博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立

目的：建立博尔纳病病毒(BDV)荧光定量套式RT-PCR检测方法，为快速、准确地定量检测BDV奠定基础。方法：根据BDV P24基因序列，设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的BDV P24基因片段克隆入载体，重组质粒经筛选、鉴定后，作为阳性模板，用于标准曲线的制定和样品检测。结果：应用量组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板具有良好的线性关系，相关系数为0．998，建立了检测BDV的荧光定量套式RT-PCR方法。检测58例神经精神病患者及50例健康人外周血单核细胞(PBMC)中BDV P24基因片段，3例精神分裂症及1例帕金森病患者呈阳性，其余均为阴性。结论：荧光定量套式RT-PCR方法能够避免PCR后处理导致的假阳性污染，并实现准确定量，对于研究BDV感染与人类神经精神疾病的关系有很好的应用价值。     

病毒性脑炎的诊断及博尔纳病病毒p24基因片段的检测

目的 探讨脑脊液(CSF)、脑电图(EEG)、MRI对于病毒性脑炎的诊断价值,并检测病毒性脑炎患者外周血单个核细胞(PSMCs)中博尔纳病病毒(BDV)p24基因片段,探讨病毒性脑炎与BDV感染的关系.方法 回顾性分析病毒性脑炎患者的CSF、EEG、MRI的阳性检出率并进行比较,用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法检测病毒性脑炎患者及对照者PBMCs中BDVp24基因片段,并总结阳性患者的临床特征.结果 CSF、EEG、MRI检查结果比较,CSF高于MRI检查结果阳性率(x2=9.6,P＜0.01);CSF高于EEG检查结果阳性率(x2=7.58,P＜0.01);MRI检查阳性率高于EEG(x2=5.82,P＜0.01).PBMCs中BDVp24基因片段检测结果显示实验组4例阳性,对照组均为阴性.4例BDVp24基因片段阳性患者主要以发热、头痛、颅内压增高症状为主.结论 脑脊液、MRI对病毒性脑炎的诊断价值优于EEG,部分病毒性脑炎的发生与BDV感染有关,主要以发热、头痛、颅内压增高为临床特征.     

博尔纳病病毒荧光定量PCR试剂盒扩增缓冲液的优化

目的 选择并优化博尔纳病病毒荧光定量PCR TaqMan探针法反应体系中的扩增缓冲液,使PCR反应体系对该病毒p24模板基因的扩增效率得到明显提高.方法 通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基...     

逆转录原位PCR检测博尔纳病病毒感染

目的:建立逆转录原位PCR检测博尔纳病病毒(BDV)的方法,并与其它检测方法进行比较.方法:构建包含BDV GFP-P24质粒的模拟BDV感染的OL细胞模型,检测其核酸的表达.对构建的OL细胞模型和各种阴性对照进行逆转录原位PCR的检测.使用逆转录原位PCR、荧光定量PCR和ELISA对BDV阳性的人和动物样本及阴性对照进行检测,并比较检测结果.结果:成功构建了含BDV-GFP-P24质粒模拟BDV感染的OL细胞.建立了逆转录原位PCR检测BDV的方法;对荧光定量PCR和ELISA的检测呈阳性的4个病例和检测呈阴性的10个病例,使用原位PCR检测可以得到基本一致的结果.结论:逆转录原位PCR原位可以用于检测人和动物的BDV感染和BDV感染机制研究.     

宁夏地区牛脑组织博尔纳病病毒的感染状况

目的 分析宁夏地区牛脑组织博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)的感染状况,探讨阳性基因扩增片段与德国马源性标准病毒株He/80同源性.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)分别检测宁夏地区145例健康牛脑组织中BDVp40、BDVp24基因片段,对BDVp24阳性扩增产物进行基因序列测定,并应用BLAST和DNAsist 5.0软件对测序结果进行分析.结果 145例牛脑组织中4例BDVp40、BDVp24均阳性,阳性率为2.759%,且阳性BDVp24片段的核苷酸序列与He/80同源性最高,所编码氨基酸序列相同.结论 宁夏地区牛脑组织中可能存在动物源性BDV的自然感染,阳性BDV p24核苷酸序列与He/80具有高度同源性,所编码的氨基酸序列相同.     

