甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

人类偏肺病毒F基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人类偏肺病毒融合蛋白(F)基因的真核表达质粒,并在昆虫细胞sf-9中表达.方法:采用RT-PCR法扩增人类偏肺病毒A亚型CAN97-83 F基因的全长序列,将其插入供体质粒pFastBacHT载体多克隆位点区,经酶切鉴定后转化大肠杆菌DH10bac.供体质粒与受体杆粒(Bacmid)发生位点特异性转座获得重组的杆粒.采用脂质体将重组杆粒转染进昆虫细胞sf-9,包装获得感染性杆状病毒.用此病毒感染sf-9细胞并表达蛋白,经6×His树脂纯化后用免疫印迹法验证表达蛋白.结果:PCR及序列分析证实所获得的重组杆粒包含hMPV全长F基因序列,被重组杆状病毒感染的昆虫细胞sf-9显示典型细胞病变.采用抗6×His单克隆抗体为一抗,免疫印迹法检测到分子量约70ku的较单一的蛋白条带,证实F蛋白表达成功.结论:杆状病毒是一高通量、目标蛋白抗原性保存完好的表达系统.采用这一系统成功表达的hMPV F蛋白,将为我国hMPV血清流行病学和免疫发病机理研究奠定基础.     

大肠癌新型CEA疫苗重组杆状病毒的表达与鉴定

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建新型CEA融合表位疫苗(以HPV16L1为蛋白载体)的重组杆状病毒.方法构建含有HPV16L1片段和CEA-PADRE合成片段的表达载体pFastBacl-Ⅴ,转化DH1OBac感受态菌.利用其含有的细菌Tn7转座系统,将该基因重组至杆状病毒穿梭质粒bacmid中,转染昆虫细胞sf9,获得新型CEA疫苗的重组杆状病毒.结果限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明目的片断正确克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中;重组杆状病毒感染昆虫细胞后,PCR检测可以扩增出相应大小的片段.结论利用杆状病毒表达系统,成功构建了CEA融合表位疫苗的重组杆状病毒,为进一步的研究奠定了基础.     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT-PCR扩增CSFV E2基因,将PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体,将该基因插入到pFast-BacHT A载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119 bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×103,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFV E2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。     

EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒的构建

目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HP1基因;HP1基因与载体pFastBac1连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组穿梭杆粒HP1-bacmid;提取纯化重组杆粒转染Sf9细胞,收获重组杆状病毒;以SDS-PAGE、Western blot进行重组蛋白鉴定。结果成功合成HP1基因;完成HP1与pFastBac1载体连接;获得了重组穿梭杆粒HP1-bacmid;并通过转染Sf9细胞,获得具有感染活性的重组杆状病毒;SDS-PAGE电泳结果显示重组病毒感染的Sf9细胞表达了大小约为100×103 Mr的目的蛋白条带,经Western blot鉴定,该条带能与EV71单克隆抗体特异结合。结论成功构建了EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒,为下一步EV71/CA16联合P1蛋白的免疫鉴定奠定基础,并为兼抗EV71、CA16疫苗的研究提供参考。     

基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备及初步鉴定

目的通过杆状病毒表达系统表达制备基孔肯雅病毒(CHIKV)病毒样颗粒并进行初步鉴定。方法首先将基孔肯雅病毒的结构蛋白基因C-E3-E2-6K-E1克隆入p Fast-Bac~(TM) Dual转移载体中并鉴定;然后将构建正确的重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞后提取重组杆粒并鉴定;再将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒,并利用免疫荧光法(IFA)鉴定其感染Sf9细胞后E2蛋白的表达;最后通过透射电镜(TEM)和Western-Blot鉴定CHIKV病毒样颗粒。结果成功获得了含有CHIKV结构蛋白基因的重组杆状病毒,该重组病毒经过IFA及WB验证在昆虫细胞中能够表达CHIKV的E蛋白,并在电镜下观察到了直径约60~80 nm的CHIKV病毒样颗粒。结论通过杆状病毒表达系统成功表达并获得CHIKV的病毒样颗粒,为CHIKV早期快速检测法的建立奠定基础。     

