小檗碱对脂肪细胞葡萄糖转运的影响及其机制研究

目的 观察小檗碱对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运的影响，并探讨其机制。方法 以葡萄糖氧化酶法检测细胞的葡萄糖消耗量，以2-脱氧-^3H-D-葡萄糖摄入法观察葡萄糖的转运率，以免疫共沉淀和蛋白免疫印迹检测蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)活性，以Northern印迹检测c-Cbl相关蛋白(CAP)mRNA的表达。结果 0．1-200μmol／L小檗碱显著增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗，呈剂量依赖效应，其作用不需要胰岛素的存在；0．1～10μmol／L小檗碱显著增加脂肪细胞的葡萄糖转运，在其作用2h后，葡萄糖转运即显著增加，至12h时，其作用趋近最大；免疫共沉淀和蛋白免疫印迹结果显示，小檗碱并未增强Akt激酶活性；Northern印迹结果显示，小檗碱明显降低CAP mRNA的表达。结论 脂肪细胞是小檗碱的重要靶细胞，小檗碱显著增加脂肪细胞的葡萄糖转运和消耗，可能并非通过已知的胰岛素信号转导途径。     

非诺贝特和TNF-α对3T3-L1脂肪细胞内脂素表达的影响

目的 研究非诺贝特和肿瘤坏死因子α(TNF-α)对3T3-L1脂肪细胞内脂素(Visfatin)表达的影响.方法 分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,用不同终浓度非诺贝特(0、50、100、200 μmol/L)刺激48 h;用100 μmol/L非诺贝特刺激不同时间(0、12、24、48 h);用10 ng/ml TNF-α和10 ng/ml TNF-α加100 μmol/L非诺贝特联合刺激48 h.使用半定量RT-PCR法检测3T3-L1脂肪细胞Visfatin mRNA的表达.结果 Visfatin mRNA表达随非诺贝特浓度增加、作用时间延长而增加;TNF-α作用48 h后Visfatin mRNA表达量减少(P<0.05),联用非诺贝特组高于TNF-α组(P<0.01).结论 非诺贝特能促进3T3-L1脂肪细胞Visfatin表达,这可能是其改善胰岛素抵抗的机制之一.     

持续激活的Akt减少了 3T3-L1脂肪细胞脂联素蛋白的表达

目的 研究蛋白激酶B（Akt／PKB）的持续激活与灭活对3T3-L1脂肪细胞内脂联素蛋白表达的影响。方法 通过腺病毒表达系统将持续激活的Akt（myrAkt）和无酶活性的Akt（Akt-AA）导入3T3-L1脂肪细胞内，应用免疫印迹法检测3T3-L1脂肪细胞脂联素蛋白的表达。结果 表达myrAkt的3T3-L1脂肪细胞中脂联素明显减少，表达Akt-AA的3T3-L1脂肪细胞中脂联素无明显变化。结论Akt的激活抑制了3T3-L1脂肪细胞中脂联素蛋白的表达，且Akt的激活是影响脂联素的充分条件，而不是必要条件。     

内脂素通过过氧化体增殖物激活型受体γ信号转导通路上调酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1的表达

目的观察过氧化体增殖物激活型受体γ信号转导通路在内脂素调控人THP-1单核细胞源性巨噬细胞酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1表达中的作用,探讨内脂素诱导泡沫细胞形成的机制和途径。方法 THP-1单核细胞诱导分化为巨噬细胞,随机分组,给予不同浓度的内脂素和过氧化体增殖物激活型受体γ激动剂罗格列酮进行干预,分别运用油红O染色法观察细胞内脂滴形成情况,逆转录聚合酶链反应法和免疫印迹法检测细胞过氧化体增殖物激活型受体γ和酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1mRNA和蛋白的表达,酶荧光学法检测细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量,总胆固醇与游离胆固醇之差为胆固醇酯含量。结果与对照组比较,内脂素组细胞内脂滴形成增加,过氧化体增殖物激活型受体γmRNA和蛋白表达水平降低(P0.05),酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1mRNA和蛋白表达水平升高(P0.05),细胞内胆固醇酯含量升高(P0.05);随着内脂素浓度(10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L)升高,过氧化体增殖物激活型受体γmRNA和蛋白表达水平逐渐降低(r值分别为-0.73和-0.83,P0.05),酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1mRNA和蛋白表达水平逐渐升高(r值分别为0.91和0.72,P0.05)。与内脂素组比较,罗格列酮组酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1mRNA和蛋白表达水平降低(P0.05),细胞内胆固醇酯含量降低(P0.05);随着罗格列酮浓度(10μmol/L、15μmol/L和20μmol/L)升高,酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1mRNA和蛋白表达水平逐渐降低(r值分别为-0.69和-0.84,P0.05)。结论内脂素呈浓度依赖性下调THP-1单核细胞源性巨噬细胞过氧化体增殖物激活型受体γ的表达,上调酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1的表达,而罗格列酮呈浓度依赖性抑制内脂素所诱导的上述效应。提示内脂素可能通过过氧化体增殖物激活型受体γ信号转导通路上调酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1表达,使细胞内胆固醇酯合成增加,从而诱导泡沫细胞形成。     

