 230 blastocysts in 115 cycles, 69.6% (80/115) of the women got clinically pregnant, and 17.5% (14/80) of them suffered from miscarriage, 39 healthy babies were born in 28 deliveries, and the other 38 pregnancies are ongoing. The implantation rate was 47.4% (109/230). In 107 transfer cycles with 2 hatched blastocysts transferred in each cycle, 72.9% (78/107) got clinically pregnant, while in 8 cycles with 1 or no hatched blastocysts in the two transferred blastocysts, the clinical pregnancy rate is 25%(2/8). The clinical pregnancy rates were not statistically different between natural (77.4%, 24/31) or artificial endometrium preparation (66.7%, 56/84) cycles. Conclusions: These findings suggest that blastocyst vitrification is effective in terms of implantation rate and pregnancy outcome. Transferring of two hatched blastocyst can achieve a higher pregnancy rate.     

应用冷冻环玻璃化冷冻小鼠囊胚的效果观察

目的比较冷冻环玻璃化冷冻小鼠各阶段囊胚的存活率及继续发育能力。方法应用冷冻环以15%二甲基亚砜(DMSO)+15%乙二醇(EG)为主要组成的玻璃化冷冻液,冷冻小鼠早期囊胚112个、囊胚120个、扩张囊胚105个,以同期未冷冻囊胚(100个)作对照;并于冷冻前人工皱缩小鼠囊胚30个,以同期未皱缩的囊胚(50个)为对照。比较冷冻复苏后胚胎存活率及继续发育能力。结果小鼠早期囊胚、囊胚、扩张囊胚各组的存活率分别为88.4%、69.2%和55.2%,囊胚孵出率分别为82.8%、65.1%和60.3%。早期囊胚组复苏后的存活率和囊胚孵出率均显著高于囊胚组和扩张囊胚组(P<0.05)。冷冻前人工皱缩扩张期囊胚,冷冻复苏后存活率达93.8%,孵出率78.1%,与未皱缩组比较差异有显著性(P<0.05)。结论玻璃化冷冻囊胚的效果与囊胚的发育阶段有关;冷冻前人工皱缩囊腔体积能明显提高扩张囊胚玻璃化冷冻的效率。     

Cryotop玻璃化冻融人类囊胚79例报告

目的探讨玻璃化冷冻保存技术在人类囊胚冷冻复苏中的应用效果。方法将接受体外受精-胚胎移植患者第5天（D5）或第6天（D6）所获得的剩余囊胚进行Cryotop玻璃化冷冻保存,分析囊胚复苏后的复苏率、妊娠率及种植率等指标。结果玻璃化法冷冻囊胚共224个周期、543个囊胚;玻璃化冷冻复苏79个周期、142个囊胚、存活116个（81．7％）;移植70个周期、116个囊胚,临床妊娠25个周期（35．7％）,其中4例流产（16％）,3例足月分娩3个正常新生儿,18例继续妊娠。结论Cryotop玻璃化冷冻法适于人类囊胚的冷冻保存,获得较理想的复苏率、妊娠率和种植率,流产率没有明显提高,在临床中值得应用和推广。     

冻融囊胚移植后临床结局分析

目的比较第5天（D5）和第6天（D6）囊胚期玻璃化冻融胚胎移植的临床结局,分析自然周期和替代周期对囊胚期冻融胚胎移植的影响。方法将移植后剩余胚胎进行囊胚培养至D5或D6后行玻璃化冻融,比较囊胚复苏后的临床妊娠率、自然流产率及种植率等指标。结果D5组解冻154个囊胚,153个存活,复苏存活率99．4％;D6组解冻100个囊胚,99个存活,复苏存活率99％,两组复苏存活率无显著性差异（P〉0．05）。总临床妊娠率D5组（54．4％）显著高于D6组（20％）（P〈0．01）。自然流产率D5组为6．1％,而D6组则为9．1％,两组相比,无统计学差异（P〉0．05）。种植率D5组（41。2％）,显著高于D6组（11．1％）（P〈0．01）。替代周期组（HRT）和自然周期组（NC）相比,NC组的临床妊娠率及种植率均高于HRT组,但均无显著性差异（P〉0．05）。结论D5囊胚冷冻复苏后移植能获得较好的妊娠结局,内膜准备方法不同即替代周期和自然周期对临床结果并无影响。     

