结核菌IS6110序列在石蜡组织中的检测、克隆与测序

目的 探讨巢式聚合酶链反应（Nested-PCR)检测石蜡组织中结核分枝杆菌的特异性和敏感性。方法 采用巢式PCR检测石蜡包埋组织中结核菌复合体特异插入序列IS6110，并对部分标本的PCR产物进行克隆和测序。结果 31例结核标本石蜡组织检出结核菌DNA共28例，巢式PCR的敏感度为90．3％，特异度为100％。阳性预测率为100％。随机选取2例PCR产物测序结果与结果与结核菌标准株H37Rv同源性分别为97％和95．3％。结论 巢式PCR检测常规石蜡包埋组织中结核菌IS6110序列具有特异性高、敏感性好的特点，可应用于临床诊断，尤其是对那些常规HE染色和抗酸染色无法确诊的病例更具意义。     

变性高效液相色谱检测视网膜母细胞瘤Rb1基因外显子

目的探讨变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）检测视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）Rb1基因外显子突变的情况。方法收集25例RB患者的肿瘤组织和3例健康者的外周血。提取其基因组,扩增Rb1基因的第3、7、9、12和26个外显子片段,再以DHPLC和DNA直接测序法分别检测其突变情况并进行比较。结果所有模板均扩增出5个外显子片段。DHPLC分析得第3、7、9、12和26个外显子的最优化检测柱温分别为54．4、55．2、53．4、53．4和55．2℃;第3、7、9和12个外显子中,25例患者和3例健康者均呈现同样峰形;而第26个外显子中,有2例患者呈现不同峰形。对所有片段进行测序,第3、7、9和12外显子的扩增片段中未发现突变。而外显子26的扩增片段中,DHPLC峰形和其他片段不同的2个样品也未出现突变。DHPLC和直接测序结果的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论DHPLC能快速检测出Rb1基因外显子片段的突变位点,可以用于RB的检测。     

GJA3基因在先天性白内障患者中的突变筛查

目的研究缝隙连接蛋白基因GJA3与先天性白内障的关系。方法收集2个先天性白内障家系及30例散发先天性白内障患者,制备外周血白细胞基因组DNA,PCR扩增GJA3基因的外显子及其邻近的内含子,应用SSCP法检测并发现变异条带,将相应的扩增产物回收并纯化后进行GJA3基因测序。测序结果与GenBank公布的GJA3基因正常序列比对找出突变。结果在68例先天性白内障患者中,仅发现1例患者其GJA3基因外显子D段扩增产物SSCP电泳有3条DNA单链带,而其他患者为2条带。将该段序列进行PCR扩增并测序,于编码区未见任何突变,仅在非编码区域发现碱基CA的缺失。结论GJA3基因与本组先天性白内障无关。先天性白内障临床表型与基因型之间的确切关系有待进一步的研究。     

荧光MGB探针在Leber遗传性视神经病变mtDNA G11778A基因突变检测中的应用

目的 建立一套快速、准确、简便筛查Leber遗传性视神经病变（LHON）mtDNAG11778A基因突变的新方法,并初步判断其异质性个体中野生和突变比例。方法 采用荧光MGB探针实时聚合酶链反应（PCR）技术,在同一个反应体系中引入野生和突变型两种探针,应用多荧光通道PCR仪分别检测LHON家系中20例患者血样和17例正常人血样,将检测结果与核酸序列测定结果比较。结果 正常人血样检测结果：荧光PCR技术检测VIC通道均为阳性,FAM通道均为阴性,判断为LHON mtDNA野生型,与测序结果完全吻合;临床LHON患者及家系成员测序结果：LHON mtDNA变异型患者12例,荧光PCR技术检测均为LHON mtDNA变异阳性,其中为LHON mtDNA变异株和野生株混合的5例,混合型中变异株与野生株Ct值均大于25％;测序结果显示LHONmtDNA野生型8例,荧光PCR技术检测LHONmtDNA野生型为5例,LHONmtDNA变异株和野生株混合型3例,其中变异株与野生株ct值均小于25％;荧光定量PCR技术检测LHON mtDNAG11778A基因突变耗时仅为80min,远短于测序时间。结论 荧光MGB探针实时PCR技术能简便、快速、准确地检测LHON mtDNAG11778A基因突变,判断个体异质性中野生和突变比例,对进一步探讨LHON患者是否存在mtDNA基因突变阈值有重要价值。（中华眼科杂志,2006,42：728—732）     

