美洲大蠊提取物抗炎、镇痛作用的实验研究

目的本实验就美洲大蠊提取物的抗炎、镇痛等药理作用进行动物实验研究。方法采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀和蛋清致大鼠足跖肿胀两种动物模型,考察美洲大蠊提取物抗炎作用;采用小鼠热板法镇痛试验及醋酸致小鼠扭体反应模型以考察其镇痛的效果。结果美洲大蠊提取物可抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿（P〈0.05）、蛋清所致的大鼠足跖肿胀（P〈0.05）,可使醋酸所致的扭体次数明显减少（P〈0.05）,并使小鼠热板法痛阈明显提高（P〈0.01）。结论初步证明美洲大蠊提取物具有抗炎消肿、镇痛的作用。     

美洲大蠊提取物诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡及作用机制

目的 探讨美洲大蠊提取物对人肝癌细胞SMMC-7721增殖、凋亡的影响并探讨其相关机制.方法 取对数生长期状态良好的SMMC-7721细胞分为三组,观察组常规培养24h后加入美洲大蠊提取物,使终浓度分别为300、100、33.3 μg/mL,顺铂组加入顺铂20 μg/mL作用细胞48 h,对照组不做任何处理.采用MTT比色法检测细胞增殖抑制率;采用流式细胞仪分析细胞凋亡率;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位变化;分光光度法检测Caspase-3活性变化.结果 观察组和顺铂组细胞抑制率明显高于对照组,IC50为100 μg/mL,并呈现时间一剂量依赖关系(P＜0.05);观察组和顺铂组细胞凋亡率明显高于对照组,呈现剂量依赖性(P＜0.05).凋亡过程中线粒体膜电位下降,Caspase-3活性升高(P＜0.05).结论 美洲大蠊提取物具有抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖并诱导其凋亡作用,线粒体途径可能是其诱导肝癌细胞凋亡的主要机制之一.     

美洲大蠊特异性抗原的蛋白印迹分析

目的探讨美洲大蠊不同时期抗原成份分析以及特异性抗原组分鉴定。方法本文通过采用Coca's提取液提取得到美洲大蠊粗浸液抗原,通过饱和(NH4)2SO4沉淀以及十二烷基磺酸钠聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PASE),对其抗原成份进行分析,并选用对蟑螂过敏性疾病患者阳性血清进行免疫印迹试验(Western-blotting)。结果美洲大蠊成虫、若虫、幼虫、虫卵生活史不同时期及不同部位抗原各有不同数量的蛋白条带,但生活史各阶段均出现6条蛋白主带,分别为:92、78、66、56、52和40kD,免疫印迹显示其92、78、49和26kD为美洲大蠊成虫特异性变应原,其中78kD是主要变应原。结论美洲大蠊78kD蛋白为主要变应原,92、49和26kD为次要变应原,本研究为蟑螂变应原诊断试剂和疫苗的研制奠定了基础。     

整合素α4在美洲大蠊提取物黏糖氨酸抗肝纤维化中的作用

目的 本研究基于黏糖氨酸(SSAA)在大鼠中的抗肝纤维化作用,研究整合素α4(ITGA4)在肝纤维化中的作用机制。方法 大鼠腹腔内注射CCl₄诱导肝纤维化模型,在此基础上使用秋水仙碱或SSAA低、中、高剂量进行干预,以空白对照组、SSAA组作为对照。实验干预12周后,收集大鼠血清、肝脏标本,检测大鼠血清ALT、AST水平,HE染色、天蓝猩红染色观察肝组织病理情况;实时荧光定量PCR检测肝组织ITGA4、整合素β1(ITGB1)、TGFβ1、α-SMA、TIMP2的转录水平;Western Blot检测ITGA4、ITGB1、TGFβ1、α-SMA、MMP2、TIMP1、TIMP2的相对蛋白表达;免疫组化观察TGFβ1、α-SMA蛋白表达。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 CCl₄模型组中AST、ALT显著升高,秋水仙碱或SSAA低、中、高剂量干预后能降低AST、ALT水平,各组与CCl₄模型组相比差异均有统计学意义(P值均<0.05)。CCl₄模型组...     

