p27~(Kip1)诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的:探讨过表达的p27Kip1对肝癌细胞的抑制作用。方法:利用脂质体介导法将真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1基因导入HHCC细胞中,用Westernblot检测p27Kip1是否导入到肝癌细胞中;用流式细胞仪检测过表达的p27Kip1对肝癌细胞HHCC的抑制作用;电子显微镜技术探讨过表达的p27Kip1抑制肝癌细胞生长的可能机制。结果:Westernblot检测表明,转染p27Kip1的HHCC细胞大部分有p27Kip1蛋白的表达;而转染空载体或未转染的HHCC细胞,均未见p27Kip1蛋白表达。经连续3次克隆化后,转染pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1的HHCC细胞100%表达p27Kip1蛋白。过表达的p27Kip1对HHCC细胞有明显的抑制作用,其抑制率为49.09%～56%;过表达的p27Kip1可以封闭G1期的进程和诱导肝癌细胞发生凋亡,其凋亡百分比为12.3%。结论:过表达的p27Kip1可以通过诱导肝癌细胞凋亡抑制肝癌细胞生长。     

原发性胆囊癌中p16基因蛋白表达及临床意义

目的 探讨Ｐ１６基因蛋白与胆囊癌发生,发展及临床预后的关系,方法 采用免疫组化方法对３８例原发性胆囊癌和２０例慢性胆囊炎,Ｐ１６的表达进行观察。结果 Ｐ１６在胆囊良性病变中的阳性表达率明显高于胆囊癌（＊Ｐ〈０．０１）,Ｐ１６基因蛋白表达与胆囊癌的浸润性及淋巴结密切相关（Ｐ〈０．０１）,但与肿瘤的病理类型及分化程度无相关性（Ｐ〉０．０５）,结论 检测Ｐ１６对临床正确估计胆囊癌的浸恶性循环性,淋巴结转     

p16和p15基因在子宫内膜癌中的表达

目的：探讨抑癌基因p16及p15在子宫内膜癌、子宫内膜不典型增生及正常子宫内膜组织中的表达及其与子宫内膜癌的关系。 方法：应用免疫组化技术检测57例子宫内膜癌、8例子宫内膜不典型增生、7例子宫内膜增生过长及7例正常增生期子宫内膜组织中抑癌基因p16、p15的表达。 结果：p16在子宫内膜癌组织及非癌子宫内膜组织中表达率分别为40.4%和77.3%,二者表达率差异有显著性(P<0.05),在子宫内膜癌中p16表达与病理类型、病理分级及手术-病理分期有关,与肌层浸润无关;p15在子宫内膜癌及非癌子宫内膜组织中表达率分别为47.4%和86.3%,二者比较差异有显著性(P<0.05),在子宫内膜癌组织中p15的表达与病理分级有关,与病理类型、肌层浸润及手术-病理分期无关,子宫内膜癌组织中p16与p15表达呈正相关（r=0.91,P<0.05）。 结论：p16和p15表达缺失在子宫内膜癌的发生发展过程中发挥一定作用,其中以p16更为显著;p16和p15的表达具有一致性,功能上有一定的互补作用。     

尤文肉瘤细胞凋亡及p15表达的研究

通过对尤文肉瘤细胞凋亡指数及相关调控基因表达产物p15蛋白的检测,了解其在尤文肉瘤中的表达水平,并初步探讨其临床及生物学意义.     

大肠肿瘤bcl-2和C-MYC基因的表达及其意义

目的探讨大肠癌和大肠腺瘤中细胞凋亡相关基因ｂｃｌ－２和Ｃ－ＭＹＣ的表达及临床意义。②方法应用免疫组织化学方法对４２例大肠癌,３８例大肠腺瘤和１５例正常大肠黏膜中ｂｃｌ－２,Ｃ－ＭＹＣ的表达率及表达强度进行观察和比较。③结果大肠癌和大肠腺瘤ｂｃｌ－２和Ｃ－ＭＹＣ基因阳性表达率均显著高于正常大肠黏膜（χ２＝４．２０～２０．６６,Ｐ＜０．０５）,大肠癌ｂｃｌ－２和Ｃ－ＭＹＣ基因阳性表达率显著高于大肠腺瘤（χ２＝９．４０,８．７５,Ｐ＜０．０５）;大肠癌ｂｃｌ－２和Ｃ－ＭＹＣ的表达强度均显著高于大肠腺瘤或正常大肠黏膜（χ２＝４．９８～１６．８４,Ｐ＜０．０５）。ｂｃｌ－２和Ｃ－ＭＹＣ基因在大肠癌中的表达率与病人的性别、年龄、组织类型、浸润深度、淋巴结转移及Ｄｕｋｅｓ分期均无明显关系（χ２＝０～１．５６,Ｐ＞０．０５）。④结论ｂｃｌ－２和Ｃ－ＭＹＣ基因过度表达可能与大肠肿瘤的发生有关,而对大肠癌病人的预后没有明显生物学意义。     

