低氧诱导因子-1α抑制剂逆转K562/A02细胞多药耐药机制研究

目的 探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5'-Hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazoh(YC-1)对人白血病耐阿霉素细胞K562/A02的耐药逆转作用,并探讨逆转机制.方法 采用MTT法检测不同浓度YC-1和阿霉素(ADM)单独或联合使用48 h对K562/A02细胞和K562细胞增值抑制效应及耐药逆转效应;用流式细胞术检测0、5、10和20 μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素作用K562/A02细胞48 h后细胞凋亡率及联合应用后细胞内阿霉素浓度;半定量RT-PCR检测各组细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、mdr1基因mRNA表达变化;Western blot方法检测各组细胞HIF-1α、P-糖蛋白(P-gp)表达变化.结果 K562与K562/A02细胞对阿霉素的IC50值分别为(1.56±0.07)mg/L和(42.98±3.15)mg/L,耐药倍数为27.55倍.予5、10和20μmol/L YC-1作用后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药倍数分别为24.63、16.38和10.71倍;0、5、10和20μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后,凋亡率分别为(1.9±0.9)%、(4.9±0.9)%、(5.8±1.1)%和(9.3±1.4)%与(2.3±0.7)%、(8.2±1.2)%、(19.0±1.7)%和(34.5 ±2.4)%.0、5、10和20 μmol/L YC1联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后细胞内阿霉素荧光强度分别为232±33、1300±219、1961±240和3342±269;随着YC-1浓度增加,HIF-1α mRNA表达没有明显差异,mdr1 mRNA逐渐下调,HIF-1±和P-gp表达均下调.结论 YC-1可以通过抑制HIF-1α蛋白表达,下调mdr1 mRNA水平和P-gp水平,增加细胞内阿霉素药物浓度,部分逆转K562/A02细胞耐药.     

活化Chk1引起的G2/M期阻滞在调节K562/A02细胞耐药中的机制探讨

本研究探讨活化的Chk1对白血病细胞周期及凋亡的影响,探究Chk1调控肿瘤细胞耐药的机制.以慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02(耐阿霉素)为研究对象,与阿霉素共孵育后,用流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平,Western blot检测转染前后Chk1磷酸化水平;靶向Chk1shRNA抑制细胞内Chk1的表达后,用流式细胞术检测阿霉素作用后细胞的凋亡情况.结果表明阿霉素致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为(54.12±0.57)%,显著高于K562细胞(36.99±1.28)%; Chk1mRNA表达水平在K562与K562/A02细胞间无显著差异; Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为0.79 ± 0.56,在K562细胞为0.27 ± 1.47,其差异有统计学意义.转染Chk1shRNA后,两株细胞的Chk1磷酸化水平显著下降.转染组K562、K562/A02细胞凋亡率分别是空载体转染组的1.30倍和3.84倍.结论 Chk1的活化水平调控着K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

鼠尾草酸逆转K562/A02细胞多药耐药的机制研究

目的 探讨鼠尾草酸(Canosic acid,CA)对人类白血病多药耐药(MDR)细胞系K562/A02细胞的逆转作用及机制.方法 MTT法测定CA作用前后K562/A02细胞对阿霉素(ADM)的敏感性.流式细胞术(FCM)和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定细胞内ADM的平均荧光强度,计算细胞内ADM浓度.半定量RT-PCR检测细胞mdr1 mRNA表达水平.采用流式细胞术和Western blot 检测细胞膜P糖蛋白(P-gp)表达.结果 CA可将ADM对K562/A02细胞的IC50值由16.31μg/ml降至1.35μg/ml,逆转倍数为12.08倍.流式细胞术检测结果表明CA可将K562/A02细胞内ADM的荧光强度由17.05提高到60.53(P<0.01).LSCM结果显示CA可恢复ADM在K562/A02细胞的细胞核和胞质中的弥散分布,并使细胞内ADM的浓度由4.9 Oμg/ml提高至15.4μg/ml.RT-PCR结果显示K562/A02细胞mdr1 mRNA水平明显高于K562细胞,CA处理后K562/A02细胞mdr1 mRNA水平明显降低(P<0.01).流式细胞术检测K562/A02细胞膜上P-gp的荧光强度在经CA处理后由44.40降至22.80(P<0.05).Western blot结果显示CA处理后的K562/A02细胞膜上P-gp的表达明显降低.结论 在体外,CA可有效逆转人白血病细胞K562/A02的MDR,其逆转耐药的机制可能与P-gp蛋白表达下调并抑制其功能有关.     

