肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞

目的人骨髓间充质干细胞（hMSC）经过腺病毒介导转染肝细胞生长因子（Ad-HGF）后进行鉴定。方法密度梯度离心法分离培养原代hMSC,取第三代hMSC转染Ad-HGF。比较转染前后的细胞形态变化,流式细胞仪鉴定hMSC/Ad-HGF的表面标志物,ELISA测定培养液上清的HGF浓度。结果 HGF基因修饰前后,均为成纤维样细胞形态;流式测定hMSC/Ad-HGF与hMSC细胞表型一致;ELISA测得hMSC/Ad-HGF的培养液上清HGF浓度显著高于hMSC（P〈0.001）。结论经HGF基因修饰的hMSC,维持了原有的细胞形态及特异性细胞表型,且高表达HGF。     

肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞的研究进展

<正>肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)最初发现于肝组织中,是一种多功能细胞生长因子,拥有促血管生成、促细胞分裂等作用。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)具有多向分化潜能。有研究[1]表明,更多还原     

肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞迁移的影响

目的研究肝细胞生长因子（HGF）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）迁移的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离BMSCs,进行表面抗原表达及分化鉴定。使用Dunn chamber装置研究BMSCs的定向迁移。并且研究PI3K抑制剂LY294002对HGF诱导BMSCs迁移的影响。结果分离培养的BMSCs呈CD29、CD90、CD106阳性表达,CD34、CD45阴性表达,BMSCs可诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞。Dunn chamber迁移实验显示,外槽加入不同浓度的HGF,BMSCs迁移速率没有变化,迁移效率随着HGF浓度的增加而增加,50ng/ml与100ng/mlHGF均显著提高了细胞迁移效率;内外槽同时加入50ng/mlHGF,迁移速率与迁移效率均没有变化;经30μmol/LLY294002预处理1h后,HGF诱导的BMSCs的定向迁移受到抑制。结论 HGF能够趋化BMSCs的定向迁移,PI3K信号通路参与介导这一过程。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）在体外定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法：采用梯度离心法分离纯化雄性SD大鼠的mMSCs。A组原代培养；B组原代培养分别加刺激因子50ng／ml肝细胞生长因子（HGF）和50ng／ml成纤维细胞生长因子4（FGF-4），倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的7、14、21、28d，细胞免疫荧光法检测各组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达。采用过碘酸希夫（PAS）染色法检测各组细胞糖原染色情况。结果：分离纯化B组大鼠的mMSCs，应用HGF和FGF-4诱导10d后变为肝细胞样圆形。细胞免疫荧光测定B组显示，培养第7dAFP即出现阳性，第21d表达明显减弱；第7dCK-19染色阳性，以后增强；第14d白蛋白与CK-18染色开始阳性，以后表达逐渐加强。A组在培养过程中不表达AFP、ALB、CK-18和CK-19。糖原染色显示，B组第14d开始阳性，-直持续到第28d；A组未见阳性染色。结论：大鼠mMSCs在较高浓度的HGF及FGF-4诱导下可分化为肝细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞

目的：研究HGF、aFGF及OSM诱导MSCs成为肝细胞的能力及其在分化中的作用。方法：用HGF、aFGF、OSM诱导分化MSCs后,用化学发光法、RT—PCR法及谷氨酸脱氢酶法检测细胞AFP、ALB及尿素的表达情况。结果：除对照组外其余各组细胞均有AFP表达（P〈0．05）;对照组及a＋O组无ALB、尿素的表达,其余各组出现ALB及尿素的表达（P〈0．05）。结论：HGF联合aFGF、OSM及aFGF能够诱导MSCs分化为表达AFP、ALB、尿素的肝细胞;aFGF与OSM在没有HGF存在时不能诱导MSCs向较为成熟的肝细胞的分化。     

人VEGF基因腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探讨含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因腺病毒表达载体Ad-VEGF转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的可行性.方法 采用贴壁培养筛选法富集大鼠BM-MSCs.将HEK293细胞中扩增并经效价分析后的Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,通过对细胞转染效率、生长和活力的观察分析,以确定理想的感染复数(MOI)值.结果 本实验经HEK293细胞扩增制备的Ad-VEGF的病毒效价达8×108 pfu/ml;当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达最高值53％;而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs活性抑制明显.结论 成功实现Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,其最适MOI值为50.     

转染血管内皮细胞生长因子基因的同种异体骨髓间充质干细胞移植大鼠缺血心肌的实验研究

目的 腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因（AdVEGF165）转染同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（BM-SCs），移植到大鼠缺血心肌后，观察其对心功能的影响。方法 体外培养同种异体大鼠BMSCs，用AdVEGF165转染同种异体大鼠BMSCs，采用ELISA法检测血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达和分泌。结扎Wistar大鼠冠状动脉前降支，4周后随机将其分为4组，组Ⅰ：移植转染后的BMSCs；组Ⅱ：移植单纯BMSCs；组Ⅲ：心肌内注射AdVEGF。（基因治疗）；组Ⅳ：心肌内注射DMEM（对照组）。4周后通过超声检查观察心脏射血分数（EF）变化，评价其对心功能的影响；免疫组织化学观察移植的BMSCs在局部存活、分化情况。结果 ELISA检测提示：转染后BMSCs的培养上清液中有大量VEGF表达，较未转染组差异有极显著性意义（P〈0．01）。超声检查结果提示：组IEF改善幅度较组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ明显（均P〈0．01）。免疫组织化学检测提示：组Ⅰ、Ⅱ中大部分移植细胞能够在移植处存活并转化为心肌细胞。结论 转染AdVEGF165的同种异体BMSCs能有效修复大鼠心肌，并能改善其心功能。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

