miR-155通过调节ETS1促进鼻咽癌细胞侵袭转移能力的研究

目的 观察微小RNA(micro RNA)miR-155在鼻咽癌细胞侵袭转移中的作用。方法 以鼻咽癌CEN1和5-8F细胞作为研究对象,分别转染miR-155 NC、miR-155 inhibitor、miR-155 mimics和ETS1 siRNA,运用Transwell实验检测miR-155和ETS1对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的作用,RT-qPCR检测细胞miR-155表达;蛋白印记实验检测ETS1、MMP2和MMP9蛋白表达。结果 与miR-155 NC组相比,miR-155 inhibitor组细胞侵袭[(237.33±15.63)个vs.(117.00±5.72)个]和迁移[(331.00±9.42)个vs.(262.00±11.05)个]能力均降低(P<0.05),ETS1[1.00 vs.(0.77±0.04)]、MMP2[1.00 vs.(0.58±0.05)]和MMP9[1.00 vs.(0.38±0.06)]蛋白表达均下调(P<0.05);miR-155 mimics组细胞侵袭[(134.00±8.83)个vs.(326.00±12.68)个]和迁移[...     

舒芬太尼调控 miR-1抑制肝癌细胞 MHCC97-H增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的 探讨舒芬太尼调控微小RNA-1(miR-1)表达对人肝癌MHCC97-H细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制.方法 本研究起止时间为2018年3月至2019年9月,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测不同浓度的舒芬太尼对人肝癌MHCC97-H细胞活力的影响,qRT-PCR检测舒芬太尼对MHCC97-H细胞中miR-1表达的影响;通过脂质体转染法将miR-1抑制剂(inhibitor)及阴性对照转染至MHCC97-H细胞,实验分为Control组、舒芬太尼(Sufentanil)组、转染对照(Sufentanil+NC)组和转染(Sufent-anil+miR-1)组.细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测各组MHCC97-H细胞增殖能力,Transwell实验检测各组MHCC97-H细胞侵袭能力,划痕实验检测各组MHCC97-H细胞迁移能力,蛋白质印迹法(Western blotting)检测各组MHCC97-H细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达情况.结果 不同浓度的舒芬太尼对肝癌MHCC97-H细胞活力具有不同程度的抑制作用;与Control组比,Sufentanil组MHCC97-H细胞中miR-1的表达[(1.00±0.09)比(2.25±0.24)]明显升高(P<0.05),细胞增殖[(0.54±0.05)比(0.34±0.03)]、侵袭[(106.24±8.25)个比(51.34±5.02)个]和迁移能力[(37.36±4.01)％比(16.34±1.72)％]降低(P<0.05),MMP-2[(0.33±0.04)比(0.15±0.02)]和MMP-9[(0.24±0.02)比(0.11±0.01)]的表达下调(P<0.05);与Sufentanil+NC组比,Sufentanil+miR-1组MHCC97-H细胞中miR-1的表达[(2.20±0.21)比(1.42±0.15)]明显降低(P<0.05),细胞增殖[(0.32±0.03)比(0.46±0.04)]、侵袭[(52.36±5.14)个比(91.16±6.06)个]和迁移能力[(17.11±1.71)％比(29.85±3.10)％]升高(P<0.05),MMP-2[(0.15±0.02)比(0.27±0.02)]和MMP-9[(0.13±0.01)比(0.19±0.02)]的表达上调(P<0.05).结论 舒芬太尼可通过调控miR-1的表达抑制人肝癌MHCC97-H细胞的增殖、侵袭和迁移,其机制可能与调控MMP-2和MMP-9表达有关.     

地西他滨对胃癌细胞 AGS增殖和侵袭的影响

目的 探究地西他滨对胃癌AGS细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制.方法 本研究时间为2017年10月至2018年12月,采用地西他滨处理购自于中国科学院细胞库的胃癌AGS细胞,应用MTT法检测细胞增殖率,亚硫酸氢钠转化测序法检测APC基因启动子的甲基化程度,实时荧光定量PCR法检测APC基因mRNA的表达,Western blotting检测APC蛋白表达,细胞锚定非依赖性生长分析法和Transwell细胞侵袭法检测细胞的增殖和侵袭能力.结果 AGS细胞中,APC基因启动子高度甲基化((85.7±5.4)％);地西他滨处理AGS细胞后,细胞活力受到抑制,且呈浓度和时间依赖性.APC基因启动子去甲基化,mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05),5μM升高(2.3±0.1)倍,10μM升高(3.6±0.2)倍,25μM升高(4.1±0.1)倍,50μM升高(3.9±0.2)倍),增殖和侵袭能力均减弱(P<0.05),AGS组(290.3±5.7)个细胞,5μM为(213.2±6.7)个细胞,10μM为(160.4±7.3)个细胞,25μM为(145.8±6.2)个细胞,50μM为(119.2±8.6)个细胞).结论 地西他滨可以抑制AGS细胞的增殖和侵袭,表现出抗肿瘤活性,其相关机制可能为去除AGS细胞中APC基因的甲基化,恢复APC基因的表达.     