YB-1蛋白对白血病细胞K562/A02生物学行为的影响

本研究探讨YB-1基因表达下调后对白血病细胞K562/A02生物学行为的影响及其机制。采用脂质体介导的方法将已构建的人YB-1基因特异性shRNA及随机片段HK的真核表达载体转染进白血病细胞K562/A02中,RT-PCR和免疫印迹反应检测YB-1 mRNA和蛋白表达量的改变;采用MTT法和细胞周期测定分析对白血病细胞增殖的影响;用AnnexinⅤ检测白血病细胞的凋亡程度;采用MTT法检测细胞IC50值变化;RT-PCR和流式细胞术检测基因转染前后细胞中的MDR1 mRNA和P-gp表达的变化。结果表明,阳性转染的3组细胞YB-1基因和蛋白的表达量明显低于随机片段组和未转染细胞;生长曲线提示阳性转染组细胞生长缓慢,细胞周期动力学分析显示阳性转染组G1期细胞增多,G2期与S期细胞显著减少;在小剂量As2O3作用下,阳性转染组细胞的凋亡数量明显高于对照组细胞;阳性转染细胞的阿霉素IC50明显低于随机片段组和阴性对照组;阳性转染细胞MDR1 mRNA水平明显降低,P-gp的峰值较对照组明显左移。结论:YB-1特异性shRNA能有效降低白血病细胞中YB-1的表达,减慢细胞生长,增加白血病细胞对化疗药物的敏感性,加速细胞凋亡。     

高压氧联合阿霉素对白血病K562/A02细胞凋亡的影响

本研究探讨0.2MPa高压氧(HBO)联合阿霉素对白血病多药耐药细胞K562/A02细胞凋亡的影响。利用流式细胞术法和透射电子显微镜检测细胞凋亡和caspase-3表达,用定量qReal-time PCR法检测HIF-1α、BCL-2和BAXmRNA表达水平,运用caspase-8试剂盒检测caspase-8的活性,Western blot法检测P-gp活性。结果表明:0.2MPa HBO联合阿霉素组细胞凋亡率高于ADM组[(47.36±3.87)%vs(28.51±1.09)%],差异有统计学意义(p<0.05)。0.2MPa HBO联合阿霉素组细胞HIF-1αmRNA、P-gp及BCL-2的蛋白水平低于ADM组,差异有统计学意义(p<0.05)。0.2MPa HBO联合阿霉素组细胞的BAX、caspase-3及caspase-8蛋白活性均高于ADM组,差异有统计学意义(p<0.05)。结论 :0.2MPa HBO联合阿霉素可逆转耐药细胞株K562/A02对阿霉素的耐药,提高细胞凋亡率,其机制可能与HIF-1α下调P-gp和BCL-2的表达以及提高caspase活性有关。     

5-溴汉防己甲素和柔红霉素对K562/A02细胞凋亡和survivin基因表达的影响

本研究探讨5-溴汉防己甲素(BrTet)联合柔红霉素(DNR)治疗耐药慢性髓系白血病的潜在可能性及其相关机制。采用流式细胞术检测DNR,BrTet或DNR和BrTet联合作用K562/A02细胞48小时后凋亡率情况;采用RT-PCR法检测对照组K562细胞、耐药K562/A02细胞及DNR或(和)BrTet作用于K562/A02细胞48小时后存活蛋白(survivin)mRNA表达水平;采用Western blot法检测各组细胞survivin蛋白表达水平。结果表明:BrTet与DNR联合作用对K562/A02细胞的诱导凋亡率较其余各组显著升高,同时联合用药组K562/A02细胞survivin mRNA和蛋白的表达较空白对照组和单药组下调,K562/A02细胞survivin表达较K562细胞升高。结论:BrTet联合DNR能有效逆转耐药,促进K562/A02细胞凋亡,其机制可能与survivin表达下调有关。     