人VEGF基因昆虫杆状病毒表达载体的构建

为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有穿梭载体杆粒 (Bacmid)的DH1 0Bac感受态细胞 ,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacmid/VEGF ,采用琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增对重组转座载体、穿梭载体进行鉴定。将Bacmid/VEGF转染sf 9细胞 ,进行病毒重组及噬斑筛选。结果 :琼脂糖电泳得到杆粒 (Bacmid)DNA条带 ,PCR扩增得到 5 75bp的VEGF片段 ,病毒液在 1 0 - 7稀释度时出现噬斑 ,约 5 0个 /孔。说明已成功构建了重组杆状病毒穿梭载体并重组出杆状病毒。     

抑癌基因P16INK4在sf9细胞中的表达和鉴定

目的：利用杆状病毒表达系统在体外表达抑癌蛋白P16,为研究P16蛋白的结构与功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定基础。方法：（1）利用定向克隆的方法将P16全基因序列插入转移载体pSX-IVVI^ X3的EcoRI,SalI位点上,经氨苄青霉素平板初筛,菌落原位杂交、PCR扩增酶切电泳鉴定后,分离含P16的重组转移载体-pSXIVVI^ X3-16;（2）用昆虫杆状病毒TnNPV-SVI-G感染sf9细胞扩增病毒,用PEG法沉淀病毒、酚/氯仿抽提纯化病毒DNA;（3）CaCl2沉淀法使重组转移载体-pSXIVVI^ X3-16和病毒TnNPV-SVI-GDNA共转染sf9细胞,通过多角体观察和PCR法鉴定重组病毒;（4）经空斑纯化法纯化重组病毒,重组病毒感染草地夜蛾细胞（sf9)使P16大量表达,经SDS-PAGE及WesternBlot鉴定所表达的P16蛋白,结果：（1）筛选出两株含P16全基因的重组转移载体-pSXIVVI^ X3-16;（2）构建了含P16全基因序列的重组杆状病毒TnNPV-p16;(3)SDS-PAGE电泳显示重组病毒TnNPV-P16感染sf9细胞的培养上清及胞体裂解物和阳性对照Hela细胞裂解物在16kD左右均有蛋白条带,而阴性对照TnNPV-SVI-G感染的sf9细胞培养上清中无此蛋白条带,经免疫印迹染色证实此蛋白为抑癌蛋白P16。结论：利用我国自己构建的昆杆状病毒表达系统成功了表达P16蛋白,分子量大小及特异性与国外报道相同。     

小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究

目的构建小鼠β防御素6（mBD6）与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法（overlap-PCR）将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e。将其插入载体pcDNA3．1（＋）,构建成pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e。鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌。免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达。结果融舍基因mBD6-M2e真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖。免疫小鼠细胞因子表达改变。结论融合基因mBD6-M2e真核表达载体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。     

抑癌基因P16INK4在sf9细胞中的表达和鉴定

目的利用杆状病毒表达系统在体外表达抑癌蛋白P16,为研究P16蛋白的结构与功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定基础.方法①利用定向克隆的方法将P16全基因序列插入转移载体pSX-IVVI+X3的EcoRI、Sall位点上,经氨苄青霉素平板初筛、菌落原位杂交、PCR扩增酶切电泳鉴定后,分离含P16的重组转移载体一pSXIVVI+X3.16;②用昆虫杆状病毒TnNPV-SVI-G感染sf9细胞扩增病毒,用PEG法沉淀病毒、酚/氟仿抽提纯化病毒DNA;③CaCl2沉淀法使重组转移载体一pSXIVVI+X3-16和病毒TnNPV-SVI-G DNA共转染sf9细胞.通过多角体观察和PCR法鉴定重组病毒;④经空斑纯化法纯化重组病毒,重组病毒感染草地夜蛾细胞(sf9)使P16大量表达,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定所表达的P16蛋白.结果①筛选出两株含P16全基因的重组转移载体-pSXIVVI+X3-16;②构建了含P16全基因序列的重组杆状病毒TnNPV-p16;③SDS-PAGE电泳显示重组病毒TnNPV-P16感染sf9细胞的培养上清及胞体裂解物和阳性对照Hela细胞裂解物在16kD左右均有蛋白条带,而阴性对照TnNPV-SVI-G感染的sf9细胞培养上清中无此蛋白条带,经免疫印迹染色证实此蛋白为抑癌蛋白P16.结论利用我国自己构建的昆杆状病毒表达系统成功了表达P16蛋白,分子量大小及特异性与国外报道相同.     