miR-497和miR-34a在铂敏感和铂耐药卵巢上皮癌患者中的表达差异及机制研究

目的:探讨微小核糖核酸miR-497和miR-34a在铂敏感和铂耐药卵巢上皮癌(EOC)患者中表达的差异及机制。方法:选取2008年1月-2012年1月于我院妇产科行卵巢癌分期手术或肿瘤细胞减灭术的EOC患者72例,术后均行以铂类药物为基础的规范化疗,并进行随访(时间为2008年7月-2016年7月)。根据患者对铂类药物的敏感性将其分为铂敏感组(42例)和铂耐药组(30例)。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测两组患者肿瘤组织中miR-497和miR-34a的表达水平,并考察其与患者总生存时间的相关性;采用巢式降落式甲基化特异性聚合酶链反应法检测患者miR-497和miR-34a启动子区DNA甲基化水平,采用蛋白印迹法考察组蛋白H3第9位赖氨酸残基二甲基化(H3K9me2)水平,采用染色质免疫共沉淀法检测miR-497和miR-34a启动子区H3K9me2水平。结果:铂敏感组患者miR-497和miR-34a的表达水平均显著高于铂耐药组,差异均有统计学意义(P<0.05);72例患者的总生存期为(45.7±17.5)个月,与其miR-497和miR-34a表达水平呈正相关(r2分别为0.2714、0.3782,P<0.01)。铂耐药组患者miR-497和miR34a启动子区DNA甲基化水平均显著高于铂敏感组,且其启动子区H3K9me2水平也显著高于铂敏感组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);而铂耐药组患者H3K9me2水平虽略高于铂敏感组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:EOC患者肿瘤组织中miR-497和miR-34a的表达水平与铂化疗的敏感性及患者的生存时间有关,启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化可能是其表达变化的机制之一。     

长链非编码 RNA小核仁 RNA宿主基因 7调控卵巢癌细胞迁移和侵袭的机制研究

目的 研究长链非编码RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因7(SNHG7)调控卵巢癌SK-OV-3细胞迁移和侵袭的机制.方法 研究起止时间为2019年6—12月,SK-OV-3细胞购自美国ATCC;卵巢癌SK-OV-3细胞中转染SNHG7干扰表达质粒(SNHG7 shRNA),实时定量PCR方法测定细胞中SNHG7表达变化,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定SK-OV-3细胞增殖能力,用平板克隆实验及Transwell小室法分别检测细胞克隆形成、侵袭和迁移能力,用Western blotting方法检测波形蛋白(Vi?mentin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)表达.用starbase生物信息软件发现SNHG7和微小RNA-34a(miR-34a)有互补结合位点,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系.卵巢癌SK-OV-3细胞中共转染SNHG7 shRNA、miR-34a抑制剂(miR-34a inhibitor),检测细胞增殖、克隆、侵袭以及迁移能力变化.结果 Control组、Sh-NC组、Sh-SNHG7组细胞A值分别为(0.45±0.03)、(0.44±0.05)、(0.23±0.02);克隆数目分别为(167.25±11.87)个、(169.57±12.76)个、(103.69±9.92)个;侵袭数目分别为(135.68±10.75)个、(134.21±10.27)个、(76.33±8.20)个;迁移数目分别为(178.69±15.46)个、(180.26±13.71)个、(99.83±8.64)个;与Control组和Sh-NC组比,Sh-SNHG7组细胞A值降低,克隆数目减少,侵袭和迁移数目减少,Vimentin蛋白表达量减少,E-cadherin蛋白表达量升高,差异有统计学意义(P<0.001).SNHG7靶向调控miR-34a.与Sh-SNHG7+anti-miR-NC组比较,Sh-SNHG7+anti-miR-34a组miR-34a水平降低,SK-OV-3细胞A值升高[(0.40±0.04)比(0.24±0.03)],SK-OV-3细胞克隆形成数[(152.16±10.35)个比(106.58±10.52)个]、侵袭数[(122.64±9.93)个比(77.69±6.50)个]及迁移数[(168.43±12.84)个比(100.39±7.91)个]增多,Vimen?tin蛋白表达水平升高,E-cadherin蛋白表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.001).结论 下调lncRNA SNHG7抑制卵巢癌SK-OV-3细胞迁移和侵袭,机制与靶向调控miR-34a有关.     