VEGF基因修饰人骨髓间充质干细胞对脑出血大鼠早期脑水肿的影响

  目的  探究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）基因修饰的人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）对脑出血大鼠早期脑水肿的影响。  方法  体外培养hBMSCs和经体外构建的 VEGF 基因慢病毒载体稳定转染的hBMSCs（hBMSCs/VEGF）细胞。采用尾状核注射Ⅰ型胶原酶和肝素方式,制备脑出血动物模型。术后2 h对大鼠进行改良神经功能缺损（mNSS）评分,鉴定造模是否成功。将SD大鼠随机分为假手术组（仅进针不注射造模剂）、脑出血模型组、生理盐水组、hBMSCs组和hBMSCs/VEGF组。造模后第3天,hBMSCs组和hBMSCs/VEGF组大鼠分别按分组右侧尾壳核内注射细胞悬液（2×106个细胞/kg体质量）进行细胞移植,生理盐水组相同部位注射等量生理盐水,假手术组、模型组大鼠不进行干预。干预后3 d、7 d分别进行mNSS评分,处死大鼠,分离脑右侧尾壳核区脑组织标本,干湿重法检测脑组织标本含水量,HE染色观察脑组织标本病理改变,免疫荧光和Western blot检测VEGF、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase, MMP-9）和水通道蛋白-4（aquaporin 4, AQP-4）表达。  结果  造模术后2 h,与假手术组大鼠比较,各组大鼠mNSS评分增高,均>8分,提示造模成功;在干预后3 d、7 d,模型组和NS组mNSS评分,脑组织含水量,MMP-9、AQP-4、VEGF蛋白表达高于假手术组（P<0.05）,干预后相同时间点,hBMSCs组上述指标较NS组和模型组减少（P<0.001）,hBMSCs/VEGF组上述指标高于hBMSCs组（P<0.05）;光镜下模型组和NS组大鼠脑组织出现明显出血灶和梗死灶,结构紊乱疏松,水肿改变明显,hBMSCs组出血灶和梗死灶减小,而hBMSCs/VEGF组相较hBMSCs组,脑组织结构疏松,呈空泡状,神经元出现多数核固缩等凋亡改变。  结论  hBMSCs移植可改善脑出血大鼠神经功能缺损,减轻脑水肿,但hBMSCs经VEGF基因修饰后移植将增加血管通透性,加重脑出血大鼠的早期脑水肿。     

Construction of hepatocyte growth factor gene recombinant adenovirus vector and its expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells

ObjectiveTo construct the adenoviral expression vector system containing human hepatocyte growth factor (hHGF) cDNA, and to further study the transduction efficiency and the expression of HGF in mesenchymal stem cells (MSCs). MethodsThe HGF cDNA was amplificated from the expression plasmid pCMV-HGF, and was subcloned into the adenovirus shuttle plasmid pDC316-IRES-EGFP vector containing a green fluorescence protein (GFP) reporter gene. Virus Ad-HGF was produced by homologous recombination in HEK293 package cells. Bone marrow derived MSCs were harvested and cultured, and then were transduced with Ad-HGF. The efficiency of Ad-HGF transduction was assessed by FACS analysis using GFP gene expression. And HGF/MSCs were generated. The HGF concentrations in supernatants of HGF/MSCs were determined by ELISA using anti-human HGF monoclonal antibody. Results The recombinant, named pDC316-HGF-IRES-eGFP, was digested with restriction enzyme, and the DNA sequencing of HGF was identical to the report in Genebank and did not reveal any mutation. GFP expression could be observed on the second day after packing of the linearized pAd-HGF in HEK293 cells and 7.15×1010pfu/ml titer of Ad-HGF was obtained. Forty-eight hours after transduction, 96.89% of HGF/MSCs were GFP positive. Peak concentration levels of hHGF(103ng/mL) in the cultured supernatants were detected on day 2 post-transduction, and the adenovirus-mediated expression of HGF by MSCs was maintained for at least 2 weeks in vivo. ConclusionOur data demonstrated that the adenovirus expression'vector system pDC316-HGF-IRES-EGFP has been constructed successfully, and their effective expressions also have been obtained in MSCs. This will provide material basis for the next study on liver regeneration after small-for-size liver transplantation.     

人肝细胞生长因子基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:构建人肝细胞生长因子(HGF)基因慢病毒载体pNL-HGF-增强绿色荧光蛋白(EGFP)并转染骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测HGF基因在BMSCs中的表达.方法:采用基因重组技术,利用限制性内切酶酶切获取HGF基因序列并克隆到慢病毒载体pNL-EGFP上,构建重组慢病毒质粒pNL-HGF-EGFP;将慢病毒...     