禽流感病毒H5N1血凝素基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的 应用杆状病毒-昆虫细胞表达体系克隆及表达禽流感病毒H5Nl血凝素H5抗原,鉴定其抗原性和生物活性.方法 PCR扩增禽流感病毒H5全长基因序列,克隆、转化制备重组杆状病毒Bacmid质粒,通过转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白表达.采用细胞免疫荧光、Western blotting和血凝试验分别对表达的蛋白进行抗原性和生物活性分析.结果 在昆虫细胞中成功表达禽流感病毒重组his-H5蛋白,其相对分子质量约为64 000,与豚鼠红细胞能够发生凝集反应,免疫荧光与Western blotting结果提示该重组蛋白能够与禽流感病毒H5标准血清中的抗体特异性结合.结论 经杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得的重组his-H5抗原具备天然的生物活性和抗原性,该方法为进一步研究禽流感病毒血凝素抗原生物学特性以及制备亚单位疫苗、相关抗体奠定了基础.     

人源性纤溶酶原Kringle 5基因杆状病毒表达载体构建及蛋白表达纯化

目的 构建重组人源性纤溶酶原Kringle 5(rhK5)杆状病毒表达载体并进行真核表达.方法 采用bac-to-bac杆状病毒表达系统制备杆状病毒Bacmid-rhK5,感染草地贪夜蛾卵巢细胞sf21昆虫细胞,经Western blot确定rhK5在sf21细胞中的表达方式和表达量.用血管内皮细胞抑制实验检测纯化蛋白活性.结果 杆状病毒表达载体pFastBac HTB-rhK5构建成功,Western blot检测发现,rhK5在sf21细胞中呈胞内表达,纯化后重组蛋白的产量约为90μg/L.血管内皮细胞抑制实验显示,半数有效剂量(ED50)为4μg/Ml.结论 rhK5杆状病毒表达载体于悬浮培养的sf21细胞中高效表达,为大量表达更接近天然的具有生物学活性的rhK5蛋白奠定了基础.     

人源性纤溶酶原Kringle5基因杆状病毒表达载体构建及蛋白表达纯化

目的构建重组人源性纤溶酶原Kringle 5(rhK5)杆状病毒表达载体并进行真核表达。方法采用bac-to-bac杆状病毒表达系统制备杆状病毒Bacmid-rhK5,感染草地贪夜蛾卵巢细胞sf21昆虫细胞,经Western blot确定rhK5在sf21细胞中的表达方式和表达量。用血管内皮细胞抑制实验检测纯化蛋白活性。结果杆状病毒表达载体pFastBac HTB-rhK5构建成功,Western blot检测发现,rhK5在sf21细胞中呈胞内表达,纯化后重组蛋白的产量约为90μg/L。血管内皮细胞抑制实验显示,半数有效剂量(ED50)为4μg/mL。结论rhK5杆状病毒表达载体于悬浮培养的sf21细胞中高效表达,为大量表达更接近天然的具有生物学活性的rhK5蛋白奠定了基础。     

HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

目的：在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒（HSV-2）糖蛋白D（gD2）胞外区基因,检测其免疫原性。方法：以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒（P4）,通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠（gD2组）,以PBS作为阴性对照（PBS组）,ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果：PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×10⁹ pfu·mL^-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。     

甲型流感病毒DNA疫苗双表达载体的构建及表达

目的： 构建含有甲型流感病毒M2基因与GM-CSF基因的DNA疫苗双表达载体,为研究甲型通用流感疫苗奠定基础。方法： 将甲型流感病毒（H1N1）接种鸡胚后收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增M2基因;将微小病毒内部核糖体进入位点（IRES）基因插入到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将M2基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点,构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,酶切鉴定后测序;脂质体法转染COS7细胞并检测目的蛋白的表达。结果： 成功扩增出M2基因（约300 bp）、IRES基因(约580 bp)和GM-CSF基因(约400 bp),酶切鉴定结果表明构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,Western blotting检测证明流感病毒M2蛋白的表达。结论：成功构建出流感病毒DNA疫苗双表达载体pMIG。     