微 RNA-130a靶向人类 RUNT相关转录因子 3对肺癌 A549细胞增殖和转移的影响

目的 探讨微RNA(miR)-130a与人类RUNT相关转录因子3(RUNX3)的靶向关系及其对非小细胞肺癌A549细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化的影响.方法 将体外培养的A549细胞分为对照组(未处理)、anti-miR-NC组(转染miR-130a inhibi?tor阴性对照)、anti-miR-130a组(转染miR-130a inhibitor)、anti-miR-130a+siNC组(转染miR-130a inhibitor和NC-siRNA)和anti-miR-130a+siRUNX3组(转染miR-130a inhibitor和RUNX3-siRNA),采用实时定量PCR检测各组细胞中miR-130a和RUNX3mRNA的表达水平,蛋白质印迹法(Western Blot)检测各组细胞中RUNX3蛋白和上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达水平,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测各组细胞增殖能力,克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成能力,Transwell小室实验检测各组细胞侵袭与迁移能力,荧光素酶实验检测miR-130a和RUNX3的靶向关系.结果 荧光素酶实验证实,RUNX3是miR-130a的潜在靶基因.与anti-miR-NC组相比,下调miR-130a可抑制A549细胞增殖[(94.72±6.05)％比(51.28±3.24)％]、克隆[(36.15±2.06)％比(15.46±1.25)％]、侵袭[(90.25±5.48)个比(42.18±3.26)个]、迁移[(118.55±9.86)个比(73.48±6.75)个](P<0.05),促进E-cadherin蛋白表达[(0.26±0.03)比(0.48±0.04)](P<0.05),而抑制N-cadherin、Vimentin蛋白表达[(0.52±0.03)比(0.25±0.02);(0.68±0.05)比(0.35±0.03)](P<0.05);与anti-miR-130a+siNC组相比,共转染anti-miR-130a与siRUNX3可成功增强A549细胞增殖[(52.16±3.12)％比(72.23±6.13)％]、克隆[(16.08±1.05)％比(22.12±1.34)％]、侵袭[(41.59±3.02)个比(68.32±4.26)个]、迁移能力[(72.26±5.18)个比(98.25±6.02)个](P<0.05),抑制E-cad?herin蛋白表达[(0.52±0.04)比(0.33±0.03)](P<0.05),而促进N-cadherin、Vimentin蛋白表达[(0.27±0.03)比(0.46±0.03);(0.33±0.02)比(0.53±0.04)](P<0.05).结论 miR-130a可通过靶向RUNX3抑制A549细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转移.     

微小 RNA-590对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制

目的 探讨微小RNA(miR)-590对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响和分子机制.方法 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测2014年1月至2017年1月菏泽市牡丹人民医院52例口腔鳞癌组织中miR-590的表达.将口腔鳞癌细胞Tca-8113分为miRNA抑制物阴性对照(anti-miR-NC)组、miR-590抑制物(anti-miR-590)组、空载体(pcDNA3.1)组、大肿瘤抑制基因1(LATS1)过表达载体(pcDNA3.1-LATS1)组、anti-miR-590+小干扰RNA阴性对照(si-NC)组、anti-miR-590+LATS1小干扰RNA组(si-LATS1).四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞活力,Transwell法检测细胞的迁移和侵袭数.双荧光素酶报告基因实验和蛋白质印迹法检测验证miR-590和LATS1的靶向调控关系.结果 与癌旁组织比较,口腔鳞癌组织中miR-590的表达水平显著升高[(0.73±0.07)比(0.30±0.03),P<0.05].与anti-miR-NC组比较,anti-miR-590组细胞活力[(0.40±0.04)比(0.78±0.08)]、迁移[(46±5)个比(136±13)个]和侵袭数[(42±4)个比(128±13)个]显著降低(P<0.05);与pcD-NA3.1组比较,pcDNA3.1-LATS1组细胞活力[(0.49±0.05)比(0.78±0.08)]、迁移数[(56±6)个比(136±13)个]和侵袭数[(50±5)个比(128±13)个]显著降低(P<0.05).LATS1靶向负调控LATS1表达.与anti-miR-590+si-NC组比较,anti-miR-590+si-LATS1组细胞活力(0.61±0.06)比(0.40±0.04)、迁移数[(94±9)个比(45±4)个]和侵袭数[(87±9)个比(40±4)个]显著升高(P<0.05).结论 抑制miR-590通过靶向调控LATS1表达从而抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭.     