外源性mIκBα基因抑制肝癌细胞HepG2的生长

OBJECTIVE: To observe the expression of mIkappaBalpha, the inhibitor of NFkappaB, in HepG2 heptocellular carcinoma cells and the inhibitory effect of mIkappaBalpha on HepG2 cell growth. METHODS: The adenovirus containing mIkappaBalpha or the packaging vector were harvested from 293 packaging cells to infect HepG2 cells, in which the expression of green fluorescence protein (GFP) and mIkappaBalpha protein were detected. The plating efficiency and colony-forming ability in soft agar were evaluated, cell growth curve was generated and the tumor growth observed in nude mice. RESULTS: HepG2 cells infected by the packaged adenovirus (HepG2/Adv cells) had positive GFP expression, and those infected by the adenovirus containing mIkappaBalpha (HepG2/Ad-mIkappaBalpha cells) showed mIkappaBalpha protein expression, as demonstrated by Western blot analysis. HepG2/Adv cells exhibited markedly lowered colony-forming ability as compared with that of the HepG2/Adv and HepG2 cells, and the latter two cells, but not the former cells, could survive in soft agar and form colonies in the shape of mulberries. Cell growth curve showed that the Hep G2/Ad-mIkappaBalpha cells had also significantly reduced growth rate, but their saturation density in culture was comparable with the other two cells. Four weeks after inoculation in nude mice, HepG2/Ad-mIkappaBalpha and HepG2/Adv cells showed no significant difference in tumorigenicity (80% vs 100%, respectively), but the tumor volume generated by the former cells was significantly smaller (P<0.05). CONCLUSION: mIkappaBalpha gene can inhibit the growth of HepG2 heptocellular carcinoma cells.     

原发性膀胱移行细胞癌p15及p16基因缺失的研究

在人类多种类型的肿瘤中频繁出现染色体 9ｐ2 1- 2 2区域改变[1] ,这提示该区的改变可能与肿瘤的发生、发展有关。ｐ15、ｐ16基因位于该区 ,为阐明其在原发性膀胱移行细胞癌(ＴＣＣ)中的作用 ,作者对其在膀胱ＴＣＣ中的缺失改变进行了研究。一、材料与方法1 标本来源 :38例病理检查证实的原发性膀胱ＴＣＣ和9例正常膀胱粘膜标本由近两年武汉大学中南医院泌尿外科手术获取。 - 70℃冰箱速冻保存 ,以供提取ＤＮＡ。2 ＤＮＡ提取及聚合酶链反应 (ＰＣＲ)方法建立 :组织ＤＮＡ提取依常规方法进行。正常膀胱粘膜ＤＮＡ作对照 ,3磷酸甘油醛脱氢酶…     

野生型p53基因抑制胆囊癌细胞裸鼠体内生长的实验研究

目的：研究转染野生型p53（wtp53）基因对胆囊癌细胞裸鼠体内生长的影响。方法：在脂质体介导下将含有wtp53的真核表达质粒pCMV—p53，导入GBC—SD细胞中。用G418筛选，建立转染克隆细胞系。以PCR、RT—PCR和蛋白质印迹法证实外源p53基因的整合与表达。用裸鼠移植瘤试验检测体内致瘤性的影响。结果：野生型p53基因成功的导入胆囊癌细胞系，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。表达外源wtp53的GBC—SD—wtp53细胞，裸鼠体内致瘤性受到显著抑制。结论：野生型p53基因可有效抑制胆囊癌细胞在裸鼠体内的生长。     