TLMV5’非编码区序列的克隆与序列分析

目的 调查TTV阴性非甲－庚型肝炎患者TLMV(TTV-Like Mini Virus)感染情况，分析TLMV5’非编码区部分基因序列。方法 采用巢式PCR技术检测TTV阴性的非甲－庚肝炎患者血清TLMV DNA，对PCR产物进行克隆、测序和分析。结果 53例病例中TLMV DNA阳性37例（69．8％），对其中8株TLMV基因克隆测序，并与Takahashi报道的TLMV序列（Genebank Accession Nos AB026929-AB026931)比较，其核苷酸序列同源性在64％－83％之间。结论 在TTV阴性的非甲－庚肝炎患者在存在TLMV感染。TLMV基因存在较大的异源性。TLMV的致病性及其与肝炎的关系尚有待进一步研究。     

中国株HGV部分基因的分子克隆与核苷酸序列分析

采用ＲＴ－ＰＣＲＣ地广东地区３３例肝炎患者血清进行ＨＧＶＲＮＡ检测，结果２例（６．１％）阳性。对其中１株输血后ＨＧＶ（ｃｈ－ｓ）基因组５′端非翻译区（５ＵＴＲ）进行分子克隆与测序，并分别与Ｌｉｎｎｅｎ等报道的２株ＨＧＶ（ＰＮＦ２１６１，Ｒ１０２９１）和Ｌｅａｒｒ等报道ＧＢＶ－Ｃ相比较，其核苷酸序列的同源性分别为８９．２％，８８．７％，８７．１％，本研究首次证实我国华南地区在ＨＧＶ感染，ＨＧＶ高度保     

一种新型肝炎病毒（TTV）的分子克隆及核苷酸序列分析

建立检测ＴＴＶＤＮＡ套式聚合酶链反应（ＰＣＲ），检测４０例广东地区非甲－庚型肝炎患者血清。对其中１例深圳散发怀肝炎患者的ＰＣＲ产物进行分子克隆，采用荧光法测定其核酸序列。结果４０例非 庚型肝炎中２１例ＴＴＶＤＮＡ阳性，对深圳株（ＳＺ１）ＴＴＶＯＲＦ１部分基因作序更分析并与Ｏｋａｍｏｔｏ等报道的２株ＴＴＶ克隆进行比较，其核苷酸序列的同源性分别为９６．６％秘９７．４％，提示ＳＺ１与Ｎ２２，Ｇ１ａｎｔｙ     

PAX6基因在一先天性无虹膜家系中的突变筛查

目的研究PAX6基因突变是否是导致一先天性无虹膜家系致病的原因。方法收集一先天性无虹膜家系,制备外周血基因组DNA,PCR扩增PAX6基因的外显子及其邻近的内含子,应用单链构象多态性（SSCP）法检测,如果发现变异条带,将相应的扩增产物回收并纯化后进行PAX6基因测序。测序结果与GenBank公布的PAX6基因正常序列比对,寻找有无突变。结果本家系43名成员中有8例患病,遗传方式符合常染色体显性遗传特点,40岁以上的4例患者眼压高于35mmHg。所有患者中未发现全身并发症。在家系所有患者中均未发现异常条带。结论 PAX6基因与该先天性无虹膜家系无关。该家系的致病基因有待进一步通过全基因组扫描的方法来确定。     

CRISPR/Cas9技术介导Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞系的构建及其三维视网膜类器官培养

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法:对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后,利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测,根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打...     

角膜炎棘阿米巴的18S核糖体DNA基因型鉴定

目的 鉴定角膜炎棘阿米巴分离株的18S核糖体DNA(18S rDNA,Rns)基因型。方法 分离转种培养26株致角膜炎的棘阿米巴虫株,提取虫株全基因组DNA,应用棘阿米巴属特异性引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增部分18S rDNA序列。扩增产物测序后,采用分子生物学软件Clustal X和MEGA2对所测序列进行分析,与基因库中已有序列进行比较,分析北京市眼科研究所保存的棘阿米巴虫株Rns基因型特点及与其他国家和地区虫株的基因型异同。结果 分离保存的26株感染角膜的棘阿米巴虫株中,25株(96％)属于Rns T4基因型,1株(4％)属于Rns T3基因型。结论 根据Rns基因特点,感染角膜的棘阿米巴虫株多属于T4基因型,部分虫株属于T3基因型,此分型结果与国外的相似,感染角膜的棘阿米巴可能与特定的基因型有关。(中华眼科杂志,2004．40：389-394)     