微小 RNA-203a-3p下调 Mink相关肽 1基因表达抑制非小细胞肺癌细胞转移潜能的实验研究

目的 探讨微小RNA-203a-3p(miR-203a-3p)对非小细胞肺癌恶性生物学行为的影响及机制.方法 本研究于2018年7月至2019年6月进行,正常肺上皮细胞BEAS-2B以及肺癌细胞H1299、SPC-A-1、NC-H446购自中国科学院上海细胞库;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-203a-3p和Mink相关肽1(KCNE2)mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测KCNE2蛋白表达;将SPC-A-1细胞分为miR-203a-3p(转染miR-203a-3p模拟物)组、miR-con组(转染miR-203a-3p模拟物阴性对照)、si-KCNE2组(转染KCNE2干扰表达载体)、si-con组(转染KCNE2干扰表达载体阴性对照)、miR-203a-3p+pcDNA组(转染miR-203a-3p模拟物和KCNE2过表达载体阴性对照)、miR-203a-3p+pcDNA-KCNE2组(转染miR-203a-3p模拟物和KCNE2过表达载体);四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)法检测细胞活性;Transwell检测细胞迁移和侵袭;蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期素依赖蛋白激酶6(CDK6)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达;双荧光素酶报告实验检测miR-203a-3p和KCNE2的靶向关系.结果 与BEAS-2B细胞相比,肺癌细胞H1299、SPC-A-1、NC-H446中miR-203a-3p表达水平显著降低[(0.27±0.05)、(0.18±0.07)、(0.25±0.04)比(1.00±0.24)],KCNE2 mRNA表达水平显著升高[(4.37±0.43)、(5.24±0.34)、(6.39±0.35)比(1.00±0.08)],KCNE2蛋白表达水平显著升高[(0.73±0.07)、(0.75±0.06)、(0.59±0.05)比(0.38±0.04)](P<0.05).与miR-NC组相比,miR-203a-3p组SPC-A-1细胞活性降低[48 h为(0.42±0.05)比(0.55±0.05),72 h为(0.63±0.07)比(0.84±0.09)],迁移细胞数减少[(79.90±5.21)个比(172.13±8.57)个],侵袭细胞数减少[(45.89±3.50)个比(101.83±9.55)个];Cyclin D1、CDK6、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低(P<0.05).与si-NC组相比,si-KCNE2组SPC-A-1细胞活性降低[48 h为(0.44±0.05)比(0.58±0.05),72 h为(0.63±0.08)比(0.94±0.09)],迁移细胞数减少[(71.71±4.52)个比(174.56±13.67)个],侵袭细胞数减少[(35.68±3.27)个比(81.37±5.46)个];Cyclin D1、CDK6、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低(P<0.05).miR-203a-3p靶向调控KCNE2的表达;KCNE2过表达部分逆转miR-203a-3p对肺癌细胞SPC-A-1的作用.结论 miR-203a-3p可通过下调KCNE2抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭.     

地西他滨对体外培养大鼠的血管平滑肌细胞ERα基因启动子甲基化状态及mRNA表达的影响

目的 探讨地西他滨对大鼠主动脉平滑肌细胞雌激素受体α(ERα)基因甲基化水平及mRNA表达的影响.方法 在体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞中加入0、1、2、4 μmol·L-1的地西他滨,孵育72 h,应用MS-PCR分析ERα基因启动子区域的甲基化状态,采用RT-PCR测定ERα mRNA的表达水平.结果 用不同浓度的地西他滨处理大鼠血管平滑肌细胞后,其ERα基因启动子区域的甲基化水平降低,并在高浓度时出现去甲基化;ERα mRNA的表达增加并呈剂量依赖关系.结论 地西他滨可促进大鼠血管平滑肌细胞ERα基因启动子区域去甲基化,并使ERα mRNA的表达增加.     

纳布啡通过调控 miR-4301/BRD4抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的 探讨纳布啡对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制.方法 本研究时间为2019年1—7月.肝癌细胞株Huh7购自美国ATCC,将Huh7细胞分为对照组、不同浓度纳布啡(50μmol、100μmol、200μmol)组、微小RNA-4301(miR-4301)组、miR-4301模拟物阴性对照(miR-NC)组、纳布啡+miR-4301抑制表达载体(anti-miR-4301)组、纳布啡+miR-4301抑制表达载体阴性对照(anti-miR-NC)组.四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测Huh7细胞的增殖抑制率;Transwell检测Huh7细胞的迁移和侵袭数;蛋白质印迹检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和溴结构域蛋白4(BRD4)蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-4301和BRD4 mRNA表达水平;荧光素酶报告实验检测miR-4301和BRD4的靶向关系.结果 与对照组相比,不同浓度纳布啡组Huh7细胞抑制率升高[(11.25±1.12)％、(22.63±2.25)％、(37.65±3.74)％比(0.00±0.01)％],迁移数减少[(79.32±7.38)个、(61.36±5.48)个、(45.69±5.37)个比(98.63±9.54)个],侵袭数减少[(67.53±6.65)个、(53.41±5.22)个、(37.64±3.87)个比(81.36±8.13)个],p21表达水平升高,Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表达水平降低,miR-4301表达水平升高,BRD4mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),且呈浓度依赖性.与miR-NC组相比,miR-4301组Huh7细胞抑制率升高[(31.25±3.15)％比(6.32±0.63)％],迁移数减少[(52.33±5.26)个比(96.32±9.54)个],侵袭数减少[(41.69±4.32)个比(83.15±8.33)个],p21表达水平升高,Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表达水平降低(均P<0.05).miR-4301靶向调控BRD4的表达,抑制miR-4301表达逆转了纳布啡对Huh7细胞的作用.结论 纳布啡可抑制肝癌Huh7细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与miR-4301和BRD4有关.     