冷冻环玻璃化法冷冻小鼠卵母细胞的效果评价

目的评价ED15(15%ethylene glycol,EG+15%dimethylsulphoxide,DMSO)冷冻环玻璃化法冻存小鼠成熟卵母细胞的效果,以及对其纺锤体形态、染色体分布和发育潜能的影响。方法分别以小鼠新鲜成熟卵母细胞为对照组,玻璃化冷冻复苏卵母细胞为冷冻组。玻璃化冷冻以冷冻环为载体,以乙二醇(EG)及二甲亚砜(DMSO)联合作冷冻保护剂。解冻后观察细胞存活情况并对解冻后培养0、1、2h的卵母细胞行纺锤体及染色体免疫荧光染色,激光共聚焦扫描显微镜观察;其余卵母细胞行体外受精培养,计算受精率、囊胚形成率。结果冷冻组成熟卵母细胞存活率为98.2%,复苏后卵母细胞培养0、1、2h的纺锤体形态正常率及染色体分布正常率与对照组比较无显著性差异(分别为87.0%、90.9%、90.3%vs95%,P>0.05;91.3%、95.4%、93.5%vs90%,P>0.05);冷冻组受精率及囊胚形成率与对照组比较均无显著性差异(81.3%vs85.2%,P>0.05;76.1%vs75.4%,P>0.05)。结论ED15冷冻环玻璃化法冻存小鼠成熟卵母细胞复苏存活率高,对其纺锤体形态、染色体分布及发育潜能无明显影响。     

玻璃化技术冷冻人类囊胚和单胚胎移植

玻璃化冷冻技术简化了胚胎冷冻程序,提高了各个阶段胚胎的冷冻保存效果,尤其是对程序化冷冻效果差的囊胚的冷冻保存,是最具有前景的胚胎冷冻方法。囊胚移植和单胚胎移植被认为是提高种植率、降低多胎妊娠率的有效方法。本文就玻璃化冷冻的影响因素和囊胚玻璃化冷冻进展综述如下。     

囊胚玻璃化冷冻保存时长对复苏移植临床结局的影响

目的研究使用开放式载体玻璃化冷冻保存囊胚的时长对复苏移植妊娠结局和新生儿结局的影响,探讨胚胎经过玻璃化冷冻并进行6年以上的长期保存是否对临床结局产生负面影响。方法回顾性分析2006年3月至2018年12月期间在我院生殖中心进行囊胚玻璃化冷冻复苏移植的2 643例患者的临床资料。按照胚胎玻璃化冷冻保存时长将其分为7组:≤1年,1～2年,2～3年,3～4年,4～5年,5～6年和≥6年,比较各组患者一般情况、临床结局、活产情况和单胎新生儿出生结局之间的差异,再使用二分类Logistic回归分析女性取卵年龄、移植年龄、胚胎冷冻保存时间、囊胚冷冻日期和囊胚级别对妊娠率和活产率的影响。结果各组患者取卵年龄、移植年龄、优胚率、复苏胚胎存活率、妊娠率和活产率组间差异有统计学意义(P<0.05)。各组平均移植胚胎数、D5胚胎比例、种植率、流产率、异位妊娠率、单胎率、出生男孩率、出生缺陷率、单胎出生体重、身长和孕天数均无统计学差异(P>0.05)。Logistic回归分析显示取卵年龄、移植年龄和冷冻保存时间对妊娠率无显著影响(P>0.05),取卵年龄和冷冻保存时长对活产率无显著影响(P&...     

玻璃化冻融小鼠囊胚的超微结构观察

目的观察冻融小鼠囊胚的超微结构改变情况,研究冷冻对囊胚的冷冻损伤。方法采用6组玻璃化溶液对小鼠囊胚进行冷冻保存,复苏后通过透射电镜观察超微结构改变情况。结果各组小鼠囊胚均表现相似的超微结构损伤:线粒体肿胀、粗面内质网脱颗粒、高尔基复合体扩张、含有絮状物或膜性结构的小泡增多、微丝结晶的出现、细胞间紧密连接和桥粒减少。结论冷冻对于小鼠囊胚的冷冻损伤主要是细胞膜性结构和细胞骨架系统的损伤。     

冻融周期单囊胚移植的影响因素

人类辅助生殖技术的最终目的是让不孕不育夫妇获得一个健康的孩子。多胎妊娠被认为是一种并发症,而不是成功的助孕结果。如何有效避免双胎妊娠同时维持总体妊娠率一直是辅助生殖治疗中面临的重要挑战之一。选择性单囊胚移植是即能降低多胎率又能有效维持总体临床妊娠率的有效手段。胚胎冷冻保存作为人类辅助生殖技术不可缺少的一部分,在增加移植机会、提高每个取卵周期的累积妊娠率、减少卵巢过度刺激等方面起着重要作用。然而,目前关于冻融周期如何降低多胎率的报道甚少,许多问题有待深入研究。     

Intramatrix events during cryopreservation of porcine articular cartilage using rapid cooling.

