寻找一种诊治心肌损伤的新方法:鼠抗人cTnI单抗Fab段基因克隆和序列分析

背景为将鼠抗人cTnI单克隆抗体应用人体进行体内诊断或作为治疗心肌损伤的药物载体,必须降低鼠源性抗体的免疫源性,克服其人抗鼠抗体反应,需要对其进行人源化改造.目的克隆鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因并进行序列分析.设计单一样本研究.单位一所医科大学附属医院的心血管病研究所.材料本实验于2003-01/2004-05在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成.分泌鼠抗人cTnI单克隆抗体的杂交瘤细胞株(JS200202)由南京医科大学第一附属医院心血管病研究所提供.方法设计扩增鼠IgG重链Fd段及κ轻链引物,从分泌cTnI单抗的杂交瘤细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增,对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析.主要观察指标重链Fd段和κ轻链基因序列及其所属亚型.结果重链和轻链引物分别扩增出一约700 bp和800 bpDNA片段.经序列分析,与已发表的鼠IgG基因序列对比,其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠IgG1Fab段特征.在GenBank登录,登录号为AY484430(重链),AY484431(轻链);氨基酸序列登录号为AAR83243(重链),AAR83244(轻链).结论本实验室获得了完整的鼠源性抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因,为鼠抗人cTnI单克隆抗体的人源化改造奠定了基础.     

人天冬酰胺合成酶基因克隆和单克隆抗体的制备及鉴定

目的克隆人天冬酰胺合成酶（ASNS）基因，以基因工程技术表达ASNS融合蛋白，免疫动物，制备及鉴定鼠抗人ASNS的单克隆抗体，为深入研究L-天冬酰胺酶治疗中线鼻型自然杀伤细胞（NK）／T细胞淋巴瘤的机制奠定基础。方法用逆转录（RT）-PCR从人肝癌细胞株HepG2扩增目的片段，构建原核表达质粒pMS-ASNS，在大肠杆菌中表达融合蛋白MS2-ASNS。用纯化融合蛋白免疫雌性BALB／C小鼠，以常规杂交瘤技术制备鼠抗人ASNS单克隆抗体（ASNSMcAb）。进行抗体亚类测定和免疫印迹法（WB）分析，然后用免疫化学技术检测ASNS在肿瘤中的表达。结果克隆ASNS读码框的部分基因（NCBI和M27396，179～1420bp），PCR产物为1263bp。融合蛋白MS2-ASNS相对分子质量约为54700。筛选出2株能持续分泌抗ASNS单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分泌抗体亚类均为IgG2a。WB结果显示，抗ASNS单抗可与融合蛋白及细胞内ASNS蛋白特异性结合。免疫组织化学及免疫细胞化学证明，所得抗体能检测到肿瘤细胞中ASNS基因表达。结论成功克隆了ASNS基因，并制备和鉴定了鼠抗人ASNSMcAb，为深入研究L=天冬酰胺酶用于治疗中线鼻型NK／T细胞淋巴瘤的机制提供了工具。     

抗乙酰胆碱受体单抗的特性和可变区序列分析

重症肌无力是由抗乙酰胆碱受体抗体介导的自身免疫病，我们测定了２株抗ＡＣｈＲ单抗的特性发现，这２株抗体识别ＡＣｈＲ上同一表位，可变区核苷酸序列分析表明，二者的Ｈ链同源性为９５．５％，是由同一小鼠Ｊ５５８族种系基因编码的。Ｌ链的同源性达９９％。这２株抗体未能诱导出健康大鼠的重症肌无力症状，可能是因其分子结构已知致病性抗ＡＣｈＲ相差甚远所致。     

