诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

TaqMan荧光定量PCR检测和鉴别不同血清群脑膜炎奈瑟菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于脑膜炎奈瑟菌不同血清群菌株的检测和鉴别.方法 设计合成7对引物和TaqMan探针,脑膜炎奈瑟菌种属特异性的基因为ctrA;不同血清群的脑膜炎奈瑟菌特异性基因分别为A群(sacB)、B群(siaD)、C群(siaD)、X群(xcbB)、Y群(synF)、W135群(synG).检测和确定不同探针和引物用于脑膜炎奈瑟菌荧光定量PCR检测的特异性、敏感性,并同时将荧光定量PCR和乳胶凝集方法应用于121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本的检测.结果 ctrA、sacB、siaD(B群)、siaD(C群)、xcbB、synF、synG等7对引物和探针能准确检测和鉴定79株不同血清群的脑膜炎奈瑟菌菌株,检测灵敏性比相应的普通PCR高101～103倍,每对引物和探针反应体系中,能检测的最低全基因组DNA拷贝数分别为8、8、80、8、8、80、8;检测121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本,TaqMan荧光定量PCR检测11份阳性,乳胶凝集方法检测6份阳性.结论 TaqMan荧光定量PCR方法能特异地检测和鉴定不同血清群脑膜炎奈瑟菌,具有较高的灵敏性和快速检测的特点,能提高临床疑似脑膜炎奈瑟菌感染病例的阳性检出率.     

基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测水产品中的沙门菌

目的:建立基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测水产品中沙门菌的检测体系。方法:根据沙门菌外膜蛋白Ompc基因的保守序列,设计1对引物和TaqMan探针,并对荧光定量PCR反应体系和反应条件进行优化。利用建立的检测方法对舟山水产品加工厂和舟山菜市场采集的120份样本进行检测。结果:该检测方法可以达到1μl 1.0×101拷贝数量级的灵敏度。样品检出率为10.0%,与国标法检测结果一致。结论:本研究建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简便快速的实现对水产品中沙门菌的检测。     

应用TaqMan MGB荧光PCR检测鼠肺组织中的汉坦病毒

目的:探讨应用TaqMan MGB荧光PCR方法检测鼠肺组织中汉坦病毒感染的准确性和敏感性,为进一步完善汉坦病毒的实验室检测提供依据。方法:采用TaqMan MGB荧光PCR和逆转录-套式PCR(RT-nested-PCR)方法分别检测深圳市2005年肾综合征出血热宿主动物监测中捕获的鼠类中HV的感染情况。结果:在102份鼠肺标本中,TaqManMGB荧光PCR检出汉坦病毒阳性63份,RT-nested-PCR检出阳性61份。两种方法均阳性的57份,均阴性的35份,符合率为90.2%。采用TaqMan MGB荧光PCR检测汉坦病毒,敏感性较RT-nested-PCR高,但两种方法的阳性率无统计学差异。结论:TaqMan MGB荧光PCR是一种比较准确的检测汉坦病毒感染的方法,其敏感性高于逆转录-套式PCR。     

TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革Ⅰ型病毒

目的检测发热患者血清中的登革病毒含量,并判定其型别。方法在登革病毒的E基因区设计一对引物和一条MGB探针,建立TaqMan MGB实时荧光定量PCR体系;从10份疑似登革热患者血清中提取病毒RNA,逆转录成cDNA,采用TaqMan MGB实时荧光定量PCR技术检测登革病毒及其型别。结果10份血清样本中,有9例出现阳性扩增曲线,病毒含量在103-105拷贝/ml,且扩增产物均出现大约100 bp的扩增带。结论2006年在广州市流行的登革热是由登革Ⅰ型病毒引起,TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革病毒感染具有快速、敏感的特点,为登革热的早期诊断提供了可能。     

阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术研究

[目的]建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应（RT．PCR）快速检测方法。[方法]在阪崎克罗诺杆菌保守序列设计一对特异性引物和TaqMan—MGB探针,通过对PCR反应条件和扩增体系的优化,建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测方法;用已知浓度的阪崎克罗诺杆菌验证其敏感性;用阪崎克罗诺杆菌、大肠埃希菌、鸭沙门菌株、柠檬酸杆菌等菌株验证其特异性;用婴幼儿配方粉等食品开展TaqMan—MGB探针实时荧光PCR技术与常规检测方法符合性比较。[结果]本研究建立的阪崎克罗诺杆菌实时荧光PCR检测技术,反应循环（cyclethreshold,CT）值-9模板浓度的对数值具有良好的对应关系[Y=-3．06×log（X）＋36．63,R^2=0．999],最低检测浓度为100CFU／mL,经36℃增菌8h最低检测限可达1CFU／mL,敏感性较普通TaqMan探针高10倍;11株阪崎克罗诺杆菌CT值均小于30,而大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等30株菌株CT值大于30或扩增曲线成一平滑直线;隔天连续5次反应CT值变异系数小于5％;140件不同批次不同婴幼儿配方粉、192件婴幼儿谷物辅助食品检测结果与常规分离培养比较,差异无统计学意义（X^2=0．624,P〉0．05）。[结论]阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测技术具有特异性强、敏感性高、易操作等优点,适用于婴儿配方粉等食品开展阪崎克罗诺杆菌快速检测与监测工作。     

TaqMan PCR检测乙型脑炎病毒方法的建立及应用

目的:利用TaqMan PCR技术,建立乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)实时荧光PCR检测方法,探讨其用于临床诊断的可行性.方法:根据GenBank发表的JEV全基因组序列资料分析结果,在其3'端非编码区(UTR)设计JEV特异的引物与探针,验证检测体系的特异性、灵敏性和稳定性,并用于临床乙脑病人样本的检测.结果:引物、探针具有良好的特异性,用该TaqMan PCR法检测JEV减毒株SA14-14-2灵敏度可达1 TCID50/ml.稳定性分析表明,同一样本重复检测5次,Ct值变异系数均小于5%.在此基础上,实时荧光PCR检测了10份临床上确诊为乙脑患者的标本(特异性IgM阳性),6份阳性,阳性率为60%.在7份特异性IgM阴性、临床上疑似乙脑的患者中,2份TaqMan PCR结果为阳性,阳性率为28.6%.此方法从RNA提取到检测结果仅需1.5 h.结论:本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的JEV TaqMan PCR检测方法,为乙型脑炎的鉴别诊断提供了一种技术手段.     

TaqMan荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立

目的：建立特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测霍乱弧菌。方法：根据GenBank上的霍乱毒素（cholera toxin，CT）基因序列，在其保守区域设计特异性引物与TaqMan探针，并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化，同时验证方法的特异性、敏感性和重复性。结果：本方法对霍乱弧菌的检测具有高度特异性，与副溶血性弧菌、沙门菌、志贺菌、变形杆菌、大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应；检测灵敏度达10cfu／ml；反应体系具有很高的稳定性；整个操作过程仅需2h。结论：本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速．适用于霍乱弧菌的日常监测和爆发疫情的应急诊断。     

应用MGB探针检测人乙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人乙型肝炎病毒HBV的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HBV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PCR引物及探针,为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物纯化后进行基因克隆,克隆成功后提取的质粒制备为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达50 IU/mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可以很好地定性的检测血浆或血清样本及血液制品中的人乙型肝炎病毒HBV的基因型及含量,对于该疾病的临床治疗具有重要的意义。     