实时荧光RT-PCR对SARS患者血清中病毒含量的定量检测

目的:阐述SARS患者病程与血清中SARS病毒含量间的关系.方法:采用高灵敏度荧光实时定量RT-PCR方法,对156份SARS患者进行检测,同时,以9.4×109copies/L(Robert Koch Institute)灭活的SARS冠状病毒为定量标准品,病毒样颗粒为阳性对照,分析SARS-CoV阳性血清样本中的病毒含量.结果:检测试剂的灵敏度达1×105copise/L,与相关病原体没有交叉.81份血清样本中病毒含量分布在1×105～1×107copies/L之间,患者血清样本中病毒含量较低,经统计学分析,病毒含量与病程长短无明显数量关系.结论:SARS患者血清中病毒含量低,与病程没有明显的相关性.     

博尔纳病病毒的生物学特点以及检测方法

1博尔纳病病毒概况 远在18世纪末博尔纳病病毒（Borna Disease Virus,BDV）就在德国南部出现散发感染,但是没有正式命名。1895年在萨克森州博尔纳镇突然出现了大量马匹死亡的事件,其中包括了一个骑兵团的军马。     

荧光定量RT-PCR在轮状病毒检测中的应用

目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评价。并将该体系用于临床腹泻样本。结果:该荧光定量RT-PCR体系具有高度灵敏度和特异性,线性范围宽,最低可检出1TCID50/ml。对113份临床腹泻样本的平行检测结果显示,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率差异无统计学意义(χ2=0.41,P>0.5),可同样用于临床样本检测。结论:成功建立了轮状病毒荧光定量RT-PCR体系,该体系灵敏、特异、重复性好,可用于临床检测。     

宁夏地区黄牛博尔纳病病毒自然感染状况的探讨

目的 了解宁夏地区黄牛博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)的自然感染情况,对检测到的BDV p24基因阳性扩增片段进行核苷酸序列比对,探讨其与国际标准病毒株及其分离株的同源性.方法 采用荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测宁夏地区205例健康牛外周血单个核细胞(PBMCs)BD-Vp24基因片段,并对其中的阳性扩增产物进行基因序列测定,然后应用BLAST软件以及DNAsist 5.0软件对测序结果分析.结果 205例中3例阳性,阳性率为1.5%;该BDVp24片段的核苷酸序列与Strain H3915同源性最高达97.67%,与标准病毒株H1766同源性为96.51%,与Strain V/FR的同源性为95.35%,且它们编码的氨基酸相同.结论 宁夏地区黄牛中存在动物源性BDV的自然感染,该BDV p24核苷酸序列与标准病毒株具有高度同源性.     

风疹病毒RNA Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法及参考标准的建立

目的建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。方法设计引物与探针,优化PCR条件,建立风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法,并制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。结果制备的风疹病毒特异性扩增子参考标准品为503 bp的片断,原液浓度为2.75×109copies/μl,纯度为92%;采用该特异性扩增子参考标准品建立的标准曲线相关系数r为-0.9993（r2=0.9986）,P〈0.001。结论本研究建立的风疹病毒特异性扩增子参考标准品稳定性好,纯度高;特异性扩增子参考标准品浓度的对数值与Ct值之间具有良好的线性关系,证实了本研究建立的风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。因而,建立的风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法简便快捷、定量准确,可用于临床标本中风疹病毒RNA的定量检测。     

双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用

目的 建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法.方法 设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价.收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测,并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较.结果 双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998;该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL;检测EV和EV71的批内精密度均小于3％,总精密度均小于或等于4％;对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性.109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本,其中EV71阳性56例,EV71总阳性率为51.4％;与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000).结论 建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好,对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义.     