长链非编码小核仁 RNA宿主基因 7调控微小 RNA-331-3p表达影响甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的 探讨长链非编码小核仁RNA宿主基因7(lncRNA SNHG7)对甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及潜在的作用机制.方法 本研究起止时间为2018年1月至2019年2月,人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1和人甲状腺癌细胞K1、BCPAP、TPC-1购自中国科学院上海细胞库,用qRT-PCR检测SNHG7和微小RNA-331-3p(miR-331-3p)的表达水平;将si-NC组(转染SNHG7干扰表达载体阴性对照)、si-SNHG7组(转染SNHG7干扰表达载体)、si-SNHG7+anti-miR-NC组(共转染SNHG7干扰表达载体和miR-331-3p抑制剂阴性对照)、si-SNHG7+anti-miR-331-3p组(共转染SNHG7干扰表达载体和miR-331-3p抑制剂),均用脂质体法转染至TPC-1细胞;采用蛋白质印迹法(Western Blotting)检测蛋白表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性.结果 与人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1相比,人甲状腺癌细胞K1、BCPAP、TPC-1中SNHG7的表达水平显著升高[(1.42±0.16)、(1.51±0.18)、(2.56±0.15)比(1.01±0.05)];miR-331-3p的表达水平显著下降[(0.63±0.11)、(0.60±0.10)、(0.42±0.08)比(1.00±0.06)],差异有统计学意义(P<0.05).与si-NC组相比,si-SNHG7组TPC-1细胞中细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)的表达水平显著降低,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的表达水平显著升高,TPC-1细胞活性显著降低[24 h:(0.20±0.06)比(0.49±0.10),48 h:(0.50±0.13)比(1.10±0.22),72 h:(0.60±0.13)比(1.60±0.10)],迁移细胞数降低[(63±8.97)个比(144±11.36)个],侵袭细胞数降低[(55±10.03)个比(136±13.38)个],差异有统计学意义(P<0.05).SNHG7可靶向调控miR-331-3p的表达.抑制miR-331-3p表达可逆转干扰SNHG7对TPC-1细胞的作用.SNHG7可靶向调控miR-331-3p的表达.抑制miR-331-3p表达可逆转干扰SNHG7对TPC-1细胞的作用.结论 干扰SNHG7可通过上调miR-331-3p抑制TPC-1细胞的恶性生物学行为.     

微小 RNA-301b-3p靶向第 10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-301b-3p(miR-301b-3p)对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 本研究起止时间为2019年3—9月.人成骨细胞(hFOB)和骨肉瘤细胞U2OS、MG63购自美国菌种保藏中心.U2OS细胞分为miRNA抑制物阴性对照(anti-miR-NC)组、miR-301b-3p抑制物(anti-miR-301b-3p)组、anti-miR-301b-3p+小干扰RNA阴性对照(si-NC)组、anti-miR-301b-3p+第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)小干扰RNA(si-PTEN)组;实时荧光定量PCR(RT-qP-CR)检测miR-301b-3p表达水平;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告实验检测miR-301b-3p和PTEN的靶向关系.结果 与hFOB细胞相比,U2OS、MG63中miR-301b-3p表达水平[(0.89±0.09),(0.70±0.07)比(0.20±0.02)]显著升高.与anti-miR-NC组比较,anti-miR-301b-3p组U2OS细胞活性[(0.59±0.06)比(1.33±0.13)]显著降低,而凋亡率[(22.06±2.31)％比(7.48±0.78)％]、PTEN蛋白表达[(0.69±0.07)比(0.35±0.03)]显著升高.PTEN是miR-301b-3p的直接靶基因.与anti-miR-301b-3p+si-NC组比较,anti-miR-301b-3p+si-PTEN组U2OS细胞活性[(1.16±0.12)比(0.56±0.06)]显著升高,而凋亡率[(10.28±1.16)比(22.12±2.34)]显著降低.结论 抑制miR-301b-3p表达可通过调控PTEN抑制骨肉瘤细胞增殖,促进细胞凋亡.     