吡格列酮对不同浓度脂肪酸培养HepG2细胞脂联素受体1和受体2mRNA表达的影响

目的探讨肝细胞脂联素受体在噻唑烷二酮类药物改善胰岛素敏感性中所起的作用。方法孵育48h的HepG2细胞随机均分为对照组、吡格列酮组、3组不同浓度（100、200、400μmol／L）饱和脂肪酸（PA）培养组和3组相应浓度PA＋吡格列酮（PGT）处理组。继续培养24h后，提取总RNA，使用RT-PCR半定量分析脂联素受体mRNA表达的改变。结果与对照组相比，PA组脂联素受体2（R2）mRNA的表达下降，当PA的浓度加至200μmol／L以上时，R2 mRNA表达的下降呈现明显差异（P〈0．01）。在PA＋PGT的各组中，R2 mRNA的表达均较同PA浓度组增高，尤其是在PA浓度大于200μmol／L时（P〈0．05或P〈0．01）。结论R2很可能是胰岛素增敏剂吡格列酮改善肝脏胰岛素敏感性的重要作用机制之一。     

肾上腺素和葡萄糖对3T3-L1脂肪细胞水孔蛋白mRNA表达的影响

目的：通过细胞培养研究肾上腺素、葡萄糖对成熟脂肪细胞水孔蛋白（aquaporin adipose,AQPap）基因表达的影响。了解AQPap基因表达的影响因素，探讨其在肥胖及糖尿病发病中所起作用。方法：用不同浓度（10^-6mol/L、10^－7mol/L、10^-8mol/L、10^-9mol/L）的肾上腺素刺激诱导分化第9天的3T3－L1细胞6h，另以不同浓度的葡萄糖（5．6mmol/L、11．2mmol/L、16．8mmol/L、33．6mmol/L）刺激细胞48h。提取细胞RNA。运用半定量RT－PCR技术检测AQPap mRNA表达量的变化。结果：与对照组相比，给予不同浓度的肾上腺素刺激分化成熟的3T3－L1细胞，其AQPap mRNA的表达量变化，差异无显著性意义（P＞0．05）。 葡萄糖浓度的升高使培养细胞AQPap mRNA的表达量显著增强（P＜0．05，16．8mmol/L葡萄糖刺激培养细胞48h,AQPap mRNA表达量约是对照组（葡萄糖浓度为5．6mmol/L）的3倍。结论：肾上腺素是一种脂解激素，它对脂肪细胞AQPap mRNA的表达无影响；高糖状态下AQPap mRNA表达明显增强。     