Ax新基因的序列分析及其家系的研究

目的探讨Ax亚型中国汉族家系的ABO基因的分子生物学特点。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应扩增法对血清学定为Ax血型的家系总共5份样本做基因分型，对其中4份样本进行直接测序，发现2份有异常杂合序列，进一步采用单倍体特异性引物进行序列测定。结果这个家系中2份ABO基因序列与ABO＊A101相比有3个位点发生了突变（467C〉T、829G〉A，1009A〉G），定为舭新基因，Genbank注册号为DQ092380。结论829位突变导致编码ABO糖基转移酶的277位氨基酸由缬氨酸（Val）转变为甲硫氨酸（Met），很大程度上降低了A2糖基转移酶的活性。推测277位氨基酸处于ABO血型基因编码的转移酶的活性区域。     

抗人RBC A抗原50A株单抗可变区基因克隆及单链抗体基因构建

目的：从分子水平分析抗人红细胞血型Ａ抗原单克隆抗体５０Ａ株,进而为制备新一代基因工程抗体的血型检定试剂奠定基础。方法：从杂交瘤细胞提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆抗体的轻、重链可变区基因,用ＰＣＲ及双脱氧核苷酸链终止法分析其核苷酸序列,采用ＰＣＲ技术重叠延伸拼接法构建５０Ａ单抗单链抗体基因。结果：序列分析表明所克隆基因为抗体轻、重链可变区基因,５０ＡＶＨ隶属于小鼠Ｉｇ重链ⅡＢ亚组,是由ＶＨ－Ｄ－ＪＨ３基因重排产生;５０ＡＶＬ隶属于小鼠ＩｇＫａｐｐａ链Ⅱ亚组,Ｊｋ１基因重排。重叠延伸拼接法构建单链抗体基因简易可行。结论：所克隆基因含有正确的抗体框架结构,可作为研究基因工程血型检定抗体的目标基因。     

人脂联素基因的克隆构建及其序列分析

背景:脂联素已经成为缺血性疾病基因治疗的新靶点,而成功进行脂联素基因治疗的关键是脂联素基因的克隆.基因克隆主要有定向克隆法和T-A克隆法,定向克隆法操作较复杂;而T-A克隆法操作简便,成功率高.目的:应用T-A克隆法克隆人脂联素基因编码区,对其进行测序验证,并与GenBank比对.设计、时间及地点:基因水平的验证实验,于2006-061/2008-12在福建医科大学附属第一医院高血压研究所及福建中医学院中西医结合研究院完成.材料:脂肪组织取自福建医科大学第一附属医院外科患者术中切除的大网膜脂肪垫,液氮中冻存.Trizol为Invitrogen公司产品:M-MLV,Gel Extract Kit为PROMEGA公司产品;Taq酶为TIANGEN公司产品;限制性内切酶BamH Ⅰ,Sal Ⅰ,pMD18-T载体为TAKARA公司产品.方法:从人大网膜脂肪组织提取总RNA,经反转录-聚合酶链反应扩增出人脂联素编码区基因,再将人脂联素基因编码区克隆入载体pMD18-T中,通过限制性内切酶酶切鉴定后,对其进行测序验证,并与GenBank比对.主要观察指标:人脂联素克隆质粒酶切鉴定结果,人脂联素基因克隆序列与GenBank比对结果.结果:扩增得到人脂联素基因编码区,获得人脂联素的正向和反向克隆,与GenBank中人脂联素基因编码区序列比对均为完全一致.结论:成功地克隆出人脂联素基因编码区.     

BRCA1基因全长mRNA序列分析技术

目的:建立BRCA1基因全长mRNA序列测定方法。方法:根据文献和GenBank(U14680)报道的BRCA1基本序列设计6对特异性引物,建立6个特异性逆转录PCR(RT-PCR)技术,分段且扩增BRCA1全长mRNA,然后采用毛细管电泳进行cDNA测序,方法建立后用于3名健康女性样本。结果:6个特异性RT-PCR反应扩增片段相互覆盖,使序列分析结果包括全长BRCA1mRNA,共5000多bp。3名经PCR技术检测确定携带正常BRCA1基因的样本的mRNA分析结果显示,其BRCA1mRNA序列均与过往报道的正常mRNA序列完全一致。结论:所建立的RT-PCR特异性结合BRCA1基因,能用于其mRNA全长序列分析。     