微小 RNA-425-5p靶向调控 PTEN表达促进宫颈癌海拉细胞增殖、侵袭和迁移的实验研究

目的 探讨微小RNA(miR)-425-5p对宫颈癌海拉细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制.方法 2018年10月至2019年10月,利用Lipofectamine TM 2000将miR-425-5p模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitor)及其阴性对照转染至海拉细胞中,采用实时荧光定量PCR检测细胞中miR-425-5p的表达情况,MTT法检测细胞增殖活力,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移,蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞中磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)蛋白的表达.采用生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因实验验证miR-425-5p和PTEN的靶向关系.将PTEN过表达质粒pcDNA3.1-PTEN和PTEN干扰序列siRNA-PTEN转染至海拉细胞后,观察PTEN对海拉细胞增殖活力、克隆形成能力、侵袭能力和迁移能力的影响.结果 与各自阴性对照比较,miR-425-5p过表达可促进海拉细胞增殖[(142.25±11.32)％比(100.00±6.67)％]、克隆形成、侵袭[(133.28±9.86)个比(77.46±5.32)个]和迁移[(187.56±15.12)个比(115.35±10.26)个]并下调PTEN蛋白表达,而miR-425-5p低表达则抑制海拉细胞增殖[(58.38±3.45)比(100.00±5.74)]、克隆形成、侵袭[(43.32±3.62)个比(75.65±6.15)个]和迁移[(62.28±4.05)个比(109.72±9.84)个]并上调PTEN蛋白表达(P<0.05).双荧光素酶报告基因实验证实,PTEN是miR-425-5p的靶基因;PTEN过表达可促进海拉细胞增殖[(66.52±4.36)％比(100.00±6.18)％]、克隆形成、侵袭[(46.23±3.13)个比(71.65±5.24)个]和迁移[(62.65±4.26)个比(108.42±8.57)个],而PTEN低表达则抑制海拉细胞增殖[(136.52±9.85)个比(100.00±7.05)个]、克隆形成、侵袭[(110.27±9.85)个比(70.52±6.18)个]和迁移[(168.78±16.96)个比(113.26±10.13)个].结论 miR-425-5p可通过靶向调控PTEN表达促进宫颈癌海拉细胞增殖、侵袭和迁移.     

LncRNA KCNQ1OT1通过调控 miR-506-3p表达调节喉鳞状细胞癌细胞的生物学行为

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1OT1)对喉鳞状细胞癌细胞生物学的影响及作用机制.方法 于2019年5月至2020年2月,采用RT-qPCR法检测了45例来自山东大学齐鲁医院桓台分院喉鳞状细胞癌病人的癌组织和癌旁组织及购自上海研生实业有限公司的人胚肺成纤维细胞WI-38和购自中国科学院上海细胞库的喉鳞状细胞癌细胞系(EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345)中KCNQ1OT1和miR-506-3p表达.以HCC345细胞为研究对象,转染KCNQ1OT1小干扰RNA或共转染KCNQ1OT1小干扰RNA与miR-506-3p抑制剂至HCC345细胞后,MTT法、流式细胞术、Transwell分别检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭.双荧光素酶报告基因实验验证KCNQ1OT1与miR-506-3p的调控关系.结果 喉鳞状细胞癌组织中KCNQ1OT1表达高于癌旁组织[(0.81±0.09)比(0.27±0.08)],miR-506-3p表达低于癌旁组织[(0.24±0.08)比(0.83±0.09)].喉鳞状细胞癌细胞系(EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345)中KCNQ1OT1表达均高于WI-38细胞[(2.44±0.22)、(2.69±0.21)、(3.61±0.24)比(1.00±0.13)],miR-506-3p表达均低于WI-38细胞[(0.41±0.13)、(0.30±0.12)、(0.22±0.11)比(1.00±0.12)].与未敲减KCNQ1OT1的HCC345细胞比较,敲减KCNQ1OT1的HCC345细胞活力[(0.41±0.06)比(0.81±0.12)]、迁移数[(86.32±15.21)个比(162.31±20.23)个]和侵袭数[(65.23±12.05)个比(140.26±18.27)个]均降低,细胞凋亡率升高[(34.13±3.60)％比(3.79±2.37)％].KCNQ1OT1在HCC345细胞中负调控miR-506-3p表达.敲减miR-506-3p逆转敲减KCNQ1OT1对HCC345细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响.结论 KCNQ1OT1在喉鳞状细胞癌组织和细胞系中表达升高,其通过靶向miR-506-3p促进喉鳞状细胞癌细胞的恶性生物学行为.     

miR- 221 表达与K 562/A 02 细胞耐药关系的探讨

目的观察miR-221表达与K562/A02细胞耐药的关系。方法常规培养K562/A02细胞株作为对照组,选择通过反义寡核苷酸特异性抑制K562/A02细胞中miR-221表达细胞株作为实验组,应用实时荧光定量RT-PCR方法检测两组细胞中miR-221表达情况。采用MTT法比较两组细胞对化疗药物的敏感性。结果荧光定量RT-PCR结果显示,实验组细胞中miR-221表达较对照组明显降低,（P〈0.05）,两组比较差异倍数均值为-8.43±2.18。阿霉素对实验组细胞的IC50为0.0375mg·L-1,阿霉素对对照组细胞的IC50为4.32mg·L-1,后者的耐药倍数是实验组的115倍。结论反义寡核苷酸能够抑制K562/A02细胞中miR-221的表达,这种抑制作用能够逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性。miR-221表达与K562/A02细胞耐药性密切相关。     

