人源抗恶性疟原虫单链抗体库的制备及鉴定

目的通过噬菌体展示技术构建人源抗恶性疟原虫单链抗体库(ScFv),从中筛选出高亲和力的抗体基因片段,为进一步单链抗体表达打下基础。方法收集患者新鲜外周血,进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,提取总RNA经RT-PCR扩增出人源抗体重链和轻链抗体库,采用用重叠延伸拼接法将VH与VL以Linker相连组装成单链抗体基因(ScFv),将ScFv基因片段连接至载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG 1感受态细胞,构建的鼠源性抗恶性疟原虫天然噬菌体抗体库。结果从20个噬菌体克隆中筛选到15个具有弓形虫可溶性抗原结合活性的阳性克隆。结论从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗恶性疟原虫单链抗体的策略是可行的。     

HIV-gp120人源单链可变区抗体筛选与鉴定

目的 通过制备抗人类免疫缺陷病毒(HIV)gp120蛋白人源单链可变区抗体(seFv),探索新型抗人获得性免疫缺陷病毒(HIV)治疗方法.方法 采用噬菌体表面展示技术,将HIV-gp120蛋白固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮吸附-洗脱-扩增筛选过程,随机挑选96个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,进行免疫学检测和鉴定,获得与HIV-gp120蛋白结合活性较强的scFv阳性克隆,并对HIV-gp120蛋白ScFv的编码基因进行序列测定分析.结果 经过筛选96个克隆中有39株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应,确定其中有7株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.提取质粒,进行DNA序列测定,DNA为699 bp.结论 用噬菌体抗体库技术成功地获得抗HIV-gp120蛋白的scFv,为抗gp120蛋白的ScFv防治艾滋病研究创造了条件.     

抗氯菊酯人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选氯菊酯人源单链可变区（scFv）抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,以氯菊酯作为抗原,固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选过程,随机挑选抗氯菊酯的100个克隆,利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与氯菊酯结合活性较强的scFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定Sfi Ⅰ/Not Ⅰ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠杆菌XL1-Blue,提取质粒进行酶切鉴定分析.结果 经过筛选100个克隆中有18株克隆ELISA的吸光度（A值）-490 nm波长（A490nm）值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应,确定有5株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化感受态细胞XL1-Blue.结论 提取质粒酶切片段与目的相符;为下一步其特异性亲和力的研究创造了条件.     

乙肝病毒核心抗原人源单链可变区抗体的筛选

目的　筛选、鉴定乙型肝炎病毒 (HBV)核心抗原 (HBcAg)蛋白的人源单链可变区抗体 (ScFv)的编码基因 ,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗HBV的基因治疗研究奠定基础。方法　采用噬菌体表面展示技术 ,以HBcAg蛋白为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”筛选过程 ,获得抗原结合活性较强的HBcAg人源单链可变区抗体阳性克隆 ,并对其进行免疫检测及序列测定。结果　筛选得到的ScFv片段编码基因为 771nt,编码的产物由 2 5 7个氨基酸残基组成 ,具有典型的轻链和重链可变区结构特点以及与HBcAg结合的特异性。结论　利用噬菌体抗体库技术成功地获得了HBcAg人源单链可变区抗体的编码基因 ,并获得了可溶性单链抗体的表达。     

全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定

目的从全人源抗鼻咽癌噬菌体抗体库中筛选特异性单链抗体（ScFv）,并对其特异性进行鉴定。方法通过噬菌体表面展示技术把ScFv表达在噬菌体表面,以鼻咽癌细胞作为抗原,用抗原递减法,通过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体,及ELISA筛选,获得特异阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序。结果通过对抗体库进行三轮正负淘洗和富集后,随机挑选4212个克隆进行ELISA,发现3个克隆对CNE2呈强阳性反应,而与人正常细胞系HUVEC等呈弱阳性反应或不反应。对克隆HNSA033进一步进行免疫细胞化学验证,结果与ELISA反应一致;免疫组织化学鉴定表明克隆HNSA033与鼻咽癌组织和鼻咽组织阳性率的差别有统计学意义。结论通过淘选富集、ELISA和免疫化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆,为鼻咽癌发病机制的研究和临床诊断以及治疗奠定了基础。     

T7噬菌体衣壳蛋白IOA的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化T7噬菌体衣壳蛋白10A,并免疫家兔得到抗10．4多克隆抗体．为研究噬菌体展示抗体技术,进而筛选致病微生物蛋白抗体奠定基础。方法37℃培养含有17噬菌体10A蛋白质粒的大肠杆菌BLT5615,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷直接诱导表达该蛋白;SDS．PAGE鉴定表达状态,盐酸胍变性一尿素复性纯化以包涵体形式存在的蛋白并免疫家兔：辛酸一硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体,间接ELISA测定效价,WesternBlot鉴定特异性。结果成功表达了T7噬菌体衣壳蛋白10A。SDS—PAGE显示所表达的蛋白相对分子质量约为37kDa。主要以包涵体形式存在：复性后SDS—PAGE分析获得单一条带蛋白。利用该蛋白免疫家兔,6次免疫后抗血清的效价均达到1：160003。纯化后的多克隆抗体可以和17噬菌体衣壳蛋白10A特异结合。结论成功表达、纯化了17噬菌体衣壳蛋白10A,并制备了其多克隆抗体。     