一种新的突变型人血小板内皮细胞黏附因子1的基因克隆与序列分析

目的 克隆一种新的突变型人血小板内皮细胞黏附因子1(PECAM1)基因,并应用生物信息学方法进行序列分析.方法 以提取的X射线辐射诱导的人鼻咽癌耐药细胞CNE1/R中的总RNA为模板,RT-PCR扩增获得PECAM1基因片段,克隆至pMD19-T Simple载体并测序鉴定.应用生物信息学方法分析PECAM1基因的序列同源性与结构特征.结果 成功克隆了突变型人PECAM1基因,但与GenBank中的人PECAM1基因参考序列相比有三点不一致,分别位于1452、1688和2008 nt处.与马、猪、牛、大鼠、小鼠的PECAM1基因具有高度同源性,同源性分别为82%、82%、79%、73%、73%.突变序列与参考序列相比,1688和2008 nt翻译对应的氨基酸发生变化,即563、670 aa分别由丝氨酸、精氨酸改变为天冬酰胺、甘氨酸.人PECAM1蛋白39~127 aa、235~322 aa、327~404 aa、408~496 aa和502~594 aa均为Ig-2免疫球蛋白超家族结构域,而突变型人PECAM1基因编码的563 aa突变刚好位于502~594 aa的Ig-2免疫球蛋白超家族结构域中.结论 突变型人PECAM1基因在基因水平相较人PECAM1基因参考序列有3个位点改变,应用生物信息学方法进行序列分析,发现在蛋白水平改变导致的563 aa突变位于Ig-2免疫球蛋白超家族结构域,这为进一步研究其生物学功能及其在X线照射后人鼻咽癌细胞CNE1/R产生多药耐药中的作用提供了依据和线索.     

建立一种PCR产物直接测序检测HBVYMDD突变的方法

目的 建立检测HBV YMDD变异的PCR产物直接测序法,并与传统实时荧光PCR检测YMDD突变的结果进行比较分析.方法 选取103份慢性乙型肝炎患者血清标本,提取血清HBVDNA.用实时荧光PCR检测YMDD突变;用巢式pcR扩增HBV逆转录酶基因,对PCR产物进行DNA双向测序,NTI软件比对结果.采用Kappa一致性检验对DNA测序法检测的rt204位点突变与实时荧光PCR检测的YMDD突变结果进行比较.结果 PCR产物直接测序法可有效检测低病毒载量标本(500拷贝/ml)和高病毒载量(1010拷贝/ml)标本,同时可以避免高病毒载量标本的抑制效应.与实时荧光PCR相比较,YIDD突变检测符合率为100%,YVDD突变检测符合率97.1%,YIDD与YVDD共生突变符合率76.2%(Kappa=0.853,P<0.01).结论 本研究建立的PCR产物直接测序法检测HBV耐药相关基因突变,灵敏度高,检测范围宽,与实时荧光PCR检测结果有较高的符合率,并可同时检出YMDD、YIDD和YVDD.     

献血者中SEN病毒部分基因的克隆和序列分析

目的　了解我国献血者中是否存在SEN病毒 (SENV)感染 ,并分析SENV国内分离株的部分基因序列。方法　根据SENVORF1区保守序列设计引物 ,采用套式PCR方法 ,从献血者血浆标本中分离SENV基因片段 ,对分离的DNA片段进行基因重组和核苷酸序列分析。结果　从 32 9名献血者中分离出 6株SENV基因片段 ,其核苷酸推导氨基酸序列与SENVA～H基因型序列比较 ,同源性在 5 2 %～ 10 0 % ;系统进化树分析发现 ,分离的 6株SENV属SENV H基因型。结论　国内献血者中存在SENV H基因型感染 ,输血可能成为传播SENV途径之一。     