微小 RNA?9?5p调控脂多糖诱导小鼠树突状细胞免疫功能的机制研究

目的 研究微小RNA-9-5p(miR-9-5p)对脂多糖炎性损伤小鼠树突状细胞(DCs)免疫功能的影响,并探讨其机制.方法 该研究于2019年1—9月完成.小鼠树突状细胞DC2.4购于美国模式培养物中心.运用脂多糖(LPS)处理DC2.4细胞,建立炎性树突状细胞损伤模型;将miRNA模拟物阴性对照(miR-NC)、miR-9-5p模拟物(mimics)、miRNA抑制物阴性对照(anti-miR-NC)、miR-9-5p抑制剂(anti-miR-9-5p)、小干扰RNA无序对照(si-NC)组、信号转导和转录激活因子6(STAT6)的小干扰RNA(si-STAT6)、miR-9-5p mimics+空载体质粒(pcDNA)、miR-9-5p mimics+STAT6过表达质粒(pcDNA-STAT6)均用脂质体法转染至LPS诱导的DC2.4细胞;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中miR-9-5p、STAT6、白细胞分化抗原80(CD80)、白细胞分化抗原86(CD86)、白细胞介素-12(IL-12)的mRNA表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中STAT6的蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验检测细胞的荧光素酶活性.结果 与正常DC2.4相比,脂多糖炎性损伤的DC2.4细胞中miR-9-5p表达(0.16±0.01)比(1.00±0.08)降低,STAT6表达(3.02±0.26)比(1.00±0.07)升高(P<0.05);过表达miR-9-5p可降低LPS诱导的DC2.4细胞中CD80(0.31±0.03)比(1.00±0.08)、CD86(0.29±0.02)比(1.01±0.06)、IL-12(0.46±0.04)比(1.00±0.05)的表达;敲减STAT6可降低LPS诱导的DC2.4细胞中CD80(0.42±0.04)比(1.00±0.08)、CD86(0.34±0.03)比(0.99±0.07)、IL-12(0.29±0.02)比(1.01±0.08)的表达;miR-9-5p明显的抑制野生型STAT6细胞的荧光活性,并负向调控STAT6的表达水平;重要的是,过表达STAT6可逆转过表达miR-9-5p对LPS诱导的DC2.4细胞中CD80[(1.68±0.13)比(1.00±0.06)]、CD86[(1.79±0.15)比(0.99±0.08)]、IL-12[(1.82±0.18)比(0.98±0.09)]的抑制作用.结论 miR-9-5p抑制LPS诱导的DC2.4细胞的免疫功能,其机制可能与靶向STAT6有关,将可为炎性疾病的治疗提供新靶点.     

miR-126-5p通过靶向 Peli2影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮 -间质转化发生

目的 探讨微小RNA-126-5p(miR-126-5p)通过靶向pellino E3泛素蛋白连接酶家族成员2(Peli2)影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)发生的分子机制.方法 本研究起止时间为2018年12月至2019年12月.体外培养人肾小管上皮细胞HK-2(美国ATCC),分别使用5 mmol/L、30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h,分别记作对照组、模型组.采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测miR-126-5p、Peli2的表达水平.利用脂质体转染法分别将miR-126-5p寡核苷酸模拟物(miR-126-5p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、Peli2小分子干扰RNA(si-Peli2)及其阴性对照(si-NC)转染至HK-2细胞,使用30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h.Western blot检测上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指蛋白(Snail)表达量;双荧光素酶报告实验验证miR-126-5p与Peli2的靶向关系.结果 与对照组相比,模型组miR-126-5p[(1.00±0.10)比(0.32±0.03)]、E-Cadherin[(0.86±0.09)比(0.35±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05),Peli2[(0.42±0.04)比(1.05±0.11)]、N-Cadherin[(0.45±0.05)比(0.99±0.10)]、Vi?mentin[(0.32±0.03)比(0.92±0.09)]、Snail[(0.22±0.02)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05);转染miR-126-5p mimics,与转染miR-NC相比,E-Cadherin[(0.34±0.03)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.02±0.11)比(0.53±0.05)]、Vimentin[(0.95±0.10)比(0.48±0.05)]、Snail[(0.72±0.07)比(0.36±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);转染si-Peli2后,与转染si-NC相比,E-Cadherin[(0.24±0.03)比(0.70±0.07)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.05±0.12)比(0.50±0.05)]、Vimentin[(0.96±0.10)比(0.38±0.04)]、Snail[(0.74±0.07)比(0.40±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);miR-126-5p能够特异性结合Peli2,Peli2是miR-126-5p的靶基因;Peli2过表达后可明显逆转miR-126-5p过表达对高糖诱导的HK-2细胞EMT的影响.结论 miR-126-5p通过靶向Peli2抑制糖尿病肾病肾小管上皮细胞EMT发生.     