Cryopreservation of articular cartilage may improve long-term transplantation results if cell and matrix integrity can be maintained. This study examined intramatrix events in intact porcine articular cartilage that occurred during a rapid-cooling technique with various concentrations of dimethyl sulfoxide (DMSO) (1, 3, 5, 6 and 7 M). Thermocouples were inserted into the solution and in the cartilage matrix to record the temperature during rapid cooling. In addition, scanning electron microscopy of freeze-substituted samples was performed and quantitatively evaluated for the areas representing ice in the matrix. The results of this study showed that low concentrations of DMSO resulted in the largest temperature gradient between the matrix and the surrounding solution, which occurred near the freezing point of the cryoprotectant solution. At higher concentrations of DMSO, the peak temperature gradient occurred near the glass transition temperature. The temperature measurements suggested that a significant amount of ice formed within the matrix at lower DMSO concentrations. At higher DMSO concentrations that resulted in vitrification of the external solution, there was evidence of some ice in the matrix. The scanning electron micrographs demonstrated significantly more matrix disruption (likely due to ice formation) (P<0.02) in the lower DMSO concentrations (1 and 5 M) while the 6 M DMSO concentration demonstrated minimal matrix disruption. Cryopreservation of articular cartilage with a rapid-cooling technique and high concentrations of DMSO resulted in partial vitrification of the matrix and significantly less matrix disruption. It appears that successful cryopreservation of viability and function in articular cartilage will require high concentrations of cryoprotectants and rapid cooling.     

兔卵巢组织慢速冷冻和玻璃化冷冻保存方法的研究

目的比较不同冷冻方法对兔卵巢组织的保存效果。方法15只新西兰雌兔,取卵巢皮质切块后,随机分成5组：新鲜组（A组）、二甲亚砜慢速冷冻组（B组）、丙二醇慢速冷冻组（C组）、冷冻管玻璃化冷冻组（D组）及固相表面玻璃化冷冻组（E组）。比较各组卵巢组织的原始和初级卵泡形态正常率;通过体外培养测定培养液中雌二醇（E2）水平;比较冻融后卵巢组织的内分泌功能;通过TdT介导的dUTP缺口末端标记技术,检测细胞凋亡情况。结果原始卵泡正常形态率与A组相比,B、D组显著降低（P〈0.05）,C、E组无显著性差异;初级卵泡正常形态率5组间无显著性差异。培养14d后,各实验组原始卵泡形态正常率均低于A组（P〈0.001）,各实验组间无显著性差异;组间初级卵泡形态正常率无明显差异。体外培养过程中,培养液E水平不断增加（P〈0.001）,慢速冷冻和玻璃化冷冻的E2平均浓度有显著性差异（P〈0．05）。细胞凋亡检测显示,无论是原始卵泡还是初级卵泡,与A组相比,各实验组的卵泡凋亡率均无显著性差异。结论本实验中,慢速冷冻和固相表面玻璃化冷冻均能很好地保存兔卵巢组织,经过体外培养,能保持一定的内分泌功能。     

在OHSS高危患者中卵裂期胚胎移植与囊胚移植的临床结局分析

目的比较卵裂期胚胎移植与囊胚移植在卵巢过度刺激综合征(OHSS)高危患者首次冷冻复苏周期中应用的临床结局。方法回顾性分析2014年1月至2015年6月在本中心进行体外受精的首次冷冻复苏周期OHSS高危患者,均有卵裂期胚胎冷冻和囊胚冷冻,总例数为232例,将卵裂期胚胎移植组设为A组共84例,囊胚移植组设为B组共148例;分析两组患者年龄、体重指数、基础激素水平、内膜厚度及临床结局。结果 A组患者84例,行卵裂期胚胎移植,临床妊娠61例,临床妊娠率72.62%;B组患者148例,临床妊娠125例,临床妊娠率84.46%,临床妊娠率有统计学差异(P0.05)。两组患者的年龄、基础激素水平、体重指数、内膜厚度均无统计学意义(P0.05)。结论在体外受精-胚胎移植中,OHSS高危患者可以优先考虑囊胚移植。     