美洲大蠊泛素基因的克隆及生物信息学分析

目的克隆美洲大蠊（Periplaneta americana）泛素基因,并对序列进行相关分析。方法依据其他物种泛素基因的保守区设计1对简并引物,对美洲大蠊cDNA模板进行RT-PCR扩增,产物纯化后行T-A克隆、测序和酶切鉴定,运用相关生物信息学软件对该基因核苷酸序列进行分析和预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果从美洲大蠊体中克隆了泛素基因的编码区,被GenBank收录,登录号为EF101563。生物信息学分析结果表明,美洲大蠊泛素基因编码区的长度为228 bp,编码的多肽由76个氨基酸残基组成,相对分子质量单位为8.53 ku,理论等电点为6.56,与其他真核生物泛素基因在氨基酸水平上具有96%以上的相似性,二级结构中α-螺旋占26.3%,无规则卷曲占47.3%,延伸串占26.3%。结论成功克隆了美洲大蠊泛素基因,并进行了相关生物信息学分析,为进一步研究泛素在美洲大蠊机体内的作用奠定了基础。     

毛菊苣提取物对小鼠肝纤维化的保护作用

背景肝纤维化是肝硬化发生的基础病理过程,逆转和治疗肝纤维化是防止肝硬化发生的重要治疗手段.毛菊苣,作为传统中药材,已知其保肝作用,本文通过动物实验验证并进一步探索其发挥作用的有效部位.目的研究毛菊苣提取物:CG-Ⅰ(95%乙醇提取物)、CG-Ⅱ(70%乙醇提取物)、CG-Ⅲ(50%乙醇提取物)、CG-Ⅳ(水提取物)对小鼠肝纤维化的保护作用.方法采用10%食用酒精代饮用水,背部皮下注射20%CCl4造肝纤维化模型,造模成功后分为空白对照组、模型组、药物治疗组(CG-Ⅰ组、CG-Ⅱ组、CG-Ⅲ组、CG-Ⅳ组),考察肝脏系数、脾脏系数,血清谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、肝组织碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷光甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的水平,并观察肝脏病理组织学变化.结果与空白对照组相比,模型组小鼠血清及肝组织中的AST、ALT、AKP及LDH水平都显著升高,说明造模成功;与模型组相比,CG-Ⅲ组可以降低脾脏系数(P<0.05);药物治疗组均可降低小鼠血清中AST、ALT的水平(P<0.01);药物治疗组除了CG-Ⅲ组均可以升高小鼠肝组织中GSH-Px的活性水平(P<0.01或P<0.05);药物治疗组CG-Ⅰ和CG-Ⅱ可降低小鼠肝组织中AKP、LDH的含量,具有极显著性差异(P<0.01);通过HE染色和Masson染色切片,可以看出药物治疗组均可不同程度地改善肝脏病理组织纤维化,而CG-Ⅰ组和CG-Ⅱ组效果显著.结论维药毛菊苣提取物对小鼠肝纤维化具有一定的保护作用,其中CG-Ⅰ组和CG-Ⅱ组即95%和70%乙醇提取物组的治疗效果最佳.     

美洲大蠊尾须一种新感器的扫描电镜观察

作者在扫描电镜下观察了美洲大蠊尾须的细微结构，首次发现尾须上有１种新型感受器（简称感器）。该感器基部为１倒扣的飞盘形，其中部着生１根细长的感受器毛（简称感毛），暂名矛形感器。此外，尾须上还可见大量刺形感器Ｂ和少量钟形感器     

化学发光免疫法检测美洲大蠊sIgE水平的研究

将6只美洲大蠊全虫用液氮研磨提取粗浸液，用阴离子交换剂（DEAE, Sephadex A-50）纯化后测定蛋白浓度，并配制成不同浓度梯度，分别将粗浸液及纯化后的不同浓度变应原点于硝酸纤维膜（NC膜）上，依次加入不同蟑螂过敏患者血清、生物素-亲和素系统的IgE二抗和辣根过氧化物酶（HRP），以及鲁米诺化学发光底物进行化学发光反应。结果表明，化学发光免疫法可检测美洲大蠊粗浸液最低蛋白浓度为0.87 μg/ml。在此浓度下，其检出结果与皮试阳性患者血清符合率为90％，与皮试阴性及健康人血清的符合率均为100％。     