非诺贝特对兔脂联素基因和蛋白表达的影响

目的观察非诺贝特对培养的兔脂肪细胞分泌脂联素的影响,并探讨其可能机制。方法取兔腹股沟皮下脂肪组织行脂肪细胞培养,将含不同终浓度[0(对照组)、1、10、50、100μmol/L]非诺贝特的培养液与定量培养的兔脂肪细胞在培养箱中孵育24h,另将终浓度为50μmol/L非诺贝特的培养液与定量培养的兔脂肪细胞分别作用0、4、8、12、24h。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脂肪细胞培养液中脂联素蛋白水平,用半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)测定脂肪细胞脂联素mRNA的表达。结果①1μmol/L及10μmol/L非诺贝特作用24h对脂肪细胞脂联素mRNA及蛋白表达均无影响。而50μmol/L非诺贝特对脂肪细胞脂联素mRNA及蛋白表达呈促进作用,与对照组相比,脂联素mRNA的表达上升32.8%,蛋白的分泌上升24.3%。100μmol/L非诺贝特作用24h使脂肪细胞脂联素mRNA的表达上升58.5%,蛋白的分泌上升33.9%。②50μmol/L非诺贝特作用4h及8h对脂肪细胞脂联素基因及蛋白表达无影响,作用12h促进脂联素mRNA的表达及蛋白的分泌,与对照组相比mRNA的表达上升27.1%,蛋白含量上升23.1%。50μmol/L非诺贝特作用24h,脂肪细胞脂联素mRNA的表达升高35.7%,蛋白的分泌升高32.1%。结论非诺贝特对脂肪细胞脂联素基因表达及蛋白的分泌有促进作用,与剂量和作用时间呈正相关。     

小檗碱对3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型PI-3K p85蛋白表达的影响

目的:研究小檗碱对3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型PI-3K p85蛋白表达的影响,探讨小檗碱改善胰岛素抵抗的分子机制.方法:分别以0.5 mmol/L软脂酸与25 mmol/L葡萄糖加0.6 nmmol/L胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗,予以小檗碱进行干预,同时以阿司匹林作为阳性对照,以2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖摄入法观察葡萄糖的转运率,用Western blot检测PI-3K p85蛋白的表达.结果:0.5 mmol/L软脂酸作用24 h或25 mmol/L葡萄糖加0.6 nmmol/L胰岛素作用18 h分别使3T3-L1脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖转运抑制67%和60%,Westem blot显示PI-3K p85蛋白表达减少,与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01);同时加入小檗碱则可逆转上述效应使P1-3K p85蛋白表达增加,与模型组比较有明显差异(P<0.01),并且PI-3K p85蛋白的表达与小檗碱的剂量和作用时间呈依赖关系.结论:小檗碱可以明显改善游离脂肪酸和高糖诱导的胰岛素抵抗,其分子机制可能与小檗碱提高PI-3K p85蛋白的表达有关.     

RNA干扰技术沉默脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因对脂肪细胞合成甘油三酯及分泌内脂素的影响

目的观察RNA干扰技术沉默脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因后,脂肪细胞甘油三酯合成及内脂素分泌的变化。方法将3T3-L1前脂肪细胞采用体外诱导分化为脂肪细胞,将脂肪细胞与0～1 mmol/L不同浓度脂肪酸共孵育后,测定其甘油三酯及内脂素的浓度。构建针对脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因的微小RNA质粒表达载体,将上述载体转染3T3-L1脂肪细胞,用逆转录聚合酶链反应和Western blot检测脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因及蛋白的表达,将0.5 mmol/L脂肪酸与沉默前后的脂肪细胞共孵育24 h,用逆转录聚合酶链反应检测脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因沉默前后脂肪细胞内脂素mRNA表达的变化,并测定其甘油三酯及内脂素浓度的变化。结果随着脂肪酸浓度的增高,与其共孵育的脂肪细胞内甘油三酯浓度也随着增加(P<0.05),其分泌的内脂素浓度也随着增加(P<0.05);构建脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白微小RNA质粒载体,转染脂肪细胞后,能显著抑制脂肪细胞内脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的mRNA及蛋白表达水平(P<0.05);沉默脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因后脂肪细胞内甘油三酯浓度明显低于沉默前(P<0.05),其分泌的内脂素浓度也明显低于...     