人源性纤溶酶原Kringle5基因杆状病毒表达载体构建及蛋白表达纯化

目的构建重组人源性纤溶酶原Kringle5（rhK5）杆状病毒表达载体并进行真核表达。方法采用bac-to—bac杆状病毒表达系统制备杆状病毒Bacmid—rhK5,感染草地贪夜蛾卵巢细胞sf21昆虫细胞,经Westernblot确定rhK5在sf21细胞中的表达方式和表达量。用血管内皮细胞抑制实验检测纯化蛋白活性。结果杆状病毒表达载体pFastBacHTB-rhK5构建成功,Westernblot检测发现,rhK5在sf21细胞中呈胞内表达,纯化后重组蛋白的产量约为90μg／L。血管内皮细胞抑制实验显示,半数有效剂量（ED50）为4μg／mL。结论rhK5杆状病毒表达载体于悬浮培养的sf21细胞中高效表达,为大量表达更接近天然的具有生物学活性的rhK5蛋白奠定了基础。     

Bruton酪氨酸激酶在昆虫细胞中表达的初步研究

用杆状病毒表达载体系统表达小鼠llruton酪氨酸激酶（Brutontyro。mekina。e,Bib）．构建重组转染载体时,于Bib起始码的L游插人了一段H902序列．用重组转染载体、苗猪夜蛾核型多角体病毒线性DNA和质脂体共转染Sfg昆虫细胞,经过对重组杆状病毒三轮扩增后,用H902抗体检测表明,昆虫细胞中Bib的表达已达最高水平．对表达后Bib自身磷酸化检测表明,该激酶具有自身磷酸化活性．从而证实Bib在昆虫细胞中的表达获得了成功．Bruton酪氨酸激酶在昆虫细胞中表达的初步研究@何扬举     

狂犬病病毒糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性分析

目的:利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆?表达?纯化,并对重组 RVG 进行免疫学特性鉴定?方法:参照 GenBank 收录的狂犬病病毒 CVS-11 株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因?RVG 基因经BamHⅠ/KpnⅠ 双酶切后定向克隆到 pFastBac-GP67B 载体上,阳性重组转座质粒进一步转化E.Coli DH10Bac 感受态细胞,经蓝白斑筛选及 PCR 鉴定后获得重组穿梭载体 rBacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达?His-TrapHP 纯化目的蛋白,SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定?重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性?结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000?经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性?结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础?     

ED-L2-LMPl-EGFP融合基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鏊定EB病毒LMPl基因和增强型绿色荧光蛋白基因融合慢病毒表达载体.方法 应用DNA重组技术,将EB病毒ED-L2启动子和LMP1基因克隆到带有EGFP基因的FUGW慢病毒表达载体上,筛选阳性克隆,经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组载体后,以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV△8.9、包膜基因VSVG和带目的 基因ED-L2-LMP1-EGFP载体共同转染到293FT包装细胞内包装病毒,荧光显微镜下观察包装细胞报告基因表达情况,收集病毒上清、浓缩鉴定、测定重组病毒的滴度.PCR和免疫组化鉴定LMP1表达.结果 融合慢病毒表达载体质粒限制性酶切分析证实有782 bp的ED-L2和1 300 bp的LMP1基因片段基因片段插入到慢病毒栽体中.转染重组ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒融合载体的细胞于荧光显微镜下呈绿色荧光;对该细胞PCR可以扩增出404 bp大小的LMP1基因片段和370 bp的EGFP基因片断;免疫组化证明LMP1蛋白在转染细胞表达阳性.结论 成功构建了ED-L2-LMP1-EGFP基因的慢病毒表达载体,为进一步在体研究LMP1基因的功能奠定了基础.     

TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白在杆状病毒系统中的表达

目的：构建TGF－βRⅡ／Fc融合蛋白的杆状病毒表达系统，并使之成功表达。为将来TGF－βRⅡ／Fc融合蛋白在肺间质纤维化基因治疗中的应用奠定基础。方法：采用分子克隆技术构建Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统；采用DNA脂质体转染技术和昆明细胞培养技术培养和扩增Bac-TRⅡ重组病毒颗粒；采用免疫荧光技术和免疫印迹法检测目的蛋白的表达。结果：在重组的Bac-TRⅡ杆状病毒感染的sf9细胞中可以检测到目的蛋白的表达。结论：重组的Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统可以用于正确表达TGF－βRⅡ／Fc融合蛋白。由于杆状病毒表达系统效率较高，因此，今后可利用该系统进行目的蛋白的纯化及进一步的实验研究。