骨形态发生蛋白-2基因的克隆及重组真核表达质粒的构建

目的 克隆骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因,并构建重组BMP-2基因真核表达质粒.方法 从兔骨髓细胞中分离提取BMP-2的mRNA,RT-PCR扩增后,克隆入pGEM-T载体,PCR鉴定重组子;酶切下目的 基因BMP-2,再亚克隆入载体pEGFP-C3质粒,酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析.结果 经过RT-PCR扩增得到BMP-2cDNA条带:PCR扩增鉴定得到pGEM-T-BMP-2.酶切鉴定得到亚克隆重组子pEGFP-C3-BMP-2,经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致.结论 成功克隆兔BMP-2基因,构建出重组真核表达载体BMP-2,为进一步采用BMP-2基因治疗关节软骨缺损奠定了实验基础.     

凋亡素基因诱导乳腺癌细胞株凋亡的体内外实验研究

目的构建凋亡素基因(vp3)重组真核表达质粒(pcDvp3),观察vp3基因在人乳腺癌细胞435中的表达及诱导凋亡作用,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。方法(1)克隆vp3基因并与pcDNA3.1质粒连接构建pcDvp3重组真核表达载体,测序鉴定;(2)用脂质体将pcDvp3和pcDNA3.1转染人乳腺癌细胞435,48h后分别用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡;(3)建立人乳腺癌细胞435的裸鼠模型,分组给药后测定抑瘤率,并用原位凋亡(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果(1)核酸序列分析表明已构建成重组质粒pcDvp3;(2)pcDvp3转染肿瘤细胞48h后,电镜下可见明显形态改变及凋亡小体形成;琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带;流式细胞仪检测出现凋亡峰,其凋亡百分率高达14.42%;(3)裸鼠实验可见pcDvp3组抑瘤率分别为65.52%和68.23%,明显高于pcDNA3.1组(t=4.06,P<0.01),TUNEL检测可见pcDvp3组肿瘤细胞凋亡。结论vp3基因在体内外均能够有效地诱导人乳腺癌435细胞凋亡。     

携带SKP2基因的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建含人SKP2基因不同位点的一系列shRNA真核表达质粒，并进行酶切鉴定、测序。方法:设计合成3对SKP2基因干扰寡核苷酸序列，形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pSIREN-RetroQ载体，构建成能产生SKP2短发卡RNA的质粒。结果:构建的核苷酸序列经鉴定构建成功，能成功的克隆入带有pSIKEN RetroQ的载体中。结论:成功构建并鉴定了针对人SKP2基因3个不同位点的shRNA的真核表达质粒，为SKP2为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

凋亡素基因在人乳腺癌细胞中的表达及诱导凋亡作用

目的 构建pcDvp3重组真核表达质粒，并观察凋亡素基因(vp3)在人乳腺癌细胞一435中的表达及诱导凋亡作用。方法 (1)扩增vp3基因，与pcDNA3．1连接构建pcDvp3重组真核表达载体，并测序；(2)将pcDvp3和pcDNA3．1转染Hela细胞，免疫荧光技术检测凋亡素蛋白表达；(3)将pcDvp3和pcDNA3．1空质粒转染人乳腺癌细胞435和正常细胞，转染48h后用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果 (1)核酸序列分析证明克隆的vp3基因与文献报道一致，且正确插入载体中，表明真核表达载体pcDvp3构建成功；(2)转染pcDvp3的Hela细胞48h后可见明显的荧光，而pcDNA3．1组未见；(3)电镜可见细胞明显形态改变及凋亡小体形成；电泳见典型梯形条带；流式细胞仪检测出现凋亡峰，于转染48h后达最高，凋亡百分率为14．42％；而转染pcDNA3．1细胞未见上述改变。结论 vp3在体内能够表达并有效地诱导人乳腺癌．435细胞凋亡。     