含扶正解毒汤药血清对白血病K562/A02耐药细胞的抑制作用及初步机制

目的:探讨含扶正解毒汤药血清对白血病耐药细胞株K562/A02的抑制效果及可能的机制。方法:采用M TT法检测含扶正解毒汤药血清对K562/A02耐药细胞的生长抑制率,流式细胞技术测定含扶正解毒汤药血清处理各组K562/A02细胞后的凋亡情况,QPCR法检测BCL-2 mRNA的表达,Western blot方法检测BCL-2蛋白的表达,流式细胞技术测定细胞膜P-gp蛋白的表达。结果:MTT细胞毒实验结果表明含扶正解毒汤药血清具有抑制k562/A02细胞生长的效果,且抑制率呈药物浓度相关性;流式细胞检测结果表明含扶正解毒汤药血清可以诱导k562/A02耐药细胞的凋亡,凋亡率呈药物浓度相关性;Q-PCR结果显示,含扶正解毒汤药血清可以下调K562/A02细胞BCL-2蛋白的表达;流式细胞检测结果表明,含扶正解毒汤药血清可下调K562/A02细胞膜P-gp蛋白的表达。结论:含扶正解毒汤药血清可以促进K562/A02耐药细胞的凋亡,其诱导细胞凋亡的机制可能与抑制BCL-2蛋白和P-gp蛋白的表达有关。     

WT1基因表达下调对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响

目的 探讨WT1基因表达下调对人红白血病耐药细胞系K562/A02阿霉素敏感性的影响.方法 将WT1mRNA的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA)构建至真核表达载体后转染K562/A02细胞,流式细胞术检测转染效率;荧光定量RT-PCR和Western blot法分析WT1基因在转染前后表达的差异;pWT1shRNA转染K562/A02细胞48 h并经阿霉素作用后,MTT法检测各组细胞阿霉素IC50值;流式细胞术检测细胞阿霉素累积量及细胞凋亡率.结果 与未转染对照组及空载体组相比,转染WT1shRNA质粒的K562/A02细胞WT1mRNA和蛋白水平均明显降低;经阿霉素诱导24 h后,其对阿霉素的敏感性明显增高,相对逆转率为71.5%,细胞内阿霉素的累积量较各对照组明显增高(P值均<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论 靶向WT1shRNA干扰质粒可有效抑制K562/A02细胞WT1基因表达,增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

藤黄酸对白血病K562/A02细胞的耐药逆转作用

本研究旨在探讨藤黄酸(gambogic acid,GA)对K562/A02细胞株的耐药逆转作用及其逆转机制。采用MTT法检测GA对K562和K562/A02细胞的增殖抑制作用及对K562/A02细胞阿霉素(ADM)耐药逆转效应;用流式细胞术检测GA联合ADM对K562及K562/A02细胞凋亡率的影响;DAPI荧光染色观察ADM联合GA作用后细胞的形态学改变;Western blot法检测K562及K562/A02细胞P-糖蛋白(P-gp)、存活蛋白(Survivin)基因的表达。结果表明:ADM作用48 h抑制K562和K562/A02细胞增殖的IC50值分别为(1.42±0.07)μg/ml和(28.42±1.40)μg/ml。GA≤0.0625μmol/L时,对K562及K562/A02细胞株无明显增殖抑制作用;0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞能增加其对ADM的敏感性,耐药逆转倍数为1.53。0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞48 h能提高细胞的凋亡率(P<0.05),下调Survivin及P-gp蛋白的表达(P<0.05)。结论:GA可以逆转K562/A02细胞的耐药性,增强耐药细胞对ADM的敏感性,其机制可能与提高K562/A02细胞凋亡、下调Survivin和P-gp蛋白的表达有关。     