胆固醇过负荷对脂肪细胞分泌内脂素的影响及其机制

3T3-L1细胞促分化成熟后,分别以酯酰辅酶A胆固醇酯酰转移酶(ACAT)抑制剂(2μg/ml)和不同浓度(0、25、50、75和100 μg/ml)的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)干预48 h,ACAT抑制剂(2μg/ml)和ox-LDL( 50 μg/ml)干预0、6、18、36和48 h,ACAT抑制剂(2μg/ml)、ox-LDL( 50 μg/ml)和不同浓度(0、100、200和400 μmol/L)的牛磺酸熊去氧胆酸(TUDCA)干预48 h.用ELISA法检测细胞上清内脂素的水平,Western印迹法检测脂肪细胞总蛋白GRP78和CHOP表达.ACAT抑制剂和不同浓度的ox-LDL干预脂肪细胞48 h后,随着ox-LDL浓度的增加,脂肪细胞内胆固醇浓度、GRP78和CHOP蛋白表达及内脂素水平显著升高,实验组与空白对照组比较,差异均具有统计学意义(均P＜0.05);ACAT抑制剂和ox-LDL干预后,随干预时间的延长,脂肪细胞GRP78、CHOP蛋白表达及内脂素水平均显著升高,实验组与空白对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05);ACAT抑制剂、ox-LDL和不同浓度TUDCA干预48 h后,脂肪细胞GRP78及CHOP蛋白表达水平及内脂素水平逐渐降低,实验组(200和400 μmol/L)与空白对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).脂肪细胞胆固醇负荷增加可促进脂肪细胞分泌内脂素,其机制可能与脂肪细胞的内质网应激增强有关.     

HB F-Yamaguchi (γ75THR, γ80ASN, γ136ALA) is associated with Gγ-thalassemia

Restriction endonuclease analyses of DNA from a known Hb F-Yamaguchi heterozygote and three of his relatives have shown a deletion of about 5 kb, which includes one of the γ genes. This abnormality is similar to the ^Gγ-thalassemia described recently [4] and is probably caused by an unequal crossing over between -^Gγ- and -^Aγ^T-genes. The abnormal -^Gγ^Aγ^T-X- (X = Asp→Asn at γ80) hybrid gene produces the γ-Yamaguchi chain at a level usually seen for ^Gγ chains only.     

Genetic factors involved in human Gγ and Aγ globin gene expression

Gγ to Aγ globin ratios, haplotypes at the β globin gene cluster and the C →T substitution at -158 5′ to the Gγ globin gene were studied in three Algerian families that include SS or S-β°thal patients. Gγ to Aγ ratios were found similar, within a family, in subjects displaying the same combination of chromosomes 11, the ratio observed for a given combination depending on the chromosome haplotypes. Our data can be explained by the existence of several alleles of a genetic factor closely linked to the β globin gene cluster and involved in the determination of Gγ to Aγ globin ratio.     

Peripheral T cell receptors αβ and γδ in patients with Hodgkin's lymphoma

Antigen recognition by T cells is determined by an antigen specific T cell receptor (TCR). Two heterodimeric TCR structures associated with CD3 have been defined: TCR αβ and TCR γδ. TCR αβ and its function are well described but the role of TCR γδ in normal and lymphoproliferative disorders is not well established. In newly diagnosed or relapsed/refractory Hodgkin's disease (HD), a disease associated with defective T cell functions and increased sIL-2R, We determined levels of seven TCR αβ variable regions [βV5(a), βV5(b), βV6(a), βV12(a), αβV(a), αV2(a)] and TCR γδ by using monoclonal antibodies (MCA). TCR γδ levels did not show any difference, but several variable regions of the TCR αβ differed when groups are compared with each other and the control group.     

甲状腺功能异常患者末梢血淋巴细胞T3核受体基因表达

为了解甲状腺功能异常患者末梢血淋巴细胞Ｔ３核受体基因表达情况，以人ｃ－ｅｒｂＡα和ｃ－ｅｒｂＡβ的ｃＤＮＡ片段为探针，应用分子杂交技术，检测了５例Ｇｒａｖｅｓ病和７例桥本甲状腺炎伴甲状腺功能减退患者末梢血淋巴细胞ｃ－ｅｒｂＡα和ｃ－ｅｒｂＡβｍＲＮＡ的相对含量。结果表明：人淋巴细胞ｃ－ｅｒｂＡαｍＲＮＡ有６．０ｋｂ和３．２ｋｂ两种形式，而ｃ－ｅｒｂＡβｍＲＮＡ有５．０、３．０和２．０ｋｂ三种形式。桥本甲状腺炎伴甲状腺功能减退患者末梢血淋巴细胞ｃ－ｅｒｂＡα和ｃ－ｅｒｂＡβｍＲＮＡ表达增强，但Ｇｒａｖｅｓ病患者无明显变化。提示：桥本甲状腺炎伴甲状腺功能减退患者血清甲状腺激素水平减低，对其末梢血淋巴细胞Ｔ３核受体亚型在基因转录水平有向上调节作用。     

