粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达纯化粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白,为粪肠球菌心内膜炎的致病机制研究及临床血清学诊断奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增efaA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-efaA重组质粒。经BamhI、XhoI酶切及测序鉴定,将pET30a-efaA质粒转化入BL21(DE3)。以IPTG诱导BL21(DE3)表达efaA融合蛋白,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。结果PCR体外扩增efaA基因产物约943bp,重组表达质粒pET30a-efaA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和层析获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为34kd。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。     

粪肠球菌主要毒力因子研究进展

粪肠球菌为条件性致病菌,是许多国家医院内感染的主要病原菌,也是一种新的人畜共患病病原体。粪肠球菌感染和致死主要是由其毒力因子引起的,本文概述了粪肠球菌主要毒力因子尤其是溶血素的研究进展,为粪肠球菌致病机制的研究奠定基础。     

肠球菌溶血素与其致病力的关系

目的　探讨肠球菌溶血素的毒力因子作用。方法　分别检测 3 9株临床标本分离的粪肠球菌以及 3 1株健康人群粪便分离的粪肠球菌的溶血素检出率 ;并检测了β溶血肠球菌、非 β溶血肠球菌对 9种抗生素的敏感性。 结果　临床菌株的溶血素检出率为 5 8.9% ,健康人群分离株的溶血素检出率为 19.3 % (P <0 .0 0 5 ) ;β溶血株对抗生素的耐药性明显高于非 β溶血株 (P <0 .0 1)。结论　以上结果提示肠球菌溶血素与其毒力有关     

临床分离粪肠球菌和屎肠球菌菌株的检测及耐药性研究

目的分析粪肠球菌、屎肠球菌对抗菌药物的耐药性及敏感性,为合理使用抗菌药物提供证据。方法运用Phonex 100全自动微生物鉴定/药敏系统对临床分离的菌株进行鉴定和药敏试验。结果 103株肠球菌耐药率最高的药物依次为红霉素（94.2%）、环丙沙星（85.4%）、利福平（81.6%）,对万古霉素（94.2%）和替考拉宁（93.2%）的敏感性最高。发现万古霉素耐药的粪肠球菌和屎肠球菌各3株。粪肠球菌和屎肠球菌对青霉素的耐药率分别为22%和71.7%,对氨苄西林的耐药率分别为16.7%和86.8%。结论 肠球菌属总体耐药率较高,红霉素、环丙沙星、利福平对肠球菌的敏感率较低,已检测发现VRE,临床上应加强监测,并根据药敏结果、感染严重程度合理选择适当的抗菌药物。     

牛乳腺炎粪肠球菌溶血素CylA基因编码多肽的理化特性及抗原性分析北大核心CSCD

目的预测和分析牛乳腺炎粪肠球菌溶血素CylA基因的抗原性和相关的理化性质。方法克隆牛乳腺炎粪肠球菌溶血素CylA基因,并在测序基础上利用生物信息软件分析CylA基因编码的多肽抗原可及性及其理化特性。结果成功克隆CylA基因,经测序CylA基因序列序长度为978 bp,与NCBI上公布的CylA序列(JQ794947.1)相似度为99.0%,核苷酸序列有5处出现变异,分别是168位的碱基由T→G,587位碱基由C→T,735位插入碱基C,781位插入碱基G,826位碱基由T→A。利用生物信息学软件分析其理化性质结果显示,该片段多肽相对分子质量为27.5 ku,等电点为4.69,带负电荷残基39个,带正电荷残基26个,分子式为C1213H1920N326O393S3,α螺旋占29.69%,β折叠占9.77%,无规则折叠占37.87%,2~25位氨基酸为跨膜区;具有良好的抗原可及性,从2~8位氨基酸,从92~160位氨基酸区间均匀分布抗原可及性。结论溶血素CylA基因编码多肽具有明显的跨膜分泌特性,丰富的折叠结构和广泛区域的抗原可及性,对相应基因工程疫苗的研制及检测抗原开发具有重要意义。     

粪肠球菌和屎肠球菌的医院感染分布及耐药性

肠球菌广泛存在于自然界,可寄生于人类的胃肠道和女性生殖道,是人和动物肠道正常菌群的一部分,是仅次于葡萄球菌的重要院内感染病原菌[1],较多出现在有严重基础疾病的老年人和免疫力低下的患者中,主要引起尿路、腹腔、盆腔感染,还可引起菌血症、心内膜炎、呼吸系统感染.由于其固有的耐药性,对头孢菌素类、克林霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、低浓度的氨基糖苷类抗生素即使在体外实验可表现出敏感,但临床治疗往往无效[2],所致感染治疗困难.肠球菌属中粪肠球菌和屎肠球菌占临床分离的绝大多数[3].本文就医院感染标本中分离出的粪肠球菌和屎肠球菌的来源和耐药性进行分析,以期为临床治疗肠球菌医院感染提供参考依据.     