Apoptin对前列腺癌细胞的促凋亡作用研究

目的构建野生型及变异型apoptin的真核表达质粒pApoptin-EGFP、pM-apoptin-EGFP,并探讨其对人前列腺癌细胞系LNCaP、PC3的促凋亡作用。方法采用PCR的方法从变异型apoptin质粒p3×flag-m-apoptin- myc扩增出野生型apoptin片段及变异型apoptin片段m-apoptin,将其定向克隆于pEGFP-N1载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间,构建EGFP标记的野生及变异型apoptin真核表达质粒pApoptin-EGFP及pM-apoptin-EGFP,酶切、测序鉴定,RT-PCR、荧光显微镜分析融合蛋白表达,脂质体介导瞬时转染人前列腺癌细胞系LNCaP、PC3,流式细胞仪检测凋亡及细胞周期变化。结果成功构建pApoptin-EGFP、pM-apoptin-EGFP重组质粒,并在被转染细胞检测到基因表达;瞬时转染后48h可检测到细胞凋亡,与空质粒组相比具有非常显著意义,细胞周期变化表现为G2/M期阻滞。结论apoptin对雄激素依赖及非依赖型前列腺癌均具有明显的促凋亡作用,末端突变影响其促凋亡作用,为进一步探讨apoptin应用于前列腺癌的治疗奠定基础。     

BC022687基因真核表达质粒的构建及在CHO细胞内的蛋白表达和定位

目的:BC022687可能是调节纤毛形成的蛋白。本研究构建BC022687基因真核表达载体并探讨融合蛋白在细胞内表达及定位。方法:以小鼠睾丸cDNA文库为模板,PCR扩增全长BC022687编码序列,测序后亚克隆至携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的pEGFP-C1真核表达载体中。将构建的重组质粒转染到CHO细胞中,提取细胞蛋白进行Western印迹检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察BC022687/GFP融合蛋白在CHO细胞内定位。结果:翻译BC022687蛋白的cDNA序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小950 bp。Western印迹检测到相对分子质量约为64 000的融合蛋白表达。BC022687/GFP融合蛋白在细胞内定位以细胞质为主,并在中心体、纤毛形成的模板表达。结论:成功构建BC022687全长基因真核表达载体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.     

人PAX8与PPARγ的融合基因（PPFP）的克隆及其重组质粒的构建

目的 探讨人PAX8/FPARγ融合基因(PPFP)表达质粒在甲状腺上皮细胞中的表达及作用.方法 从含有PAX8基因和PPARγ基因的质粒克隆模板PAX8-pOTB7及PPARγ-pCMV-SPORT6中,利用PCR方法 调取目的 基因PAX8和PPARγ,将PAX8和PPARγ定向连接后克隆到pEGFP-C1载体上,构建融合基因的真核表达质粒pEGFP-C1-PAX8/PPARγ,在大肠杆菌E.coli DH5α中转化并提取质粒,通过PCR和测序、分析比对验证PPFP融合基因后,将真核表达载体pEGFP-C1-PAX8/PPARγ的质粒用脂质体包合并转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1,通过RT-PCR和Western blot鉴定PPFP融合基因于靶细胞内在mRNA和蛋白水平上的表达.结果 构建的质粒通过鉴定证实正确;该质粒转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1后,经验证显示PPFP融合基因在mRNA和蛋白水平上顺利表达.结论 成功克隆了PPFP融合基因并构建其重组质粒pEGFP-C1-PAX8/PPARγ;该质粒转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1后可顺利表达PPFP蛋白,为进一步研究PPFP基因致瘤作用的分子机制提供了实验基础.     

雷帕霉素靶蛋白反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的构建雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSMC）功能的影响。方法提取人VSMC总RNA，逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，转染VSMC，Westernblot法检测反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，酶切确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，转染72h的mTOR蛋白产物表达抑制率达82％，S期细胞由15％降低为7％，凋亡细胞增至9％。VSMC增殖过程在Gx／Go期→S期受阻。结论成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。     