Large volume cryoprotectant‐free vitrification: an alternative to conventional cryopreservation for human spermatozoa

Vitrification is a simple and cost‐effective method for the storage of human spermatozoa without the use of conventional cryoprotectants, by plunging the sperm suspension directly into liquid nitrogen. As a result, solidification of living cells without the formation of ice crystals is achieved during cooling. This study aimed to compare cryoprotectant‐free vitrification to conventional cryopreservation protocols. Semen samples (n = 35) were collected from patients seeking diagnostic assistance at the Reproductive and Endocrine Unit at Steve Biko Academic Hospital. Samples were processed using a discontinuous density‐gradient centrifugation method. Washed samples were split into two aliquots and cryopreserved either by means of cryoprotectant‐free vitrification (sucrose + 1% albumin) or conventional slow freezing (TEST‐yolk buffer). Post‐thawing, the sperm motion parameters, mitochondrial membrane potential (Δψm) and DNA fragmentation were compared between the two groups. No significant differences were observed in the sperm motility parameters (P > 0.05). Significantly higher percentages of Δψm (11.99% ± 4.326% versus 6.58% ± 1.026%; P < 0.001) and lower percentages of DNA fragmentation (2.79% ± 1.017% versus 3.86% ± 1.38%; P < 0.01) were observed when comparing cryoprotectant‐free vitrification to conventional cryopreservation. Cryoprotectant‐free vitrification is a rapid and promising alternative to conventional methods resulting in good‐quality spermatozoa post‐thaw.     

不同阶段小鼠囊胚玻璃化冷冻保存效果观察

目的探讨合适玻璃化冷冻保存的小鼠囊胚发育阶段。方法对575枚小鼠初级囊胚和577枚扩张囊胚分别采用六组玻璃化溶液进行玻璃化冷冻,比较不同阶段囊胚的冷冻保存效果。结果各组初级囊胚存活率和孵出率均高于扩张囊胚。除ES35组外,各组初级囊胚存活率均显著高于扩张囊胚（P〈0．05）;EDS35、ESF20和EDSF20组的初级囊胚的孵出率均显著高于扩张囊胚（P〈0．05）。结论初级囊胚较扩张囊胚更适合玻璃化冷冻保存。     

冻融周期移植不同时间囊胚的新生儿结局比较

目的比较D5和D6的冻融囊胚移植后的新生儿结局,进一步为复苏囊胚的选择提供指导。方法回顾性分析2005年1月至2012年12月在北京协和医院辅助生育中心进行复苏囊胚移植并已分娩的515例患者资料。按照冷冻前形成囊胚的时间D5或D6进行分组,比较两组的新生儿出生结局;并根据分娩胎数将患者分为单胎组和双胎组,分别比较单胎组和双胎组的新生儿结局。结果 (1)单胎组:D5组的孕龄、出生体重和出生身长分别为(266.5±14.5)d、(3 387.4±584.8)g和(50.1±2.7)cm,与D6组[分别为(268.5±12.6)d、(3 379.7±540.8)g和(50.1±2.1)cm]相比均无统计学差异(P0.05);D5组男女性别比略高于D6组(1.21vs.1.08),但无统计学差异(P0.05)。(2)双胎组:D5组新生儿的孕龄、出生体重和出生身长与D6组相比亦均无统计学差异(P0.05),但D5组新生儿的出生体重[(2 531.0±505.4)g]略低于D6组[(2 601.8±503.0)g];D5组的低体重新生儿发生率(42.3%)高于D6组(31.4%),但无统计学差异(P0.05);D5组的男女性别比(1.20)高于D6组(0.92),但无统计学差异(P0.05)。结论在单胎组或双胎组,D5与D6的囊胚冻融移植后出生的新生儿孕周、出生体重和体长均无统计学差异,但是呈现出D6组新生儿体重偏大的趋势;D5组的男女性别比高于D6组,但由于例数所限,未出现统计学差异,还有待于进一步研究。     