经phoenix细胞包装含人全长HGF基因的逆转录表达载体及体外感染骨髓间充质干细胞的研究

目的：构建含人全长肝细胞生长因子（HGF）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合的逆转录表达载体plEGFP-HGF，经phoenix细胞包装，病毒液感染骨髓间充质干细胞（BM—MSCs），研究phoenix细胞的包装能力与病毒感染效率。方法：将人全长HGFcDNA亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-N1中，获得HGF定向插入藿组于plEGFP-HGF，采用酶切法和测序法分别鉴定。用磷酸钙法经phoenix细胞包装，收集病毒上清，感染MSCs，经G418筛选获得阳性克隆，命名为HGF／MSCs细胞。ELISA法检测细胞培养上清中HGF，RT-PCR检测HGF受体c-met在MSCs中的表达。结果：重组逆转录病毒载体体系plEGFP-HGF经限制性内切酶切电泳后显示有2．3kb目的基因片段和6．9kb的线性化plEGFP-N1载体片段：荧光显微镜观察到GFP基因获得了表达。重组于测序结果与Genebank中HGF-cDNA序列相符。RT-PCR检测转染细胞中c-met基因mRNA表达水平升高。ELISA法检测细胞培养上清中HGF升高。结论：重组真核表达载体构建正确并在MSCs中获得高效、稳定表达，为其在进一步的体内外研究奠定基础。     

大鼠EPO真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建表达大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的真核表达质粒pEGFP-NI/EPO,并检测其在体外的表达.方法 从大鼠肾脏获得EPO基因片段并用RT-PCR方法 扩增,将其连接于真核表达质粒pEGFP-NI,测序鉴定后,用脂质体包裹转染大鼠骨髓问充质干细胞(mesenchymal stem cels,MSCs),采用免疫组化和RT-PCR检测EPO的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染大鼠MSCs细胞后可表达EPO蛋白.结论 成功构建的pEGFP-NI/EPO重组质粒能在体外表达EPO蛋白.     

pEGFP-C1-PEX真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓间质干细胞中的表达

目的构建pEGFP-C1-PEX真核表达载体并转染大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),观察其在MSCs内的表达。方法用RT-PCR法从大鼠C6胶质瘤细胞中扩增出带有XhoI、BamHI酶切位点的PEX基因片段,将PEX基因片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEG-FP-C1上,通过脂质体将pEGFP-C1-PEX转染入大鼠MSCs。结果pEGFP-C1-PEX真核表达载体构建成功,荧光显微镜下观察,pEGFP-C1-PEX表达载体转染到MSCs24h后可见PEX融合蛋白表达。结论pEGFP-C1-PEX真核表达载体能够在大鼠MSCs中表达PEX融合蛋白。     

SOX9基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建SOX9基因的慢病毒载体并使其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中表达.方法 通过RT-PCR获得人SOX9基因编码区(CDS)片段,将该片段克隆入质粒Pwpxl-MOD2中产生Pwpxl-MOD2/SOX9,将Pwpxl-MOD2/SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染293T细胞,获得携带目的基因SOX9基因的重组病毒.同时共转染Pwpxl-MOD2,pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G进另一组293T细胞包装产生空载体慢病毒作为阴性对照.包装好的慢病毒体外感染MSCs,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫印迹检测SOX9的表达;四甲基噻唑蓝(MTT)法测定慢病毒对细胞增殖能力的影响.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实慢病毒载体质粒Pwpxl-MOD中插入片段为基因SOX9.病毒感染MSCs后,经RT-PCR法和免疫印迹证实SOX9基因在MSCs中表达.MTT法检测示慢病毒感染对骨髓间克质干细胞的生长未产生显著影响.结论 成功构建SOX9基因的慢病毒载体并感染骨髓间充质干细胞后能够稳定表达SOX9.为研究椎间盘退变的基因及生物学治疗提供了实验依据.     

VEGF基因真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨经腺病毒表达载体转染血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)体内外基因表达的特点。方法构建VEGF基因腺病毒表达载体,将VEGF165基因转染到MSCs中。用RT-PCR法检测转基因MSCs中基因表达情况。结果转基因MSCs及其分化的子代细胞均有VEGF165的表达,并持续2周左右时间。结论经腺病毒表达载体转染VEGF165基因的MSCs在体内外均有良好的基因表达。     

c-met慢病毒载体的构建及稳定转染骨髓间充质干细胞

构建肝细胞生长因子受体(c-met)慢病毒载体,并稳定转染骨髓间充质干细胞(BMSCs).将c-met连接到慢病毒载体GV358上,重组获得慢病毒载体GV358-c-met.再将该重组体与病毒辅助质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒并测定其滴度为2×108 TU/ml.将此慢病毒转染BMSCs,经嘌呤霉素筛药后,荧光显微镜下检测荧光阳性率达100%,且Western blot证实该细胞株表达c-met蛋白.成功构建了c-met慢病毒载体,并建立了稳定表达c-met的BMSCs.