人血管生成素1的克隆、序列分析和单酶切法构建毕氏酵母表达载体

目的:从人胎盘中克隆血管生成素1基因,并分析其结构特征,单酶切法构建毕氏酵母表达载体pPIC9K/Ang-1,为进一步研究血管生成素1防治糖尿病视网膜病变的血管渗漏奠定物质基础。方法:实验于2003-11/2004-06在北京大学医学部细胞系完成。提取人胎盘组织总RNA,用反转录聚合酶链式反应技术扩增出血管生成素1基因片段,并将其克隆到PGEM-TEasy载体中进行序列分析,用小牛肠碱性磷酸酶法去除线性化的pPIC9K质粒DNA两端磷酸基,以防止质粒自身环化,再亚克隆到毕氏酵母表达载体pPIC9K中。结果:①经甲醛变性胶电泳鉴定,成功从胎盘组织中提取出总RNA,RNA的完整性和纯度符合进一步的酶反应要求。②胎盘组织总RNA经oligo-dT引物反转录,用人血管生成素1特异一对引物进行聚合酶链反应扩增,10g/L琼脂糖胶电泳结果显示一条特异片段,大小为1.5kbcDNA片段。③成功构建了PGEM-T/Ang-1载体,Blast序列分析与GenBank中AY121504一致。两者成熟区cDNA的核苷酸和氨基酸同源性分别大于99%和98%,国人血管生成素1基因核苷酸序列的起始密码子ATG,终止密码子为TGA,共1497个碱基对。④成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体。结论:从人的胎盘中克隆血管生成素1基因无突变,成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,满足表达蛋白质的需要。     

人类凝血因子Ⅻ基因一种新突变的发现与确证

目的 对一例凝血因子Ⅻ缺陷症患者进行凝血因子Ⅻ（Factor Ⅻ,F Ⅻ）基因序列分析,以发现可能存在的基因变异.方法 PCR结合直接测序方法对该患者F Ⅻ基因全部14个外显子及其侧翼序列进行分析,应用PCR产物反向测序法或等位基因特异PCR技术对突变位点进行确证,随机选择100名体检健康人作为正常对照.结果 该患者F Ⅻ基因第14外显子存在G1706A错义突变,5′非翻译区的46位核苷酸为TT纯合子;等位基因特异PCR证实在100名体检健康人中未发现F Ⅻ G1706A突变.结论 F Ⅻ基因的G1706A错义突变及5′非翻译区的46TT多态性可能与本例患者F Ⅻ缺陷有关.     

人外周血心肌肌钙蛋白ⅠmRNA对心肌微小损伤的诊断和监测价值

背景心肌收缩系统中肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物所含的心肌特异蛋白,正在替代肌酸激酶同工酶而作为急性心肌损伤早期诊断的黄金标准.目的建立分析外周血心肌肌钙蛋白ImRNA的方法,并评价对心肌损伤诊断的临床价值.设计建立心肌肌钙蛋白ImRNA分析方法,重复观察测量.单位南通大学附属医院心血管内科.材料实验于2003-05/2004-05在南通大学附属医院临床分子生物学中心完成.建立了反转录聚合酶链反应分析外周血心肌肌钙蛋白-mRNA方法,并经临床应用证实为心肌损伤诊断及微小损伤监测的灵敏基因标志.方法以普通病理染色和电镜分别观察心肌损伤时的病理学和超微结构改变,并从外周血中制备总mRNA,经随机引物和反转录酶作用合成心肌肌钙蛋白IcDNA,再分别以巢式PCR扩增心肌肌钙蛋白IcDNA片段,并分析其在心肌损伤中的临床价值.主要观察指标心肌损伤组织超微结构改变、检测方法灵敏度与诊断价值.结果心肌损伤组织超微结构表现为心肌线粒体肿胀、嵴断裂、严重空泡样变及细胞核异形变、染色质浓缩边聚.巢式聚合酶链反应扩增心肌和外周血中心肌肌钙蛋白ImRNA片段,检测方法的灵敏度为2μg/L,并经DNA测序分析.心肌肌钙蛋白ImRNA存在于血浆而非有核细胞;在慢性心脏病患者中心肌肌钙蛋白ImRNA阳性率,明显高于酶学检测和心肌肌钙蛋白Ⅰ定性(P＜0.05).结论外周血心肌肌钙蛋白ImRNA检测是心肌损伤诊断和监测的敏感标志物.     