TIEG1对K562细胞凋亡及BCL-2/BAX、PTEN表达的影响

本研究旨在观察TIEG1诱导K562细胞凋亡及BCL-2/BAX、PTEN表达的变化.用TIEGl0、1、5、10和20ng/ml处理K562细胞,MTT法检测细胞生长抑制率.TIEG1 10.00 ng/ml处理K562细胞后流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR方法检测BCL-2/BAX及PTEN的表达.结果表明,T1EG1对K562细胞增殖具有抑制作用,且呈时间及剂量依赖性（r=0.52,P＜0.05）;处理细胞6、12、24和48 h后TIEGl IC50值分别为48.19、18.72、9.5和3.85 ng/ml.TIEG1 10.00 ng/ml处理K562细胞0、6、12、24和48 h后凋亡率分别为（2.13±0.42）％、（7.79±0.71）％、（11.17±1.37）％、（24.66±0.29）％和（48.60±1.38）％,各组凋亡率相比较统计学差异具有显著性（P＜0.05）.在TIEG1诱导K562细胞凋亡过程中,BCL-2表达逐渐减少（r=0.48,P＜0.05）,而BAX（r=0.69,P＜0.05）及PTEN（r=0.57,P＜0.05）表达逐渐增加.结论：TIEG1诱导K562细胞凋亡并抑制其增殖,且呈时间、剂量依赖性.在TIEG1诱导K562细胞凋亡的过程中,BCL-2/BAX及PTEN表达变化与K562细胞凋亡相关.     

低氧诱导因子抑制剂对白血病细胞株HIF-1α和VEGF表达及诱导细胞凋亡作用的研究

本研究探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5′-hydroxymethyl-2′-furyl)-1-benzylindazole(YC-1)对人急性白血病病细胞低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)和血管内皮因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的调节及诱导细胞凋亡作用。应用DAPI染色检查凋亡细胞的形态;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR检测K562、U937、Jurkat白血病细胞株hif-1α和vegf mRNA表达以及YC-1对U937细胞hif-1α、vegf mRNA表达影响;Western blot检测YC-1对U937细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达,以及BAX、BCL-2、caspase-3蛋白变化,分析YC-1诱导U937细胞凋亡的可能机制。结果表明:在3种白血病细胞株均可见hif-1α和vegf mRNA表达。4μmol/L YC-1处理U937细胞(0、8、16和24小时)后,可见凋亡细胞出现的典型凋亡形态特征;流式细胞术检测的细胞0、8、16和24小时凋亡率分别为(4.87±0.70)%、(27.27±2.00)%、(51.53±2.81)%及(60.5±3.20)%;vegf mRNA表达下调,而hif-1αmRNA表达无明显变化;HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和BCL-2蛋白表达下调,而BAX和caspase-3蛋白表达上调,BAX/BCL-2比率升高并呈时间依赖性(r=0.973,p0.01)。结论:3种白血病细胞株均显示hif-1α和vegf mRNA表达,YC-1可以抑制白血病细胞HIF-1α蛋白表达,进而下调VEGF,并通过上调BAX/BCL-2比率、caspase-3蛋白表达诱导细胞凋亡。     

复方浙贝颗粒联合阿霉素对K562／A02移植瘤细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

本研究旨在探讨复方浙贝颗粒联合阿霉素对K562／A02移植瘤细胞凋亡及BCL-2、BAX蛋白表达影响。将多药耐药K562／A02细胞接种于BALB／c—nu裸鼠腋前皮下构建多药耐药移植瘤模型,用Annexin V—FITC／PI流式细胞术检测实验各组移植瘤细胞的凋亡率;用免疫组织化学染色法检测实验各组移植瘤细胞的BCL-2、BAX蛋白表达,并计算蛋白表达积分的光密度值（IOD）。结果发现,复方浙贝颗粒各剂量联合阿霉素组的细胞凋亡率与对照组、阿霉素组相比有统计学意义（P〈0．05）;与对照组和阿霉素组相比,复方浙贝颗粒各剂量联合阿霉素组多药耐药移植瘤BCL-2表达的IOD值降低（P〈0．05）,BAX表达的IOD值增高（P〈0．05）。结论：复方浙贝颗粒是通过增强阿霉素对耐药移植瘤的促细胞凋亡,减少耐药移植瘤的BCL-2蛋白表达,增加BAX蛋白表达而逆转多药耐药。     