鼻咽癌细胞中MDM2基因扩增与表达的研究

应用斑点杂交和半定量逆转录－多聚酶链反应技术对３２例鼻咽癌（ＮＰＣ）标本,１０例慢性鼻咽炎症粘膜（ＣＩＮＥ）标本,ＮＰＣ细胞株进行ＭＤＭ２基因扩增与表达的检测。结果显示;１例ＮＰＣ有ＭＤＭ２基因的扩增,ＮＰＣ细胞株ＨＯＮＥ１和１０例ＮＰＣ有ＭＤＭ２ ｍＲＮＡ高表达,ＣＩＮＥ无ＭＤＭ２基因的扩增及ｍＲＮＡ的高表达。     

5-氮-2′-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株p16/CDKN2基因去甲基化的转录调节作用

目的 探讨DNA5′CpG岛去甲基化对RKO结肠癌细胞株p16／CDKN2抑癌基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响,寻找抗癌治疗的新靶点。方法 用特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine)作用结肠癌细胞株72h后,甲基特异性PCR(Methylation-specific PCR．MSP)、T-A克隆及DNA测序分析甲基化状态,四唑盐(MTT)比色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量PCR(Real-timePCR)、免疫组织化学染色(IHC)及蛋白印迹(Western blot)检测用药前后RKO细胞株生长倍增时间以及对p16／CDKN2 mRNA及蛋白表达的影响。结果 (1)未经5-Aza-deoxycytidine作用的对照组RKO细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经5-Aza-CdR作用的RKO结肠癌细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶;(2)与对照组相比,3组不同浓度5-Aza-2′-deoxycytidine均能明显抑制肿瘤细胞生长,倍增时间分别增加了1．49、1．64、1．87倍;(3)经5-Aza-2′-deoxycytidine作用后,p16／CDKN2基因mRNA表达分别增加了4．89、16．91、19．97倍,而DNA甲基转移酶mRNA表达显著降低;(4)免疫组化染色和蛋白印迹均显示,经处理后的肿瘤细胞p16／CDKN2蛋白表达呈明显增强。结论 DNA异常甲基化与RKO结肠癌细胞有关;特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-2′-deoxycytidine能较好地逆转RKO细胞DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致p16／CDKN2基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

人喉癌组织中p15、p16基因缺失和STK15基因过表达的研究

目的 探讨p15、p16基因和STK(丝氨酸/苏氨酸激酶)15基因表达与喉癌发生、发展的关系。方法 自50例术前未经化疗和放疗的喉鳞状细胞癌患者的新鲜手术标本中,分别取癌组织和癌旁正常组织进行以下检测:(1)提取DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术,进行p15基因第二外显子(p15E2)和p16基因第二外显子(p16E2)纯合缺失研究;(2)提取RNA,反转录合成cDNA,以β-肌动蛋白基因为内对照进行PCR扩增,分析STK15基因表达的水平。同时检测人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系STK15基因表达水平。结果 喉癌组织p15E2纯合缺失率为12％(6/50),p16E2纯合缺失率为14％(7/50),p15E2、p16E2共同缺失率为6％(3/50)。50例患者中34例(68％)癌组织STK15基因表达高于癌旁正常组织;全组患者癌组织STK15基因表达/β-肌动蛋白基因表达平均密度比值(ADV)为1.03±0.30,癌旁正常组织STK15基因表达/β-肌动蛋白基因表达ADV为0.89±0.22,其间差异有非常显著意义(t=4.333,P<0.01)。Hep-2细胞系中STK15基因表达高于内对照β-肌动蛋白基因。结论p15E2、p16E2纯合缺失和STK15基因过表达可能在喉癌的发生及恶性进展中发挥一定作用。     

变性高效液相色谱法对恶性肿瘤患者血浆DNA p53突变的检测

目的:探讨扩增恶性肿瘤患者血浆DNA的可行性,建立一种快速检测血浆DNA突变的新方法。方法:选取恶性肿瘤患者40例,提取血浆DNA,采用聚合酶链反应(PCR)扩增p53基因外显子7,用变性高效液相色谱法(DHPLC)对产物进行突变分析,并与测序结果比较。结果:40例恶性肿瘤患者血浆提取的DNA均能扩增出目的片断,DHPLC检测到有8例突变,与DNA直接测序结果一致。结论:对恶性肿瘤患者血浆DNA扩增是可行的,DHPLC可作为一种快速简便的突变检测方法。     