一种新基因型TEM-128β-内酰胺酶的发现及其临床意义

目的 分析产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)鲍曼不动杆菌TEM型β-内酰胺酶(BLA)的编码基因并确定其亚型。方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增BLA编码基因TEM、SHV、OXA、CTX—M-1、CTX—M-2、CTX—M-9、PER和VEB片段，双脱氧链终止法测定核苷酸序列、确定亚型。结果临床分离的鲍曼不动杆菌HZ38株产生TEM型BLA，其扩增片段含1049个核苷酸，核苷酸及相应的氨基酸序列经Gen—Bank查询无相同序列，为新发现的一种BLA TEM-128型(GenBank注册号：AY359287)。结论 临床分离的鲍曼不动杆菌HZ38株所产BLA为TEM-128亚型，为一种新发现的新型BLA。     

一种相对简易的从人胃组织样品中扩增L-Myc基因片断的方法

运用多聚酶链反应（PCR）从人各种细胞或组织中扩增特异的基因片段,然后进行多态性或突变序列分析,已成多种生物医学学科（如遗传学、分子流行病学及肿瘤学等）常用的研究手段.越来越多的研究表明原癌基因的多态性或体细胞突变与肿瘤的发生、转移或预后密切相关[2,4].     

一种新基因型SHV-28 β-内酰胺酶的发现及其特性的初步研究

目的 鉴定产超广谱β－内酰胺酶（ESBLs)肺炎克雷伯菌SHV型β－内酰胺酶（BLSA）的编码基因、BLA亚型并初步研究其特性。方法 聚合酶链反应（PCR）扩增BLA编码基因片段,克隆入pGEM-Teasy载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列、确定亚型,并做接合试验。结果 临床分离的8株肺炎克雷伯菌,均产生SHV型BLA,其扩增片段含812个核苷酸,核苷酸及相应的氨基酸序列经GenBank查询无相同序列,为新发现的一种BLA SHV－28型（GenBank注册号：AF299299）。接合试验的结果证明耐药基因位于质粒上。结论 8株临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌的产BLA为SHV－28亚型,为新发现的一种新型BLA。     

人外周血心肌肌钙蛋白ImRNA对心肌微小损伤的诊断和监测价值(英文)

背景:心肌收缩系统中肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物所含的心肌特异蛋白,正在替代肌酸激酶同工酶而作为急性心肌损伤早期诊断的黄金标准。目的:建立分析外周血心肌肌钙蛋白ImRNA的方法,并评价对心肌损伤诊断的临床价值。设计:建立心肌肌钙蛋白ImRNA分析方法,重复观察测量。单位:南通大学附属医院心血管内科。材料:实验于2003-05/2004-05在南通大学附属医院临床分子生物学中心完成。建立了反转录聚合酶链反应分析外周血心肌肌钙蛋白-mRNA方法,并经临床应用证实为心肌损伤诊断及微小损伤监测的灵敏基因标志。方法:以普通病理染色和电镜分别观察心肌损伤时的病理学和超微结构改变,并从外周血中制备总mRNA,经随机引物和反转录酶作用合成心肌肌钙蛋白IcDNA,再分别以巢式PCR扩增心肌肌钙蛋白IcDNA片段,并分析其在心肌损伤中的临床价值。主要观察指标:心肌损伤组织超微结构改变、检测方法灵敏度与诊断价值。结果:心肌损伤组织超微结构表现为心肌线粒体肿胀、嵴断裂、严重空泡样变及细胞核异形变、染色质浓缩边聚。巢式聚合酶链反应扩增心肌和外周血中心肌肌钙蛋白ImRNA片段,检测方法的灵敏度为2μg/L,并经DNA测序分析。心肌肌钙蛋白ImRNA存在于血浆而非有核细胞;在慢性心脏病患者中心肌肌钙蛋白ImRNA阳性率,明显高于酶学检测和心肌肌钙蛋白I定性(P<0.05)。结论:外周血心肌肌钙蛋白ImRNA检测是心肌损伤诊断和监测的敏感标志物。     