抗脂多糖单链噬菌体抗体在大肠埃希菌中的表达及筛选

目的研究小鼠鼠源性的抗脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)单链可变区片段(single-chain fragment variable, ScFv),即在大肠埃希菌TG1中的表达,并筛选出对LPS具有较高亲和力的ScFv. 方法将预先构建好的有效库容量为4.75×106的噬菌体抗体库接种至SOBAG培养基上,隔夜培养后扩容至约1×1010;严格控制lac启动子的表达,仅当加入M13KO7辅助噬菌体后才使ScFv以附着型的形式表达,然后利用LPS淘筛特异性的ScFv,富集的噬菌体阳性克隆重新感染TG1;最后随机挑选出190个菌落在96孔培养板分别培养单个含特异性ScFv的TG1菌落,经间接ELISA检测抗LPS的ScFv. 结果淘筛一轮过后即有3×104阳性菌落长出,190个菌落经间接ELISA检测有两个阳性克隆.结论成功地使鼠抗LPS ScFv在大肠埃希菌中表达,并从中筛选出了两株抗LPS ScFv.     

抗盐酸克伦特罗人源ScFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选盐酸克伦特罗(CLB)人源单链可变区(ScFv)抗体,为研究快速检测试剂(盒)提供基础依据.方法 采用噬菌体表面展示技术,以CLB作为抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选抗CLB的60个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与CLB结合活性较强的ScFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XLI-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;并对CLB ScFv的编码基因序列分析.结果 经过筛选60个克隆中有15株克隆ELISA的吸光度(A490nm)值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应,确定有7株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;DNA为750 bp;经BLAST分析,此片段属于新抗体基因序列,GenBank注册号为:EU681272.结论 本实验用噬菌体抗体库技术能够初步获得抗CLB的ScFv抗体,为下一步其特异性亲和力的研究创造了条件.     

人源抗胃癌单链抗体的构建及初步鉴定

目的构建库容大、多样性好的噬菌体展示人源抗胃癌单链抗体。方法收集胃癌患者外周血分离淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建人源单链抗体库并初步筛选抗胃癌单链抗体,用ELISA方法检验该抗体与胃癌细胞结合活性。结果成功构建了次级库容达4.0×109pfu/ml的噬菌体展示人源单链抗体库,并初步筛选到与胃癌细胞特异性结合的单链抗体。结论成功构建和筛选人源抗胃癌单链抗体,为进一步表达和应用特异性抗胃癌单链抗体奠定基础。     

噬菌体展示肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位的研究

目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序确定插入七肽的氨基酸序列。结果经过4轮淘选,共筛选到11株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合能被赭曲霉毒素A阻断,模拟表位的共有序列为IRPMVXX,X为任意氨基酸。以其中的P2号克隆建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200～8000pgml,检测下限为150pgml。结论噬菌体展示技术可成功筛选到赭曲霉毒素A模拟表位,筛选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学分析方法。     

甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体制备及其初步应用

目的 制备甲型流感病毒核蛋白(NP)单克隆抗体,为甲型流感病毒诊断试剂盒以及相关研究提供材料.方法 大肠埃希菌BL21 (DE3)表达NP作为免疫原,免疫Balb/c小鼠后取脾脏细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性细胞株,注射小鼠腹腔得到单克隆抗体,纯化后进行Western印迹法、ELISA法、细胞免疫染色和荧光法、双抗夹心ELISA法确定NP抗体的生物学特性,探索应用范围.结果 从Western印迹法、ELISA和细胞免疫染色法的结果可得知,抗NP单克隆抗体可以与免疫原特异性结合,也可以与H1N1、H3N2亚型流感病毒的NP特异性结合,具备检测流感病毒的能力.双抗夹心ELISA法进一步提升了抗体对抗原的检测灵敏度至128 pg.同时,通过细胞免疫荧光法观察到抗体可在细胞内显示NP从细胞核扩散到细胞质的过程.结论 制备的抗体成功检测H1N1、H3N2两种亚型的流感病毒,可作为用于流感防治的流感病毒诊断试剂盒的材料.     