X-连锁隐性遗传高度近视家系的ZNF185基因序列分析

目的：应用基因测序的方法,对一个致病基因已定位于MYP1位点的X-连锁隐性遗传高度近视家系进行基因筛查,探索ZNF185基因与该家系的相关性。方法收集家系中28人临床资料并采集10例患者及18例家系正常成员的外周血,提取基因组DNA,采用PCR扩增ZNF185基因的全部22个外显子及外显子与内含子交界区域,用直接双向测序、BLAST比对进行突变分析。结果对ZNF185基因直接测序发现了4个变异序列（3947C〉T、6054G〉A、7566T〉C、17462delcccactgttcc）均属于基因非编码区SNP（rs733359、rs2071258、rs2071259、rs66958885）,所有变异序列均存在于患者及其部分正常亲属中,与疾病表型无共分离现象。结论排除了ZNF185基因外显子突变导致该家系高度近视的可能性。     

睑结膜部炎症者肺炎衣原体、沙眼衣原体核酸检测

目的 探讨我国睑结膜部炎症者病灶部是否存在肺炎衣原体（Cpn)。方法 收集39例慢性结膜炎、沙眼患者的睑结膜病灶部刮取物，应用nested PCR(nPCR)技术检测肺炎衣原体（Cpn)和沙眼衣原体（Ct)核酸。并随机抽取2例Cpn nPCR阳性产物进行全自动DNA测序，加以佐证。结果 39例患者中Cpn阳性13例（33．3％），Ct阳性5例（12．8％）。慢性结膜炎和沙眼病例均有Cpn和Ct阳性者。2例Cpn nPCR阳性产物经全自动DNA测序与Cpn(CWL-29株）高度同源。结论 我国睑结膜部炎症者病灶部存在Cpn。     

聚合酶链反应对眼分泌物中沙眼衣原体的检测价值

目的：探讨聚合酶链反应在沙眼诊断中的临床应用价值。方法：应用聚合酶反应,引物选用具有衣原体属性的１６ＳｒＲＮＡ基因,扩增检测沙眼衣原体。结果：在９３例诊断为沙眼的患者中,沙眼衣原体阳性率７４．２％;在１７８例诊断非沙眼患者中,沙眼衣原体阳性率３．４％,其检测灵敏度和特异性分别为７４．２％和９６．７％,两组间（沙眼组和非沙眼组）比较有显著性差异（Ｐ〈０．００１）。结论：聚合酶链反应对沙眼分泌物中沙眼     

PCR扩增技术在新生儿结膜炎中的诊断应用

目的 探讨PCR扩增技术在新生儿结膜炎临床诊断中的价值。方法 采用PCR扩增技术和直接涂片镜检两种方法，分别检测1997年9月～2002年10月到中山大学中山眼科中心就诊的200例新生儿结膜炎息儿的结膜标本中的淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体。结果 PCR扩增检测出18例淋球菌阳性(9％)，65例沙眼衣原体阳性(32．5％)，8例解脲支原体阳性(4％)；直接涂片镜检法检出14例淋球菌阳性(7％)，47例沙眼衣原体阳性(23．5％)，5例解脲支原体阳性(2．5％)。PCR扩增的阳性率比直接涂片镜检高。结论 PCR扩增技术是一种快速、简便、灵敏的检测新生儿结膜炎常见致病病原体的方法，与传统直接涂片镜检法比较，具有一定的优势。     