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的　探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法　用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果　免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论　重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3疫苗免疫保护性的观察

目的　研究日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白1433(rSj1433)作为血吸虫病疫苗分子的潜能,并探讨rSj1433、rSjGST两种重组蛋白作为疫苗的协同作用及结核杆菌低分子量耐热多肽(Mtb)激活的γδT细胞在抗血吸虫病中的作用。　方法　用SDSPAGE、电洗脱和透析的方法制备rSj1433和rSjGST抗原,将两种抗原(分别用福氏佐剂和Mtb为佐剂)分别免疫BALB/c小鼠后,进行尾蚴攻击感染实验。在攻击感染6wk后,剖杀小鼠计算各组的减虫率。　结果　各组的减虫率为rSj1433+福氏佐剂组32.20%,rSj1433+rSjGST+福氏佐剂组31.10%,rSj1433+Mtb佐剂组27.96%,rSj1433+rSjGST+Mtb佐剂组26.00%,rSjGST+Mtb佐剂组27.10%;各组的减卵率分别为(按以上组序)50.40%、53.30%、51.10%、58.60%和51.30%。　结论　rSj1433具有一定的抗血吸虫潜能,有可能成为抗日本血吸虫疫苗,但未见rSj1433和rSjGST的协同作用;Mtb激活扩增的γδT细胞在抗血吸虫免疫中的效果与福氏佐剂产生的免疫作用类似。     

人参皂甙-Rg_3、-Rb_3抗病毒作用的研究

目的　观察人参皂甙 - Rg3、- Rb3抗病毒的活性。方法　在 FL细胞中扩增病毒 ,进行 TCID5 0 滴定 ,采用细胞病变抑制效应 (CPE)的测定法观察药物的抗病毒作用。结果　 0 .1 2 5～ 4.0μg/ ml浓度的人参皂甙 - Rg3因浓度不同可以以不同方式抑制 HSV- 1和 Polio V致 CPE发生 ;1 56.2～ 2 50μg/ ml浓度的人参皂甙 - Rb3因浓度不同可以不同方式抑制 HSV- 1和 VSV致 CPE发生。结论　人参皂甙 - Rg3具有抗 HSV- 1和 Poli 活性 ,人参皂甙 - Rb3具有抗 HSV- 1和 VSV活性     

Tγ Cell Deficiency in Idiopathic Thrombocytopenic Purpura (ITP)

A significant reduction in the proportion and absolute number of circulating T_γ (suppressor) lymphocytes was observed in 15 adult patients with idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). The proportion of T_γ cells was also reduced in the spleen of four patients so investigated. This abnormality was not seen in 5 patients cured by splenectomy whilst it persisted in 3 who remained thrombocytopenic after splenectomy. The proportion of Tμ (helper) lymphocytes in ITP was normal. These findings, similar to those reported in systemic lupus erythematosus, suggest that an inbalance of the immunoregulatory T-cell subsets may be important in the pathogenesis of ITP.     

脂肪因子补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白3对胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号通路影响的研究

目的 观察脂肪因子补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白3(CTRP3)对IR的3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号通路的影响. 方法 以软脂酸培养构建IR的3T3-L1脂肪细胞模型,分为对照组、CTRP3(10、50、250 ng/ml)干预组及CTRP3(250 ng/ml)+渥曼青霉素(Wortmannin)[磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂]干预组.以葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗量,以Western blot检测PI3K及蛋白激酶B[PKB(ser437)]蛋白相对表达量. 结果 与对照组相比,CTRP3干预组(10、50、250 ng/ml)葡萄糖消耗量分别增加了22.1％、42.9％及76.6％(P均＜0.01),PI3K蛋白相对表达量分别增加了62.5％、100.0％及137.5％(P均＜0.01),PKB(ser437)蛋白相对表达量分别增加了46.4％、160.7％及192.9％(P均＜0.01);与CTRP3(250 ng/ml)干预组相比,CTRP3 (250 ng/ml) +Wortmannin干预组葡萄糖消耗量下降53.2％ (P＜0.01),PI3K及PKB(ser437)蛋白相对表达量分别下降了43.4％及56.1％(P均＜0.01). 结论 脂肪因子CTRP3可能通过改善胰岛素信号转导增加IR的3T3-L1脂肪细胞IS.