人pre-miR-15a真核表达载体的构建及其对Raji细胞生长的抑制作用

目的 构建人pre-miR-15a真核表达载体,并研究其对Raii细胞的生长抑制作用.方法 将pre-miR-15a与目标载体(PGCSIL-GFP)定向连接,转化细菌感受念细胞,PCR鉴定阳性克隆,并测序.利用脂质体法将该载体转染Raji细胞,实验分为空白对照组、阴性对照质粒组和pre-miR-15a组(n=5).RT-PCR检测Bel-2 mRNA表达,间接免疫荧光法检测Bcl-2蛋白表达,台盼蓝细胞计数法检测细胞增殖活性.结果 PCR 阳性克隆鉴定及测序结果 均与日的序列一致.倒置荧光显微镜下见绿色荧光表达;RT-PCR法示各组间Bcl-2 mRNA表达差异无显著性(P>0.05);间接免疫荧光法示pre-miR-15a组的Bcl-2蛋白表达量较空白对照组和阴性对照质粒组显著降低(P<0.05);台盼蓝拒染法示pre-miR-15a组Raji细胞生长受抑.结论 本实验成功构建了per-miR-15a真核表达载体,且pre-miR-15a可以抑制Raji细胞生长.     

Effect of adenovirus-mediated p27 gene expression on the proliferation and apoptosis of HL-60 and Raji cell lines

Background p27 is an essential mediator of cell cycle control,which plays a key negative role in the proliferation and tumorigenesis of certain cell types. Here, we designed this study to explore the possible effects of p27 on the proliferation and apoptosis of HL-60 and Raji cell lines. Methods HL-60 and Raji cells were transfected with p27 via an adenovirus-mediated approach. The efficiency of Adp27 infection and the expression of p27 mRNA and protein were evaluated by X-gal staining, RT-PCR, and flow cytometry. The proliferation and apoptosis of HL-60 and Raji cells were estimated by means of trypan blue staining, M‘l-r assay, Annexin V/PI, and DNA ladderelectrophoresis. Results The infection efficiencies in HL-60 and Raji cells were 40.3% and 32.0%, respectively. RT-PCR and flow cytometry showed that there was significant expression of p27 mRNA and protein in HL-60 and Raji cells infected with Adp27; on the other hand, uninfected HL-60 cells showed faint traces of p27 mRNA and protein and Raji cells showed nearly no signs of p27 mRNA and protein. As demonstrated by a cell growth curve and by an MTT assay, strong time-dependent proliferation inhibition was apparent in HL-60 and Raji cells infected by Adp27. After 72 hours of infection, the Annexin V^ /PI^- apoptotic cell rates in HL-60 and Raji cell lines were 46.9% and 35.7%, respectively, significantly higher than in the control groups (4.7% and 5.6%, respectively). Typical DNA ladder bands were detectable in HL-60 and Raji cells after 48 hours of Adp27 infection. Conclusions Adenoviral vector-mediated p27 gene transfection of HL-60 and Raji cells leads to the inhibition of cellular proliferation and the promotion of cell apoptosis. This technique may provide an approach to gene therapy for leukemia or lymphoma.     

非小细胞肺癌p15基因缺失的研究

目的　研究 p1 5基因的纯合性缺失与非小细胞肺癌的发生、发展和预后的关系。　方法　应用聚合酶链反应 (PCR)对 97例非小细胞肺癌与 1 0例非肿瘤疾病的正常肺组织和 2例畸胎瘤进行 p1 5基因的检测。　结果　 97例非小细胞肺癌中 ,p1 5基因的缺失率为 44.3 % ,而正常肺组织和畸胎瘤均未发生缺失 ;不同病理类型间缺失率差异无统计学意义 ,不同TNM分期中 ,p1 5的缺失率是不同的 ,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别为 2 9.4%、40 .0 %和 5 3 .3 % (P <0 .0 5 ) ;有淋巴结转移组的缺失率为 5 2 .2 % ,高于无淋巴结转移组的 2 6.7% ;p1 5基因缺失组的术后 1、3年生存率分别为 88.4%和 3 2 .6% ,较无缺失组的 97.7%和5 1 .2 %为低 (P <0 .0 1 )。　结论　p1 5基因缺失与非小细胞肺癌的发生、发展相关 ,是预后的独立预测指标。     