TaqMan MGB双探针方法检测慢性乙型肝炎病毒YMDD变异的研究

目的探讨TaqMan MGB双探针方法检测慢性乙型肝炎病毒YMDD变异的可靠性。方法采用荧光定量PCR法检测HBV DNA含量,TaqMan MGB双探针方法和测序方法检测其YMDD变异,以测序方法为参考方法,评价TaqMan MGB双探针方法检测慢性乙型肝炎病毒YMDD变异的可靠性。结果246例HBV DNA阳性患者血清标本中,TaqMan MGB双探针方法阳性检出率为100%,100例正常对照全部为阴性;YMDD无突变106例,YMDD有突变(YIDD变异 YVDD变异)140例,与核酸测序方法比较,符合率为100%;该方法经过敏感度实验,最低检出下限为1×103拷贝/ml。结论TaqMan MGB双探针方法能便捷、灵敏、特异地检测YMDD基序变异情况,适用于临床检测慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗的YMDD基序变异。     

一种无RNA纯化步骤TaqMan RT—PCR方法用于快速检测登革病毒

目的 建立一种简便、快速的登革病毒核酸检测方法。方法 设计合成LNA探针，替代MGB探针，建立一步法TaqManRT—PCR方法，并用已知的登革病毒标准毒株进行方法的优化；用商品化的纯化试剂盒和简单的热释放法获取登革病毒细胞培养液和模拟含登革病毒血清中RNA。以优化的TaqManRT—PCR方法进行检测，比较有或无RNA纯化步骤检测的敏感性和重复性。结果 LNA探针TaqMan RT—PCR有较好的PCR扩增效率（104％）、较广的线性范围（10^0-10^-7样品稀释度）、较高的敏感性（0．003TCID50／反应）和较好的重复性（CV值小于4．53％），新方法检测经简单热释放RNA的细胞培养液和模拟含登革病毒血清中登革病毒也有较高的敏感性（0.03TCID50／反应）和较好的重复性（CV值小于6．36％）。结论 新型LNA探针可替代MGB探针用于TaqMan RT—PCR反应。简便的热释放RNA方法结合高敏感性的TaqMan RT—PCR可满足登革病毒快速检测的需要。     

基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,检测基孔肯雅病毒。方法通过序列比对挑选出基孔肯雅病毒基因组中高度保守的序列,在此序列上设计引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达21拷贝/μl,通过检测与传播媒介相似的流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应。结论该方法的建立在基孔肯雅热的疾病防控方面有较好的应用前景。     

MGB-TaqMan探针实时荧光定量在快速检测产肠毒素大肠杆菌中的价值

目的 采用MGB-TaqMan探针建立产耐热肠毒素大肠埃希菌实时荧光定量PCR检测方法.方法 针对编码大肠埃希菌耐热肠毒素Ⅰ基因片段设计引物、MGB探针,采用外标法,绘制标准曲线,进行实时荧光定量PCR检测.评价该方法的特异性,灵敏度,准确度,检测范围,重复性及稳定性等.做阴性对照,排除假阳性,采用UNG酶抗污染.结果 实验结果表明引物、探针特异性良好,该方法的灵敏度可达到每反应3DNA拷贝,特异性强,检测范围在100～109拷贝每反应,重复性及稳定性较好,整个过程只需要2 h.结论 该方法能快速、灵敏、特异检出产耐热肠毒素大肠埃希菌,对控制由耐热肠毒素引起的腹泻性疾病具有重要意义.     

TaqMan荧光定量PCR检测1型登革热病毒及临床应用

目的建立登革热1型病毒（DV1）TaqMan荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床诊断。方法根据DV15′端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan探针。用4个血清型DV标准毒株为对照,收集40份DV1临床血清为检测标本。通过对DV1标准毒株RT-PCR后,采用体外转录方式获得RNA模板作为阳性对照,检测所建立TaqMan荧光定量PCR方法的特异性。取DV-IgM/IgG用ELISA检测患者血清,将TaqMan荧光定量PCR和DV-IgM/Ig GELISA进行敏感性比较。结果所建立方法的最低检测限约为每反应10个基因拷贝。发病后不同时间采集的登革热患者血清标本检测结果为：发病1～3d的患者RT-PCR阳性检出率最高（81.25%）;4～6dELISA-IgM检出率最高（85.00%）;7d后ELISA-IgG检出率最高（75.00%）。结论在登革热的早期诊断中建立的RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为DV1的快速诊断方法。     