异硫氰酸苯乙酯对K562／A02细胞阿霉素耐药影响的研究

本实验研究探讨异硫氰酸苯乙酯（phenylhexyl isothiocyanate,PHI）对K562／A02细胞的阿霉素（ADM）耐药性与敏感性的影响,并研究其可能的相关机制。运用MTT法分别检测阿霉素（ADM）以及PHI＋ADM对K562／A02细胞的生长抑制率,计算其耐药倍数;用流式细胞仪检测PHI作用前后细胞的凋亡、细胞内ADM浓度的变化和MRPI蛋白变化;分光光度仪测定细胞内还原性谷胱目肽（GSH）的含量;RT—PCR半定量检测PHI作用前后MRP1 mRNA的水平。结果显示,随着PHI浓度的增加,细胞生存率降低;两药联合应用时K562／A02细胞凋亡率均增加;当PHI≥20μmol／L时其耐药倍数有显著差异（P〈0．05）,两种细胞内ADM浓度增加亦有显著差异（P〈0．05）。单独运用1μg/ml ADM时K562／A02细胞内的GsH含量下降5％,单独运用PHI时K562／A02细胞内的GSH含量随着PHI浓度的增加先是轻度升高尔后下降,GSH含量下降点约在10μmoL／L;当PHI≥20μmol/L与1μg／ml ADM联合应用时,K562／A02细胞内的GSH含量随着PHI浓度的升高而进行性下降;而不同浓度的PHI的作用前后,两种细胞的MRP1的表达无论是蛋白水平还是基因水平都无显著差异（P〉0．05）。结论：PHI对K562／A02细胞的细胞毒作用与细胞内GSH耗竭无直接关系,PHI不但可以增强K562／A02细胞对ADM的敏感性,而且通过耗竭细胞内GSH部分地逆转K562／A02细胞对ADM的耐药。联合使用PHI可减少ADM的用量,从而降低其毒副作用。     

汉防己甲素联合伊马替尼对K562／G01细胞诱导凋亡作用及其相关机制

本研究探讨伊马替尼（imatinib,IM）和汉防己甲素（tetrandrine,Tet）单用和联合应用对K562／G01细胞的凋亡诱导作用及其可能机制。应用M1fr法检测IM和Tet单用及联合用药对细胞增殖抑制的作用,用流式细胞术（FCM）检测细胞周期和凋亡率,用实时荧光定量PCR检测caspase-3、BCL-2mRNA的表达,应用Westernblot分析caspase-3、BCL-2蛋白的表达情况。结果表明,1．0μmol／LIM和／或1．5μmol／L Tet单用及联合作用于K562／G01细胞48h后,对细胞增殖的抑制率分别是（22．74±0．05）％、（20．34±0．57）％、（44．28±0．60）％,两药联合应用较单药抑制作用明显。流式细胞术检测显示,Tet作用后细胞向G,／s期转化;Tet1．5μmol／L、3μmol／L与1．0μmol／LIM联合应用48h的早期凋亡率分别为（7．81±0．16）％、（14．10±0．28）％,诱导凋亡作用比单药组明显增加。FQ—PCR和Westernblot检测均显示单独应用Tet和IM后caspase-3表达上调,BCL-2表达下调,联合用药组作用更显著。结论：单独应用Tet对K562／G01细胞有诱导凋亡的作用,两药联合应用具有明显的协同效应,且具有时间和剂量依赖性,其机制可能与上调caspase-3mRNA及其蛋白表达和下调BCL-2mRNA及其蛋白的表达有关。     

HMGB1基因沉默对阿霉素诱导K562/A02细胞凋亡增敏作用的研究

目的 探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因沉默对白血病细胞耐药逆转的作用.方法 将HMGB1基因特异性干扰RNA(HMGB1 siRNA)导入K562/A02细胞中,通过Western blot和RTPCR方法检测HMGB1基因在转染前后的表达;WST8法检测阿霉素(ADM)对转染前后K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术检测凋亡细胞百分率;Western blot检测线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO的释放;采用caspase活性定量检测试剂盒分析caspase-3的活性.结果 ①与未经处理的K562/A02细胞组相比,转染HMGB1 siRNA的K562/A02细胞组HMGB1 mRNA和蛋白水平分别下降86%和71%;②HMGB1基因沉默使K562/A02细胞对ADM的药物敏感性增强,其IC50值从转染前的(4.83±0.08)μg/ml降低到(1.33±0.10)μg/ml,并在ADM浓度为1μg/ml和5μg/ml时,细胞凋亡百分率分别增加27%、32%;③HMGB1基因沉默可促进ADM所致Smac/DIABLO从线粒体向胞浆释放,并增加caspase-3的活性.结论 HMGB1基因沉默能明显增加K562/A02细胞对ADM的敏感性,逆转K562/A02细胞对ADM耐药.     