I型Stickler综合征家系临床和基因突变研究

背景Stickler综合征是一种遗传性结缔组织病,主要以眼部、关节、口面部及听力损伤为特征。确定Stickler综合征的基因突变位点能够为该综合征的基因诊断和治疗提供依据。目的研究一个I型Stickler综合征家系的临床特征并确定致病基因突变。方法对一个患I型Stickler综合征的家系进行临床研究和系谱分析。采集Stickler综合征家系中3例患者和6位表型正常者的外周血标本,采用PCR法扩增COL2A1基因的全部外显子及其侧翼,对扩增产物进行直接测序,结果与Genbank中相应序列进行比对。同时检测100位无亲缘关系的正常人外周血标本进行对照。结果该家系共4代11位成员,2位成员去世,其中包括1例患病者。现存的9位成员中共3例患者,调查显示该家系符合常染色显性遗传方式。3例患者的临床特点包括高度近视、膜型玻璃体异常及面中部扁平、短鼻、腭裂等,符合I型Stickler综合征的临床诊断。COL2A1基因突变筛查结果显示,该家系中3例患者COL2A1基因内含子12的第～个碱基发生了单个碱基缺失（IVSl2＋1Gde1）的杂合性剪接位点突变,核苷酸序列分析结果证实该突变致提前形成终止密码子,形成一种包括306个氨基酸在内的截短蛋白,导致该基因的功能异常,而家系中表型正常者及无亲缘关系的正常对照者均未发现该基因突变。结论本研究确定了一个I型Stickler家系,并在该家系确定了一个新的COL2A1基因突变,这是中国首次报道Stickler综合征家系的基因突变。     

视网膜色素变性一家系与IMPDH1基因突变相关

目的检测一个常染色体显性遗传性视网膜色素变性家系的IMPDHl基因的突变特征以及与临床表型的关系，探讨其病因和发病机制，利用分子遗传学的方法，确定家系内遗传连锁关系。方法严格按照有关伦理学要求进行家系收集，所有现存家系成员行详细的眼科检查（包括视力检查、裂隙灯和眼底镜检查、视野、暗适应阈值以及ERG检查）。提取该家系lO例患者、lO例未患病成员外周血基因组DNA：应用聚合酶链反应扩增IMPDHl第7外显子基因片段，利用扩增产物直接测序方法对样本进行IMPDHl基因突变检测。结果该家系中lO例患者的IMPDHl基因发生了Asp-226-Asn（GAC→AAC）的错义突变，lO例家系未患病成员则没有此突变。结论IMPDHl基因的一种已知突变Asp-226-Asn与该家系所发生的视网膜色素变性存在紧密连锁关系。     

直接PCR法对感染性棘阿米巴角膜炎的诊断价值

背景棘阿米巴角膜炎的致盲率极高,发病初期易误诊为真菌性角膜炎或病毒性角膜炎,常规的临床诊断方法费时较长,特异性差,极易错过治疗的“时间窗”。常规PCR法检测简单、特异、有效,但由于病变标本取材量少,不易提取组织DNA,限制了其临床应用。目的探讨非提取组织DNA的直接PCR法扩增棘阿米巴虫株18SrRNA保守序列在棘阿米巴角膜炎快速诊断中的可行性。方法从山东省眼科研究所暨青岛眼科医院诊治的10例棘阿米巴角膜炎患者的病变角膜中分离10株棘阿米巴虫株,经鉴定均为T4基因型虫株。用直接PCR法分别扩增棘阿米巴原虫、白念珠菌、绿脓杆菌、I型单纯疱疹病毒以及正常人角膜上皮细胞以确定该方法的特异性。将棘阿米巴原虫稀释至不同的浓度以确定直接PCR法的敏感性。采用SPF级6周龄健康雌性BALB／c小鼠构建棘阿米巴角膜炎动物模型,于感染后第1、3、5、7、10、15天获取角膜组织,分别进行直接PCR、实时定量PCR（real—timePCR）、K0H封片镜检和原虫培养鉴定,比较各种方法的有效性和可行性。结果直接PCR法仅能扩增棘阿米巴DNA,其他病原体DNA均未扩增出;在每个获取的棘阿米巴角膜炎样本中最少可检测到10个棘阿米巴原虫。在棘阿米巴角膜炎小鼠模型中,直接PCR法在感染后第1、3、5、7、10、15天的阳性检出率分别为80．0％、90．0％、80．0％、70．0％、70．0％和50．0％,总阳性率为73．3％,高于原虫培养法的31．7％,差异有统计学意义（P=0．005）;K0H封片镜检的总阳性率为56．7％,real—timePCR法检测的总阳性率为61．7％,均略低于直接PCR法,差异均无统计学意义（P=0．056、0．172）。结论直接PCR法操作简单,在上述4种方法中对棘阿米巴原虫检测的特异性和敏感性最高,能够快速诊断棘阿米巴角膜炎,尤其对于待检标本少而无法提取DNA的患者可首选。     