采用噬菌体展示技术筛选黄曲霉毒素B_1模拟抗原表位

目的从随机肽库中筛选黄曲霉毒素B1模拟抗原表位,以建立无需黄曲霉毒素B1偶联抗原的免疫学检测方法。方法利用噬菌体展示技术,以抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和淘选,ELISA鉴定阳性克隆,通过DNA测序对每个阳性克隆进行定性分析。结果通过4轮结合/扩增循环,获得了能与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合的肽,采用间接竞争ELISA,筛选到了4株能抑制黄曲霉毒素B1的阳性克隆子,经DNA测序得到HXXDPXH共有序列,其中X为任意氨基酸。以其中P10噬菌体阳性克隆建立竞争ELISA方法,线性范围为500~2000pg/ml,检测下限为50pg/ml。结论利用噬菌体展示技术筛选到了黄曲霉毒素B1模拟抗原表位,并以其代替黄曲霉毒素B1偶联抗原建立了免疫学检测方法。     

人天然Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的构建人天然Fab段噬菌体抗体库,建立人源抗体制备技术平台,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法。方法从一个健康献血员取200ml新鲜血液,分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA,依次将PCR产物插入载体pComb3相应位点,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13产生噬菌体抗体库,酶切和PCR鉴定有无插入片段,用白蛋白和IL-2作为抗原进行筛选富集。结果部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增。Fab表达库容达约1·2×106,酶切和PCR显示有插入片段。用不同蛋白进行几轮筛选,抗体库得到了不同程度的富集。结论本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体,用于免疫治疗打下基础。     

鼠源抗烟曲霉单链抗体库制备及鉴定

目的 构建鼠源抗曲霉菌单链抗体（scFv）噬菌体展示文库并进行初步鉴定,为制备用于侵袭性曲霉感染实验室诊断的特异性抗体提供新的方法。方法 利用噬菌体展示技术构建鼠源抗烟曲霉半乳甘露聚糖（GM）ScFv库,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”淘选富集,随机挑选克隆进行可变区基因测序确定文库多样性,并用phage-ELISA筛选烟曲霉特异性结合的克隆。结果 构建的scFv噬菌体表达文库,库容量约为1.8×10⁷;经4轮富集筛选,洗脱的表达scFv噬菌体滴度渐增;随机挑选出4轮筛选后的20个克隆,其可变区基因序列不同;随机挑选出4轮筛选后的90个克隆,其中6个克隆与烟曲霉GM特异性结合,而与对照的白假丝酵母菌无结合。结论 构建并初步鉴定了抗曲霉菌单链抗体库,库容量大,VH和VL区具备多样性;筛选的scFv与曲霉菌GM特异性结合,提供了快速制备、筛选GM高特异性抗体分子的新方法。     

用体外致敏的鼻咽癌患者B细胞构建全人源噬菌体单链抗体库

目的构建全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库，为筛选鼻咽癌相关抗原的抗体奠定基础。方法采用体外致敏与EB病毒（EBV）转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞（PBMC），提取总RNA，用RT—PCR技术扩增人抗体重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因，用编码（Gly4Ser）3的互补序列连接成单链抗体ScFv基因（VH-linker—VL），并克隆到噬菌粒载体FUSE5，转化大肠杆菌MC1061，构建噬菌体呈现型ScFv库。结果成功地构建了全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库，库容量为6．5×10^7，约100％的噬菌体基因中有ScFv基因的插入。结论联合应用体外致敏和EBV转化及噬菌体呈现技术构建全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库是可行的，这为进一步筛选鼻咽癌相关抗原的抗体奠定了基础。     

人源抗TNFα单克隆抗体的制备及初步鉴定

应用抗ＴＮＦ单抗治疗菌血症和内毒素休克已证明是一种有效的策略，人源抗ＴＮＦ抗体较鼠单抗或其它动物来源的单抗具有更大的应用前景。我们用一个混合的人抗体组合噬菌体抗体库，针对人重组ＴＮＦα进行筛选获得了对人重组ＴＮＦα具有亲和性和特异性的噬菌体抗体。然后我们又建立一个人抗体轻链库，用以对筛选到的抗体进行轻链置换。结果获得了与人重组ＴＮＦα具有更高亲和力的噬菌体抗体。对该抗体在大肠杆菌中所做的可溶性表达表明，其Ｆａｂ片段能与人重组ＴＮＦα结合。ＤＮＡ测序表明该抗体属ＩｇＧⅢ亚类并含有一条κⅢ亚类的轻链     

抗类风湿人源单链抗体库的制备及筛选

目的 通过噬菌体展示技术构建抗类风湿人源单链抗体库,为其进一步的临床应用研究奠定基础。方法提取患者外周淋巴细胞总RNA,逆转录合成cDNA,以人源免疫球蛋白H链和L链可变区的扩增引物,分别扩增出H链和L链可变区基因。采用SOE—PCR法将VH和比片段随机拼接成scFv片段,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中,构建噬菌体单链抗体库。结果初级库库容量为3×10^6,在大肠杆菌TG1中重组后得到1．2×10^6的次级抗体库。结论本研究成功构建类风湿人源单链抗体库,拟为类风湿病的预防、诊断、治疗奠定基础。