微小 RNA-335-3p靶向小鼠双微体基因调控骨髓瘤细胞的增殖和凋亡

目的 探讨微小RNA(miR)-335-3p对骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 2018年5月至2019年1月,培养正常骨髓细胞MNC和骨髓瘤细胞KM3和U266,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-335-3p表达水平.将KM3细胞分为miR-NC组(转染模拟对照序列)、miR-335-3p组[转染miR-335-3p模拟物(miR-335-3p mimics)]、pcDNA3.1+miR-335-3p组(共转染空载体和miR-335-3p mimics)和pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p组[共转染小鼠双微体基因(MDM2)过表达载体和miR-335-3p mimics],MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡的影响,蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(P21)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白和Bcl-2相关X(Bax)蛋白表达.双荧光素酶报告基因实验验证KM3细胞中miR-335-3p与MDM2调控关系.结果 骨髓瘤细胞KM3和U266中miR-335-3p表达水平分别为0.24±0.01、0.38±0.02,显著低于正常骨髓细胞MNC中的miR-335-3p表达水平0.77±0.03(均P<0.05).与miR-NC组比较,miR-335-3p组KM3细胞吸光度[48 h:(0.60±0.03)比(0.99±0.06);72 h:(0.82±0.05)比(1.67±0.07)]、细胞中cyclin D1和Bcl-2蛋白表达均降低(均P<0.05),细胞凋亡率[(24.31±0.99)％比(8.13±0.83)％]、细胞中P21和Bax蛋白表达均升高(均P<0.05).miR-335-3p在KM3细胞中负调控MDM2表达.与pcDNA3.1+miR-335-3p组比较,pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p组KM3细胞吸光度[48 h:(0.80±0.05)比(0.63±0.04);72 h:(1.28±0.06)比(0.88±0.05)]、细胞中cyclin D1和Bcl-2蛋白表达均升高(均P<0.05),凋亡率[(15.34±0.66)％比(23.98±1.41)％]、细胞中P21、Bax蛋白表达均降低(均P<0.05).结论 miR-335-3p可能通过下调MDM2表达抑制骨髓瘤细胞的增殖,并诱导细胞凋亡.     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建ber/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/abl mRNA和P210蛋白的影响.方法:根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tusch Ⅰ设计原则,选择设计双链小干扰RNA(siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达.结果:构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24 h后,pTER117使bcr/abl mRNA的相对水平下降50%,使P210蛋白下降47%.结论:bcr/abl融合基因siR-NA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达.     

miR-373靶向调控同源异型盒基因 B3表达影响子宫内膜癌 Ishikawa细胞生物学特性的实验研究

目的 探讨微小RNA(miR)-373靶向调控同源异型盒基因B3(HOXB3)表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 本研究起止时间为2018年2月至2019年6月,将体外培养的Ishikawa细胞分为抑制剂阴性对照(inhibitor-NC)组(转染inhibitor-NC)、miR-373抑制剂(inhibitor)组(转染miR-373 inhibitor)、miR-373 inhibitor+siNC组(共转染miR-373 in?hibitor和NC siRNA)和miR-373 inhibitor+siHOXB3组(共转染miR-373 inhibitor和HOXB3 siRNA),采用实时荧光定量PCR检测Ishikawa细胞中miR-373的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-373和HOXB3的靶向关系,采用免疫印迹法检测Ishikawa细胞中HOXB3蛋白的表达,细胞计数(CCK-8)法、Transwell实验和膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)双染法检测各组细胞增殖、侵袭和凋亡能力.结果 HOXB3是miR-373的靶基因.与inhibitor-NC组相比,miR-373 inhibitor组、miR-373 inhib?itor+siNC组和miR-373 inhibitor+siHOXB3组细胞中miR-373表达水平[(1.00±0.11)比(0.32±0.02)/(0.36±0.03)/(0.34±0.03)]和细胞增殖活力[24 h(0.63±0.04)比(0.41±0.03)/(0.43±0.03)/(0.52±0.03);48 h(0.97±0.06)比(0.68±0.05)/(0.72±0.06)/(0.85±0.05);72 h(1.35±0.11)比(0.88±0.08)/(0.92±0.07)/(1.12±0.09)]、穿膜细胞数[(85.26±8.72)个比(37.64±2.85)个/(40.55±3.23)个/(61.38±3.64)个]均明显降低,而细胞凋亡率[(8.75±1.23)％比(25.64±3.38)％/(28.48±3.26)％/(14.25±2.02)％]和细胞中HOXB3蛋白的表达水平[(0.27±0.03)比(0.77±0.06)/(0.73±0.06)/(0.51±0.03)]均明显升高(P<0.05);且miR-373 inhibitor+siHOXB3组中各指标的变化强度明显低于miR-373 inhibitor组(P<0.05);而miR-373 inhibitor+siNC组和miR-373 inhibitor组之间无明显差异(P>0.05).结论 下调miR-373表达可通过靶向HOXB3抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、侵袭并促进细胞凋亡.