HO-1基因表达对伊马替尼耐药的慢性髓系白血病细胞增殖的影响

目的 通过氯高血红素(Hemin)诱导伊马替尼耐药慢性髓系白血病(CML)细胞株K562/A02-IM 中血红素加氧酶-1(HO-1)基因表达,探讨HO-1基因对伊马替尼耐药CML细胞增殖的影响,为治疗CML多药耐药及新药的开发提供思路和实验依据.方法 采用RT-PCR法检测20例CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞中HO-1基因的表达,半定量RT-PCR法和Western blot法分别检测不同剂量Hemin处理K562/A02-IM细胞不同时间后HO-1的表达,通过Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况,采用MTT法检测Hemin诱导及锌原卟啉抑制HO-1表达与细胞存活率的关系.结果 RT-PCR结果显示耐药患者骨髓细胞中HO-1基因阳性表达,半定量RT-PCR和Western blot法显示,不同浓度的Hemin(0、10、20及40 μmol/L)处理K562/A02-IM细胞16 h后,HO-1的表达量随Hemin浓度的升高而增加,存在剂量依赖关系,而20 μmol/L Hemin分别处理K562/A02-IM细胞0、8、16、24 h后,HO-1的表达肇在处理16 h组最高.Annexin V/PI法检测显示,0、10、20及40 μmol/L Hemin作用于K562/A02-IM细胞16 h后细胞凋亡率分别为(17.61±0.01)%、(12.13±0.11)%、(7.94±0.03)%和(4.62±0.15)%,其抗凋亡的作用呈剂量依赖性;20 μmol/L Hemin作用K562/A02-IM细胞8、16及24 h的细胞凋亡率分别为(14.72±0.05)%、(8.15±0.07)%和(16.37±0.13)%.MTT法检测显示与对照组相比,Hemin诱导K562/A02-IM细胞HO-1基因表达促进了细胞的增殖,且作用存在剂量依赖关系;而锌原卟啉抑制HO-1的表达,促进了细胞的凋亡(P<0.05).结论 CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞HO-1基因阳性表达,HO-1 是一种可诱导表达型基因,具有抗细胞凋亡及促进细胞增殖的作用,抑制HO-1 表达可能成为治疗CML耐药的新方法.

Abstract：

Objective To investigate the effect of heme oxygenase-1 (HO-1 ) expression on cell growth and apoptosis in imatinib resistant chronic myeloid leukemia (CML) cells ( K562/A02-IM) , and explore the relationship between HO-1 gene and CML. Methods The expression of HO-1 in 20 drug-resistant CML patients was detected by RT-PCR. Different concentrations of hemin were used to induce HO-1 expression of K562/A02-IM, HO-1 expression at different time was detected by RT-PCR and Western blot analysis. Cell apoptosis was detected by Annexin V/PI staining, and MTT assay was used to detect viability of K562/ A02-IM cells after induction or inhibition of HO-1 gene by hemin and zinc protoporphyrin (ZPP). Results RT-PCR showed that HO-1 was expressed in the bone marrow mononuclear cells (BMMNCs). When treated with hemin at different concentrations (0, 10, 20, 40 μmol/L) for 16 h, the expression of HO-1 in K562/ A02-IM was increased in a dose-dependent manner, and peaked at 20 μmol/L of hemin for 16 h. The apoptosis rates were (17.61 ±0.01)%, (12. 13 ±0.11)%, (7.94 ±0.03)% and (4.62 ±0. 15)% at 0,10, 20 and 40 μmol/L of hemin respectively for 16 h and were (14. 7 ± 0.05) % , (8. 1 ± 0. 07) % and (16. 3 ± 0. 13)% at 20 μmol/L of hemin treatment for 8,16, and 24 h respectively. Hemin induced apoptosis of K562/A02-IM cells in a dose-dependent manner. The expression of HO-1 was induced in K562/A02-IM cells in a dose-dependent manner, and the survival of K562/A02-IM cells was significantly increased as compared to that of control group. When HO-1 was inhibited by ZPP, the cells survival was sharply decreased compared to that of the control group (P<0.05). Conclusion HO-1 was expressed in the BMMNCs. It is a kind of molecules whose expression can be induced and can promote the growth of drug-resistant cells. Inhibition of HO-1 expression probably be used for the treatment of drug-resistant CML.