不同卵巢组织冷冻方法对保存女性生育力的研究

目的比较程序化冷冻和玻璃化冷冻两种方法保存人卵巢组织,解冻后组织病理分析原始卵泡存活情况。方法卵巢组织取自15例卵巢畸胎瘤患者,卵巢皮质切割成10mm×1mm×1mm的组织条随机分配到玻璃化冷冻组（A组）、程序化冷冻组（B组）、新鲜对照组（C组）,组织病理分析比较三组原始卵泡形态的影响。结果三组共有572个原始卵泡,C组中96．9％的原始卵泡保持形态学正常,A和B组分别为85．6％与83．9％,差别有统计学意义（P〈0．01）;A与B组比较,差别没有统计学意义（P〉0．05）。结论尽管冻融后组织的原始卵泡存活率小于新鲜组织,玻璃化冷冻与程序化冷冻方法都能较好地保存人类卵巢组织,可用于人类卵巢组织的冷冻保存。     

玻璃化冻融胚胎保存时间对胚胎复苏结局的影响

目的探讨辅助生殖技术中影响玻璃化冻融胚胎保存时间对胚胎复苏结局的影响。方法将复苏后全部卵裂球存活的胚胎定义完全存活胚胎。对367个冻融胚胎移植（FET）周期的相关资料进行回顾性统计学分析,根据冻融胚胎保存时间进行分组,分为〈6、≥6-〈12及≥12～19个月A、B、C3组,比较各组的胚胎复苏率、完全存活胚胎率、胚胎种植率和临床妊娠率。结果三组患者的胚胎复苏率、完全胚胎存活率、胚胎种植率及临床妊娠率,组间比较均无显著性差异（P〉0．05）。结论在玻璃化FET周期,胚胎冷冻保存时间对解冻后胚胎质量及FET结局没有影响,因此可以灵活掌握FET时间。     

不采用冷冻保护剂的玻璃化法与常规冷冻法对人精子冷冻复苏效果的比较

目的比较不采用冷冻保护剂的玻璃化法与常规冷冻法对人精子冷冻复苏的效果。方法将15份上游后的精液标本分别采用常规精子冷冻和不使用冷冻保护剂的冷冻环玻璃化法冷冻,比较精子复苏后的活力、形态及精子膜的完整性三项指标。结果冷冻前、前向活动精子百分率、正常精子形态百分率及精子膜完整率分别为(79±6.42)%、(34±9.36)%和(91±5.18)%;不采用冷冻保护剂的玻璃化法冷冻复苏后,三者分别为(42.20±8.35)%、(31.00±7.63)%和(50.00±9.34)%。常规冷冻法冷冻复苏后,三者分别为(38.00±15.80)%、(30.00±5.24)%和(47.00±13.67)%。冷冻前后前向活动精子百分率和精子膜完整率的差别有统计学意义,但两种冷冻方法相比差异无统计学意义。结论使用不加入冷冻保护剂的玻璃化方法冷冻人的精子是可行的,可取得与常规冷冻相同的效果。     

不同玻璃液冻存卵巢组织移植于鸡胚前后的氧化应激和细胞凋亡研究

目的研究不同玻璃液(VS)保护下冻存的卵巢组织移植于鸡胚前后的氧化应激和细胞凋亡情况,以评估不同玻璃液的冷冻保护效果。方法将卵巢组织分割成1~2mm×1mm×1mm的小块分别放入VS1、VS2、VS3、VS4 4种不同的玻璃液中,经过4种玻璃液平衡后冻存并复苏的卵巢组织称为冻存卵巢组织(FOT),分别将经4种玻璃液冻存的FOT移植到胚龄10d的鸡卵绒毛尿囊膜(CAM)上培养,于鸡卵胚龄16d取出移植于CAM的卵巢组织(TOT),以未经玻璃液平衡的新鲜卵巢组织为对照(COT),分析4种玻璃液保存的FOT、TOT、COT中线粒体活性、细胞内活性氧自由基(ROS)水平和间质细胞凋亡情况。结果线粒体活性:经过VS1、VS3和VS4冻存的FOT和TOT中的线粒体活性低于COT,差异有统计学意义(P0.05);经VS2冻存的TOT与COT中线粒体活性无显著性差异(P0.05)。细胞内ROS水平:经过VS1、VS3和VS4冻存的FOT和TOT细胞内ROS水平低于COT,有统计学差异(P0.05);经VS2冻存的FOT细胞内ROS水平与COT组比较无显著性差异(P0.05)。间质细胞凋亡情况:经过VS1、VS2、VS3和VS4平衡的FOT间质细胞凋亡率和COT组之间的差异无统计学意义(P0.05)。结论由玻璃液VS2保护冻存卵巢组织的冷冻损伤小、移植后缺血损伤轻,是本研究优化的卵巢冷冻保护玻璃液;玻璃化冷冻对间质细胞损伤小,适于人卵巢组织的冷冻保存。