美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及变应原活性测定

目的 克隆美洲大蠊（Periplaneta americana）精氨酸激酶(arginine kinase，AK)基因并表达、纯化具有变应原活性的重组AK。 方法 提取美洲大蠊总RNA，设计特异引物，通过RT-PCR克隆美洲大蠊AK基因目的片段，测序后将该片段克隆入原核表达载体pET-28a，转化至大肠埃希菌（E. coli） BL21（DE3），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，获重组AK。用镍离子（Ni²⁺）亲和层析柱纯化，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组AK表达情况。用蛋白质印迹分析（Western blotting）（变性条件）和ELISA（非变性条件）检测重组AK变应原与过敏患者血清IgE结合活性，并以健康人血清为对照。 结果 测序结果表明，AK基因含有1 068 bp的开放阅读框，编码356个氨基酸（登录号为EU429466）。与GenBank公布的序列（登录号为AY563004）比较同源性达99.9%。SDS-PAGE分析表明, 该变应原基因在E. coli中主要以可溶形式高水平表达，相对分子质量约为Mr 45 000。重组变应原AK在变性与非变性条件下，与过敏患者血清IgE均具有良好的结合活性，与健康人对照组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论 获得了具有变应原活性的重组美洲大蠊精氨酸激酶。     

不同剂量丹参注射液抗肝纤维化的实验研究

目的：探讨不同剂量丹参注射液对四氯化碳（CCl4）所致中毒性肝纤维 化的防治作用及各剂量间疗效的比较。方法：采用CCl4制造大鼠肝纤维化模型,同时用高、中、低剂量丹参注射液治疗,测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT） 、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（Alb）、透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（ⅣC）,并以光镜观察组织学改变,综合分析不同剂量丹参注射液对CCl4中毒性纤维化的防治作用。结果：高、中、低剂量丹参注射液都有降低ALT、AST的作用,并有 显著降低HA、PCⅢ、ⅣC的作用。经治疗后的肝细胞损伤、肝脏脂肪变性与纤维组织形成较少。其中高、中剂量组的疗效比低剂量组为好,而高、中剂量组两者之间的差异无显著意义。结论：本实验提示丹参高、中剂量组防治肝纤维化的作用优于低剂量组。     

敲除Smad4基因对小鼠肝纤维化与肝癌发生和发展的影响

目的 探讨敲除Smad4基因对转化生长因子β1(TGFβ1)信号传导系统和对肝纤维化及肝癌发生和发展的影响.方法 采用CCl_4/乙醇分别诱导野生型小鼠(Smad4+/+)与Smad4基因敲除小鼠 (Smad4+/-)20周,观察每组小鼠发生肝纤维化和肝癌的情况,并采用RT-PCR方法检测Smad4、TGFβ1、Smad2、Smad3、Smad6,基质金属蛋白酶抑制剂1、基质金属蛋白酶2、9等基因的mRNA表达程度.采用χ~2检验与t检验进行统计学处理. 结果 纤维化肝脏Smad4的表达较正常对照组明显增强.与野生型相比,Smad4杂合子小鼠的TGFβ1-Smads信号传导系统有所减弱.经CCl_4/乙醇诱导后,总体上Smad4杂合子小鼠发生肝纤维化的程度 (评分为2.12±0.88)显著低于野生型小鼠 (评分为2.87±0.88,t=3.163,P=0.003);Smad4杂合子小鼠组的肝癌发生率 (32.0%) 也明显低于野生型小鼠组 (41.9%).结论 敲除Smad4基因能有效弱化TGFβ1信号传导,从而减缓肝纤维化的程度;同时,能减缓肝癌的发展进程.     

肝纤维化的治疗

肝纤维化存在于嗜肝病毒、乙醇、药物、血吸虫、代谢异常以及自身免疫反应等引起的大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经病理学过程.有效治疗肝纤维化对于改善慢性肝病预后,降低病死率至关重要.     