绿色荧光蛋白和大鼠睾丸AQP7融合蛋白表达载体构建及其表达

目的 :构建真核表达的pEGFP C1与大鼠睾丸AQP7的融合蛋白表达载体。　方法 :RT PCR的方法扩增Wistar大鼠睾丸AQP7cDNA编码区全长序列 ,测序鉴定 ,将AQP7cDNA融合于pEGFP C1基因的下游。以脂质体转染方法将pEGFP C1 AQP7融合蛋白转入中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞 ,应用免疫细胞化学方法和Western印迹技术对转染细胞株进行鉴定。　结果 :①Wistar大鼠AQP7cDNA序列登录到GenBank ,登录号 :AY15 7737;②通过鉴定证明CHO细胞已经稳定表达了pEGFP C1 AQP7融合蛋白 ,其相对分子质量为 5 30 0 0 ;③绿色荧光蛋白作为标记物观察到AQP7在CHO细胞的定位。　结论 :稳定表达pEGFP C1 AQP7融合蛋白的CHO细胞株的建立 ,为AQP7在细胞内定位与功能研究奠定了基础。     

Galectin-1表达对LoVo细胞凋亡的影响

目的 观察galectin-1对LoVo细胞生长的影响.方法 构建galectin-1真核表达载体转染LoVo细胞,观察LoVo细胞生长情况.用免疫细胞化学方法检测转染后细胞galectin-1蛋白表达水平,免疫印迹检测转染后细胞Bc1-2表达的变化.结果 成功构建了 galectin-1真核表达载体pEGFP-C1/GAL1(p-GAL1),并建立了稳定的空载体(LoVo)细胞和真核表达载体转染细胞(P-LoVo细胞和p-GAL1-LoVo细胞).p-GAL1细胞可表达galectin-1,而另2组细胞则不能.galectin-1表达可降低LoVo细胞Be1-2的表达,诱导的细胞凋亡增加,3组细胞凋亡率分别为(9.61±0.56)%,(3.56±0.53)%和(3.46±0.46)%(P<0.001).而细胞生长曲线表明,P-GAL1-LoVo细胞增殖与P-LoVo和LoVo细胞相似.结论 galectin-1可促进LoVo细胞凋亡可能与galecfin-1可降低LoVo细胞Be1-2的表达有关.     

SEDT-PA致病基因WISP3突变体的构建及在COS-7细胞中的表达定位

目的通过构建晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病（SEDT-PA）致病型（1000 T-C，840deIT）Wnt诱导分泌蛋白3（WISP3）与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体，观察其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位，为研究WISP3突变致SEDT-PA的机理奠定基础。方法从正常人软骨细胞获得野生型WISP3基因的全长cDNA（WT-WISP3）；定点突变方法构建携带WISP3基因致病型的重组真核表达质粒MUT^1000T-C／pEGFP-C2和MUT^840deIT／pEGFP-C2；以空白载体pEGFP-C2为对照，脂质体转染法将重组质粒瞬时转染COS-7细胞，48h后用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达；半定量RT-PCR法检测WISP3基因的表达。结果测序和酶切鉴定证实插入片段大小和序列的正确；突变体在COS-7细胞中均高效表达；荧光显微镜观察发现，转染野生型WISP3基因的COS-7细胞中绿色荧光均匀分布在细胞浆和细胞膜，转染突变体的COS-7细胞中荧光呈斑点状染色和聚集现象。结论成功构建了SEDT-PA致病基因WISP3突变体，且发现野生型WISP3蛋白定位于细胞浆和细胞膜，而突变型的WISP3蛋白在细胞浆内异常聚集，为进一步探讨SEDT-PA的发病机制创造条件。     

骨形态发生蛋白-2对兔骨髓基质细胞向软骨细胞分化基因表达的影响

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因对兔骨髓基质细胞(MSCs)向软骨细胞分化mRNA表达的影响.方法 从兔骨髓细胞中分离提取BMP-2 mRNA,构建重组BMP-2真核表达质粒,并转染兔MSCs,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组MSCs内Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达水平.结果 转染后2、4 d实验组MSCs内的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达量28.7±4.0、236.7±48.5及26.9±4.3、208.2±36.7,均明显高于转染后2、4 d的空白对照组(16.1±2.8、99.2±24.8及14.6±2.7、111.1±18.9)和空载体对照组(14.6±2.6、85.4±24.7及16.1±2.8、98.0±22.5)(P＜0.05).结论 重组真核表达载体BMP-2质粒能够诱导MSCs向软骨细胞分化.