Survivin siRNA对肝癌细胞BEL-7402的增殖与对Survivin基因及蛋白表达的作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)对BEL-7402细胞的生长抑制与生存素(Survivin)基因及蛋白表达的影响。方法:合成Survivin siRNA,以不同浓度转染BEL-7402细胞,MTT法测定细胞生长抑制率,RT-PCR、Western-Blot检测BEL-7402细胞Survivin mRNA及蛋白的表达差异。结果:BEL-7402细胞转染FAM荧光标记的siRNA后,细胞内有绿色荧光表达。分别以10、30、50nmol/LSurvivin siRNA转染细胞后,MTT测得的细胞生长抑制率分别为(38.80±1.71)%,(54.50±1.16)%,(66.79±1.10)%,RT-PCR测得的Survivin mRNA表达分别为0.42±0.02,0.28±0.01,0.12±0.01,Western-Blot测得Survivin蛋白表达分别为0.55±0.04,0.32±0.02,0.21±0.02,三项指标与空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。随着Survivin siRNA浓度的增加,细胞抑制率呈上升趋势,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达逐渐降低,呈浓度-效应关系。结论:Survivin siRNA能抑制BEL-7402细胞的增殖与Survivin基因和蛋白表达。     

原发性肝细胞癌癌组织中p33ING1b与p53基因的表达

目的研究p33ING1b与p53蛋白在原发性肝细胞癌中表达的相关性及ING1b基因在原发性肝细胞癌中的突变率.方法应用免疫组织化学SP方法检测了57例原发性肝细胞癌癌组织、51例癌旁肝组织及12例正常肝组织中p33ING1b和p53蛋白的表达,并分析了原发性肝细胞癌癌组织中乙肝病毒(HBV)的感染率;应用聚合酶链式反应(PCR)联合单链构象多态性(SSCP)方法检测了28例配对癌及癌旁肝组织中ING1b基因两个外显子的突变情况,对有异常泳动条带的DNA片段分别克隆测序.结果在57例原发性肝细胞癌癌组织中,p33ING1b、p53蛋白的阳性率分别为42.1%和57.9%,p33ING1b、p53表达均呈阳性者有19例(33.3%),且两者在癌组织中阳性分布区域相同;p33ING1b蛋白表达与p53蛋白表达在癌组织中呈显著正相关(r=0.783, P<0.01);配对癌旁肝组织及正常肝组织中p53蛋白表达均为阴性,p33ING1b蛋白在13例癌旁肝组织及2例正常肝组织中呈弱阳性表达;在57例原发性肝癌组织中有35例(61.4%)HBV X蛋白呈阳性,其病理类型均为肝细胞肝癌,在51例癌旁肝组织中检出HBV X蛋白阳性者39例(76.47%),癌组织中HBV感染与p33ING1b、p53蛋白表达均有关(P<0.01);PCR-SSCP结果表明,ING1b基因在原发性肝细胞癌中突变率较低为7.1%(2/28).结论 p33ING1b、p53蛋白在原发性肝细胞癌中的表达呈显著正相关,p33ING1b的存在可能还有其他不依赖p53蛋白的途径;HBV感染与p33ING1b、p53蛋白表达均有关;基因突变不是p33ING1b丧失抑癌功能的主要因素.     

高低转移人大肠癌细胞系基因表达谱差异

目的 用自制肿瘤转移相关基因cDNA微阵列研究人大肠癌高转移细胞系Lovo、SW620及低转移细胞系SW480、LS174T的基因表达谱差异,筛选与大肠癌转移相关的特异基因。方法 分别提取4种大肠癌细胞系及对照的正常大肠上皮组织的mRNA,逆转录成cDNA探针,经cy3和cy5标记后分别与含有399个肿瘤转移相关基因的微阵列杂交,用专用软件分析杂交信号强度。结果 高转移细胞系与低转移细胞系的基因表达谱有显著差异,其中有104个基因的表达值有意义,包括上调基因44个、下调基因60个。结论 大肠癌转移是由其发生过程中多个基因表达的复杂变化决定的,高转移细胞系与低转移细胞系比较存在差异的基因可能与高转移特性有关。