不同浓度CCl4注射联合饮用乙醇诱导大鼠肝硬化模型研究

目的 探索不同浓度CCl4联合饮用乙醇制备大鼠肝硬化模型,寻求最佳的药物和乙醇浓度。方法 取90只SD大鼠, 分为对照组10只和实验组A组、B组、C组和D组,每组20只,给予不同浓度的CCl4油溶液腹腔注射,同时以不同浓度的乙醇溶液为饮用水,制备肝硬化模型。结果 在实验12 w末,A组大鼠死亡10只, B组死亡8只,C组死亡4只,D组死亡5只;实验A组肝细胞走向紊乱,纤维组织增生,纤维间隔形成。有假小叶形成,肝细胞大小不一,呈点灶状坏死,肝细胞凋亡、再生,汇管区内炎细胞浸润;B组与A组变化相似;C组肝细胞走向紊乱,纤维间隔形成,但无假小叶形成,肝细胞脂肪变性,纤维组织增生,肝细胞凋亡,汇管区内炎细胞浸润;D组与C组表现类似。结论 适当浓度的CCl4油溶液结合乙醇溶液为饮用水诱导大鼠肝硬化模型可显著提高造模成功率。     

实验性肝纤维化胶原变化的研究

目的：研究肝纤维化过程中胶原成分的变化规律。方法：制作四氯化碳肝纤维化模型，测定肝组织羟脯氨酸含量，用ＶＧ、ＲＦ染色显示Ⅰ、Ⅱ型胶原并进行计算机图像分析，放免法测定肝匀浆及血清Ⅲ型前胶原水平，应用上述指标反映肝纤维化过程中胶原的变化规律。结果：随实验时间延长，肝内胶原含量逐渐增加。肝纤维化早、中期以Ⅲ型胶原增生为主，肝纤维化后期及肝硬化期以Ⅰ期胶原为增生为主。血清ＰＣⅢ与肝内胶原变化基本同步。结论     

四氯化碳肝纤维化大鼠肝组织差异蛋白质组的动态变化

目的 探索肝纤维化形成过程中肝组织蛋白质组的变化,部分解析肝纤维化发生、发展的病理生理机制. 方法 采用四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型,应用双向凝胶电泳技术分离大鼠肝组织总蛋白质,经考马斯亮蓝染色、图像分析、识别差异表达的蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱及数据库查询鉴定差异蛋白质点.采用Western blot、免疫组织化学方法对细胞角蛋白(CK)8、CK18进行蛋白质表达水平的验证.计量资料采用单因素方差分析中的LSD法或非参数检验中的H检验进行统计学分析. 结果 大鼠造模后,随时间的推移,肝纤维化评分逐渐增加(3周组＜6周组＜9周组),建立了正常大鼠和大鼠CCl4肝纤维化形成过程3、6、9周肝组织双向凝胶电泳图谱,质谱鉴定了44种差异蛋白质;采用Western blot、免疫组织化学方法对CK8、CK18的验证结果与双向凝胶电泳结果基本一致.正常组及3、6、9周模型组CK8/CK18蛋白相对表达量分别为:0.113±0.005/0.170±0.030、0.473±0.046/0.530±0.070、0.682±0.087/0.780±0.080、0.837±0.096/1.390±0.130,各组间差异均有统计学意义(F值分别为196.085/74.088、13.870/16.115、75.800/75.900,P值均＜0.01). 结论 CCl4大鼠肝纤维化形成与发展过程中差异表达蛋白质的功能主要涉及细胞生长、发育与分化,细胞增殖与凋亡,血管新生或重构,氧化应激,物质代谢及转运,信号转导等.     