Abstract：

Objective To observe the effect of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) on gene expression during the differentiation of marrow stromal cells (MSCs) into chondrocytes. Methods The BMP-2 mRNA was extracted from the rabbit bone marrow cells. The recombinant BMP-2 eukaryotic expression plasmids were constructed and transfected into MSCs. The mRNA expression of type Ⅱ collagen and proteoglycan was detected by using quantitative polymerase chain reaction (PGR) technique. Results At 2nd, and 4th day after transfection of plasmid pEGFP-C3-BMP-2 into MSCs, the mRNA expression levels of type Ⅱ collagen and proteoglycan in MSCs of experimental group were significantly higher than controls (P ＜ 0. 05 ). Conclusion Recombinant eukaryotic expression plastmid pEGFP-C3-BMP-2 can induce MSCs differentiation towards chondrocytes.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染人表皮细胞及其表达

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体(pEGFP-C3-bFGF)能否转染体外培养的人表皮细胞并表达.方法 采用脂质体(LipofectamineTM 2000)转染法,将pEGFP-C3-bFGF转染至人表皮细胞系(HEKa细胞)中,在荧光显微镜下观察其瞬时表达及细胞形态.以同期培养的表皮细胞作为阴性对照,免疫细胞化学染色和免疫荧光标记法检测实验组及对照组中β1整合素、CKl9、CK14及CK10在表皮细胞中表达的差异.结果 荧光显微镜下观察基因转染率为31.6%,转染的细胞体积小,呈圆形或圆梭形,核质比大.免疫细胞化学染色结果显示,实验组细胞中CK19、CK14表达增强,CK10表达减弱.免疫荧光染色结果显示,转染阳性细胞β1整合素弱表达分布在胞膜上,CK19、CK14在胞膜和胞质中表达,CK10表达为阴性.结论 pEGFP-C3-bFGF能够转染至人表皮细胞并表达,为探讨bFGF调控表皮细胞去分化的分子机制提供实验参考.     

稳定表达乙肝病毒X蛋白肝癌细胞系的建立及其侵袭性研究

目的构建稳定表达乙肝病毒X蛋白的CCL13细胞系，为研究HBx在诱导肝细胞癌侵袭和转移等生物学行为的作用提供基础。方法将已构建的含HBx基因的真核表达载体pcDNA3．1-HBx质粒，采用脂质体介导法转染到人肝CCL13细胞系并检测HBx的稳定表达。通过体内、体外实验，研究目的细胞的侵袭能力。结果应用PCR技术从已转染的CCL13细胞中克隆出HBx基因，检测有无稳定表达HBx基因的两组CCL13细胞生长曲线、集落形成率、划痕愈合和细胞侵袭力，发现转染细胞的生物学行为有很明显的恶性肿瘤细胞表型。结论成功构建了稳定表达X蛋白且具有高侵袭性的CCL13细胞系，发现该细胞系侵袭能力的条件性。     

c-myc靶向小干扰RNA诱导乳腺癌细胞凋亡的作用

目的构建小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外观察其诱导乳腺癌细胞凋亡效应。方法基因克隆技术构建人cmyc癌基因特异性siRNA表达载体,体外转染MCF7,48h后检测c-myc癌基因表达状况并观察MCF7凋亡诱导效应。结果(1)成功构建siRNA表体载体:pEGFP-C1/U61、pEGFP-C1/U62和pEGFP-C1/U63;(2)siRNA表达载体转染MCF748h后,pEGFP-C1/U62组显著抑制胞内c-myc表达(80%);(3)转染24h和48h后,pEGFP-C1/U62组凋亡率分别为11.01%和21.30%,明显高于对照组(P<0.01)。结论构建的cmyc靶向siRNA表达载体能显著下调cmyc在MCF7中的过表达,诱导乳腺癌细胞株MCF7凋亡。