登革病毒实时荧光PCR快速检测技术研究

目的建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒。方法利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测8份临床血清标本,2份阳性,阳性率为25%。实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0.17pg/μl,病毒液灵敏度为10-5TCID50,与乙脑病毒无交叉反应,检测8份临床血清标本,5份阳性,阳性率为62.5%。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强,可作为登革病毒的快速检测方法,应用于登革热的临床早期诊断。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肠道细菌Akkermansia Muciniphila

目的 建立Akkermansia muciniphila(A.muciniphila)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,实现粪便中A.muciniphila的定量检测。方法 根据GenBank公布的A.muciniphila 16S rRNA基因高保守序列,设计合成特异引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为标准品,通过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,同时将建立的方法用于10份成年人粪便标本的检测。结果 TaqMan实时荧光定量PCR检测A.muciniphila,仅需1.5h,该方法线性好,相关系数R²=0.9991,扩增效率E=94.7%;重复性好,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏度可达到5×10³拷贝/μl;特异性良好。10份成年人粪便标本共检出9份为阳性,阳性粪便标本中A.muciniphila平均含量为2.70×108cells/g粪便。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR能够快速、灵敏、特异地定量检测粪便标本中A.muciniphila。     

实时荧光PCR快速检测粪便中艰难梭菌方法

目的:建立实时荧光PCR快速检测艰难梭菌的方法。方法:以艰难梭菌磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的保守序列为模板设计和合成特异性引物和荧光标记探针,建立实时荧光PCR检测体系,通过检测含有艰难梭菌标准菌株浓度为106-10 CFU/ml的细菌培养物及加标模拟样本进行敏感性分析,并对其特异性和干扰性进行评价。结果:该方法只对艰难梭菌进行特异性扩增,其他常见的病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要2 h,对艰难梭菌菌悬液可检测至10 CFU/ml细菌,对加标粪便样本可检测至1000 CFU/ml细菌。结论:本研究建立的实时荧光PCR检测艰难梭菌方法具有快速、特异、敏感性高等优点,能实现对艰难梭菌的快速检测。     

A型肉毒梭菌atx基因TaqMan探针荧光定量PCR检测

目的采用TaqMan探针荧光定量PCR方法对A型肉毒梭菌atx基因进行检测。方法以atx基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针,优化反应条件,制作定量标准曲线,进行灵敏度、特异性和重复性验证,建立A型肉毒梭菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果构建质粒pUC57-△atx,标准曲线在103～107拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度达到22个拷贝数,比普通PCR提高约100倍;能选择性检测A型肉毒梭菌,与其他5种食源性病原菌无交叉反应,结果与普通PCR一致;重复性试验表明,同一浓度的15个平行样品的变异系数为1.0%。结论 A型肉毒梭菌TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以快速、准确、定量地检测A型肉毒梭菌。     

TaqMan MGB双探针实时PCR快速检测结核分枝杆菌rpoB基因多位点突变方法的建立

目的建立快速、灵敏的检测结核分枝杆菌rpoB基因常见突变位点的新方法。方法采用TaqMan小沟结合物(MGB)探针技术,检测146例活动性肺结核患者和35例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况,测序方法为参考方法。结果146例活动性肺结核患者痰标本中,双探针方法检出阳性118例,其中rpoB基因突变56例,与测序方法比较符合率100.0%;35例非结核性肺部疾病患者痰标本双探针方法检测均为阴性,特异性100.0%;该方法最低检出下限为1×103拷贝/ml。结论TaqMan MGB双探针方法能快速、准确地检测结核分枝杆菌rpoB基因位点突变情况,适用于临床对耐药结核分枝杆菌的快速诊断。