疏肝健脾方对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠血清代谢组学的影响

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实验性肝纤维化组织中细胞间黏附分子-1表达的研究

目的 探讨细胞间黏附分子－１（ＩＣＡＭ－１）的表达及其在实验性肝纤维化发生中的作用。方法 分别建立高脂饮食、低脂酒精饮食、高脂酒精饮食、四氯化碳大鼠实验性肝纤维化模型,用免疫组织化学方法观察造模肝组织中ＩＣＡＭ－１的表达。结果 ＩＣＡＭ－１表达于肝细胞膜上,其阳性细胞多分布于汇管区周围、肝小叶内炎性细胞浸润区和坏死灶内,其阳性强度及分布与肝脏炎症、肝纤维化程度和分布相一致;在不同模型组中,ＩＣＡＭ     

脾切除对大鼠实验性肝纤维化的影响

目的：研究脾脏在大鼠四氯化碳肝纤维化模型中对肝纤维化形成的影响。方法：Ｗｉｓｔａｒ大鼠２３６只，随机分为模型组，预先脾切除组，注射四氯化碳后６．９、１２周分别行脾切除组及相应的假手术组。应用光镜观察组织学改变，放免法测定肝匀浆Ⅲ型前胶原、透明质酸、层粘连蛋白水平和肝组织羟脯氨酸含量，并结合胶原计算机图像分析来评价脾脏切除对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化的影响。结果：脾脏切除能减轻肝细胞损伤。减少细胞外基质成分在肝内的沉积，延缓肝纤维化的发生。脾切除组肝纤维化进展较不切脾模型组延缓１个实验阶段（３周），即使在造模过程肝纤维化尚未完全形成时切除脾脏。对肝纤维化也有一定的减轻和延缓作用．结论：脾脏切除可在一定程度上减轻和延缓大鼠四氯化碳所致肝纤维化。     

Rating of CCl(4)-induced rat liver fibrosis by blood serum glycomics

BACKGROUND: Non-invasive staging of human liver fibrosis is a desirable objective that remains under extensive evaluation. Animal model systems are often used for studying human liver disease and screening antifibrotic compounds. The aim of the present study was to investigate the potential use of serum N-glycan profiles to evaluate liver fibrosis in a rat model. METHODS: Liver fibrosis and cirrhosis were induced in rats by oral administration of CCl(4). Liver injury was assessed biochemically (alanine aminotransferase [ALT] activity, aspartate aminotransferase [AST] activity and total bilirubin) and histologically. The N-glycan profile (GlycoTest) was performed using DNA sequencer-assisted-fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis technology. In parallel, the effect of cotreatment with antifibrotic interferon-gamma (IFN-gamma) was studied. RESULTS: The biopsy scoring system showed that CCl(4) induced early fibrosis (F < 1-2) in rats after 3 weeks of treatment, and cirrhosis (F4) after 12 weeks. Significant increases in ALT activity, AST activity and total bilirubin levels were detected only after 12 weeks of CCl(4) treatment. GlycoTest showed three glycans were significantly altered in the CCl(4)-goup. Peak 3 started at week 6, at an early stage in fibrosis development (F < 1-2), whereas peaks 4 and 5 occurred at week 9, at which time mild liver fibrosis (F = 1-2) had developed. The changes in the CCl(4)-IFN-gamma group were intermediate between the CCl(4)- and the control groups. CONCLUSION: The GlycoTest is much more sensitive than biochemical tests for evaluating liver fibrosis/cirrhosis in the rat model. The test can also be used as a non-invasive marker for screening and monitoring the antifibrotic activity of potential therapeutic compounds.     

四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤模型方法的探讨

目的研究大鼠慢性肝损伤模型的建立方法。方法以20％和50％四氯化碳植物油溶液给SD大鼠腹腔注射8周,制备大鼠慢性肝损伤模型,观察大鼠饮食、体重和血清ALT、AST水平的变化,采用TUNEL法观察肝细胞凋亡情况,以评价成模效果。结果实验组大鼠饮食量降低,体重增加缓慢。实验组ALT和AST分别为204．1±35．7U／L和307．5±54．1U／L,而对照组分别27．6±3．1U／L和50．5±9．0U／L。实验组动物出现肝细胞变性、凋亡、坏死及再生等病变。大剂量四氯化碳容易弓l起肝纤维化。结论应用20％～50％四氯化碳溶液在1．5ml·kg^-1 bw剂量下腹腔注射可诱导大鼠典型的肝损伤模型,病变稳定,操作简便,可供实验研究应用。