人乳头瘤病毒6型E7基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的从尖锐湿疣病变组织中克隆人乳头瘤病毒6型(HPV6)E7基因,为HPV感染的检测及基因工程疫苗的研制奠定基础。方法以临床尖锐湿疣标本总DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术,从尖锐湿疣病变组织中扩增出人乳头瘤病毒6型E7基因完整开放阅读框架,并插入载体PMD-18T中构建重组质粒,转化JM109中扩增,进行酶切及测序分析。结果测序结果证实克隆成功。结论该实验为研究人乳头瘤病毒E7蛋白的免疫学和流行病学特点创造了条件,也为下一步制备HPV6型疫苗奠定了基础。     

人及小鼠干细胞因子的cDNA克隆及其序列分析

作者合成了一段与人和小鼠干细胞因子（ＳＣＦ）ｃＤＮＡ能特异性互补的寡核苷酸探针，经放射性同位素标记，与两株人骨髓基质细胞系（ＨＥＣＬ、ＨＦＣＬ）和一株小鼠骨髓基质细胞系（ＴＣ－１）的ＲＮＡ进行点杂交。结果表明这三株基质细胞都能表达ＳＣＦｍＲＮＡ。因此，作者利用逆转录－多聚酶链反应技术扩增编码ＳＣＦ的部分ｃＤＮＡ序列，并将其克隆入ｐＵＣ１８载体。ＤＮＡ序列分析结果显示作者所克隆的ＳＣＦｃＤＮＡ序列与文献报道的一致。     

一种简单的筛选耐甲氧西林葡萄球菌方法

目的　推荐美国国家临床实验室标准化委员会 (NCCLS)关于 6 μg/ml苯唑西林 +4%NaCl盐平板 (以下简称盐平板法 )检测甲氧西林耐药葡萄球菌。方法　使用NCCLS推荐的盐平板法检测华山医院临床分离的葡萄球菌共 894株。结果　 (1)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)苯唑西林纸片法的检出率为 84 .2 % (5 38/6 39) ,盐平板法的检出率为 86 .4 % (5 5 2 / 6 39) ,而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌 (MRCNS)的检出率 2种方法分别为 82 .0 (2 0 9/ 2 5 5 )、90 .6 % (2 31/ 2 5 5 ) ;(2 )有 14株纸片法测定为中介的金黄色葡萄球菌和 2 2株纸片法检测为甲氧西林敏感 (MS)的凝固酶阴性葡萄球菌 ,盐平板检测均为甲氧西林耐药 (MR) ,经聚合酶链反应 (PCR)检测mecA基因结果均为阳性 ,显示PCR检测与盐平板检测结果一致 ;(3)随机取上述纸片法和盐平板 2种方法检测均为MS者 9株、MR者 15株 ,同时进行mecA基因的PCR检测 ,结果显示全部与盐平板法和苯唑西林纸片法检测结果符合。结论　在临床微生物实验室应该采用NCCLS推荐的 6 μg/ml苯唑西林 +4%NaCl盐平板对MRSA和MRCNS进行检测 ,以供临床诊断和选用抗生素。