札如病毒实时荧光RT-PCR的建立与应用

目的 建立一种可快速、全面、准确检测人感染札如病毒的TaqMan探针荧光实时RT-PCR方法。方法 利用Bioedit2.0、MAGE6.0软件对可感染人的GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤ基因群札如病毒进行保守序列比对,应用Primer6.0、Primer Express 3.0进行引物和TaqMan探针的设计与评价,分别设计了两套引物及TaqMan探针,克隆相应靶基因并构建阳性标准品,建立及优化一步法实时荧光RT-PCR反应体系,并进行灵敏度、特异度、临床标本验证试验。结果 根据基因序列比对分析,札如病毒ORF1与ORF2连接区具有相对高保守序列,针对GⅠ、GⅡ、GⅣ及GⅤ设计了一条共用的下游引物、以及两套上游引物和TaqMan探针,能覆盖当前GenBank可见的感染人的札如病毒基因型,在同一反应管中建立了同时检测札如病毒四个基因群的实时荧光RT-PCR,并可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ进行初步分型,对人柯萨奇病毒、诺如病毒、轮状病毒、腺病毒等非靶标病原体无扩增,仅对札如病毒有特异扩增,最低检测下限为10拷贝/反应。结论 本研究建立了札如病毒一步法实时荧光RT-PCR反应体系,可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ区分开来,为腹泻疫情防控和风险评估提供快速、准确的病原学依据。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与传统的血凝抑制法进行比较。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2.56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.999,扩增效率为108.5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法只有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究

目的 建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型.方法 选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针,评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限;并对20份阳性样本进行检测.结果 20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性.梯度检测的变异系数均小于5％.对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测最低检测限达103 copies/ml.结论 本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定.     

3种HBV DNA荧光定量PCR试剂检测结果比较

目的 比较及评价3种HBV-DNA荧光定量PCR试剂检测结果的差异.方法 同时用3种HBV-DNA荧光定量PCR试剂对已知结果的质控血清、标准品及本院79份HBsAg阳性的临床标本进行检测,并对检测结果进行比较分析.结果 试剂A、B、C检测阳性率分别为41.77%(33例)、45.57%(36例)和41.77%(33例).3种方法结果一致者66例,总符合率83.54%.试剂A、B与试剂C检测结果相比差异有统计学意义(P<0.05),试剂A与B检测结果相比差异无统计学意义(P>0.05).试剂A与C的灵敏度、特异性均为77.78%、88.37%;试剂B灵敏度为89.66%、特异性80.00%.结论 试剂A与B总体性能优于试剂C,适于临床检测与筛查.实验室必须选择质量好且符合自己实验室要求、与本实验室仪器相匹配的试剂以保证检验质量.     

实时定量PCR检测BK病毒时尿样本的优化处理

目的建立简便有效的样本处理方法,提高实时荧光定量PCR法检测尿液中BK病毒载量的敏感性和准确性。方法任意选择24例BK病毒阳性样本,每一样本进行4种不同的处理:原尿、原尿病毒DNA提纯、1:10稀释尿液、1:100稀释尿液,实时荧光定量PCR法检测各组样本BK病毒载量,所测数据用SPSS11.0进行统计学分析。结果4种不同的处理方法对实时荧光定量PCR法检测尿液中BK病毒载量有明显的影响:原尿阴性3例,病毒载量在4组中的最低值占66.7%;1:100稀释尿阴性2例,病毒载量在4组中的最高值占79.2%,但中位值和1:10稀释组差异无统计学意义;DNA纯化组与1:10稀释尿液病毒检出率相当,均为100%,但DNA纯化组目标基因的流失量较明显。结论在临床尿液中BK病毒载量检测时,1:10稀释尿在实时荧光定量PCR检测BK病毒时DNA损失小,效率高,且处理过程简便、成本低,是一种较好的尿样本处理方法。     

热带假丝酵母菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用初步评价

目的建立、优化快速检测临床标本中热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法 ,并对其临床应用进行初步评价。方法用自行设计的高效引物、探针检测5种临床标本中的热带假丝酵母菌,对该方法的敏感性、特异性进行评价,并与真菌培养法进行比较。结果检测临床标本中热带假丝酵母菌的灵敏度可达10 copies/ml,与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。与真菌培养法的检测一致性好(Kappa值为0.916,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR检测热带假丝酵母菌灵敏度高、特异性强,可直接用于各种临床标本中热带假丝酵母菌的检测,而且可大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据。