应用目标基因捕获结合二代测序技术检测无遗传性眼病家族史的遗传性视网膜疾病患者的致病基因

背景 遗传性视网膜疾病(HRDs)是以原发性视网膜病变为主要病理改变、视力和色觉等视敏度严重损害为主要临床表现的致盲眼病,其与遗传因素密切相关,是临床上难治性盲的首要原因. 目的 应用目标基因捕获结合二代测序技术检测HRDs的致病基因. 方法 选择2014年1月至2015年1月在宁夏眼科医院就诊的无遗传性眼病家族史的20例HRDs患者作为研究对象.收集所有患者及其家庭成员临床资料,完善眼科检查,抽取患者和家庭正常成员外周静脉血,提取DNA.针对232个HRDs已知致病基因的目标序列设计并定制目标序列捕获芯片,借助高通量二代测序技术检测患者的遗传变异,数据经分析滤过,候选突变进行Sanger测序验证和致病性评估,明确致病基因和突变,并对表型和基因型间的关系进行分析.结果 20例HRDs患者中有11例患者检测到致病性突变位点,共涉及9个基因,阳性率为55％.其中有8例患者检测到复合杂合突变,3例患者为纯合子突变,均为新发现的突变位点.通过对家系成员的基因筛查分析,6例HRDs患者为常染色体隐性遗传,5例遗传类型不确定.结合临床表型以及基因检测结果分析,11例HRDs患者的诊断分别为锥杆细胞营养不良5例,致病基因分别为ABCA4、RPE65、USH2A、RIMS1和RHO;Leber先天性黑曚3例,致病基因分别为CRB1(2例)和LCA5;先天性静止性夜盲l例,致病基因为PRPF3;Best卵黄样黄斑营养不良1例,致病基因为BEST1基因;Stargardt病1例,致病基因为ABCA4基因. 结论 目标基因捕获结合二代测序技术可以对视网膜疾病患者进行快速、有效的基因诊断,结合临床特征分析有助于提高隐性遗传及遗传方式不明的HRDs的临床诊断水平.     

宏基因组测序技术检测感染性葡萄膜炎病原体的初步研究

目的探讨宏基因组测序(MGS)技术在感染性葡萄膜炎诊断中的作用。方法横断面研究。对2016年3月至2018年7月首都医科大学附属北京同仁医院临床疑诊为感染性葡萄膜炎的19例患者的19份玻璃体标本进行MGS检测。患者中男性8例, 女性11例, 年龄19～68岁;右眼10例, 左眼8例, 双眼1例;临床诊断急性视网膜坏死8例(9只眼), 诊断不明11例(11只眼)。每份标本留取玻璃体约1 ml, 800 μl标本用于MGS, 200 μl标本用于实时荧光定量PCR的验证实验。MGS使用TIANamp Micro DNA Kit试剂盒提取样本DNA, BGISEQ-500平台测序。将测序数据中低质量和长度小于35 bp的数据、人类参考基因组序列及低复杂度序列去除后, 获得的数据与专用微生物数据库比对分析, 通过统计对比序列数占比、唯一序列数、覆盖率、测序深度等参数确定测序阳性结果, 使用实时荧光定量PCR方法对上述结果准确性进行验证。结果 19份标本MGS检出多种微生物, 7份测序结果为阳性。其中3份为水痘-带状疱疹病毒、2份为白念珠菌、1份为痤疮丙酸杆菌、1份为副流感嗜血杆菌。3份水痘-带...     

单纯疱疹病毒I型截短糖蛋白B基因序列的克隆及鉴定

目的构建单纯疱疹病毒I型（herpes simplex virusI，HSV—I）SM44株截短糖蛋白B基因序列，为研制联合基因疫苗奠定基础，用于角膜炎的防治。方法利用聚合酶链反应（polymerase chain response，PCR）技术从感染HSV—I SM44株的vero细胞中扩增出HSV-gBt编码基因，经双酶切鉴定后将目的基因定向插入真核表达质粒pcDNA，载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，并对其进行酶切分析和测序鉴定。结果对pcDNA3-gBt双酶切后，电泳可见目的基因（1．5kb）和线性质粒pcDNA3（5．4kb）两条带；测序结果表明，克隆基因插入方向正确，与基因库中登录的HSV-1 F株gB基因序列比较，同源性达99．5％。结论经证实成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，为进一步研究其免疫学效应及构建病毒糖蛋白联合疫苗并最终用于单疱病毒角膜炎的预防和治疗奠定理论基础.