肠球菌致病性的初步探讨

对40株从临床病理材料分离的肠球菌作溶血（人血）实验,其中β-溶血菌株占575％。利用1株从保健饮料中分离的肠球菌EFR为指示菌作细菌素检测,对EFR有杀菌作用的菌株比率为72．5％。实验发现这40株肠球菌中含有3种细菌素：a．细菌素／溶血亲;b．对氯位具有抗性的细菌素;c.既不具有β-溶血素的功能,又对氯仿敏感的细菌素。选择10株肠球菌,其中3株为α-溶血,7株为β-溶血,通过精子尾部低渗肿胀实验,检测肠球菌毒力,发现7株β-溶血菌株对人精子膜有显著破坏作用,而β-溶血菌株中,2株对精子膜无破坏作用,1株有破坏作用。上述结果提示,溶血素／细菌素和肠球菌的毒力密切相关,但还有一些其它因素和肠球菌的毒力有关。     

粪肠球菌心内膜抗原efaA基因转化株的构建及其对生物膜形成的影响

目的构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株,探讨efaA基因在肠球菌生物膜形成及感染性心内膜炎致病中的作用。方法PCR扩增粪肠球菌efaA基因,构建pAT28-efaA重组子,经PCR、双酶切及测序鉴定,将重组子转化到eraA野生株S14做为转化株（S14-pAT28-efaA）;同时将空质粒pAT28转化到野生株作为对照株（S14-pAT28）;IPTG诱导efaA表达,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。微量滴定板法测定生物膜形成能力。将s14、S14-pAT28、S14-pAT28-efaA分别接种到96孔板,37℃培养24h形成生物膜,结晶紫染色,测定孔板底部在595nm的0D值,比较efaA基因转化前后的生物膜形成能力。结果成功构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株;转化株的OD595值大于野生株及空质粒转化株,P〈0．05,空质粒转化株的OD595值与野生株比较差异无统计学意义,P〉0．05。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因有利于肠球菌生物膜的形成。     

致鹅败血症粪肠球菌溶血素激活因子基因克隆及序列分析

目的 了解粪肠球菌溶血素激活因子（CylA）基因的遗传变异情况。 方法 根据GenBank上已发表的粪肠球菌CylA基因序列设计2对特异性引物,对临床分离的4株致鹅败血症粪肠球菌CylA基因进行克隆及序列测定,并与国外从人体分离的和国内从猪体分离的各4株致病性粪肠球菌的CylA基因,用DNAStar软件进行同源性比对和构建系统进化发育树。结果 鹅源4株菌CylA基因均长1239bp,有1个完整的开放阅读框,编码412个氨基酸;序列中无缺失和插入,仅有1处未引起其编码氨基酸变异的无义突变。其余8株菌CylA基因及推导的氨基酸变异程度均不大。4株鹅源菌CylA基因推导的氨基酸同源性为100%;与国外人源菌和国内猪源菌CylA基因推导的氨基酸遗传距离也较近,同源性为98.6%～100%。结论 粪肠球菌CylA基因高度保守,有可能成为检测诊断和免疫预防的靶基因。     

单核细胞增生性李斯特菌溶血素基因的原核表达

目的为获得大量的单核细胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lmo）溶血素（Hemolysin，hty）蛋白，以便研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制方面的作用。方法本文应用Primer Premier5．00设计引物，引入13amHI和x幻工酶切位点。以前期合成构建的pMDl8-T-hly质粒为模板，通过PCR方法扩增出Lmo0586株溶血素基因。相应酶切后，克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建pGEX-6p-hly重组质粒，转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达。带有重组质粒pGEX-6p-hly的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE及免疫印记分析。结果PCR体外扩增hly基因产物大小约为1624bp，成功构建了重组表达质粒pGEX-6p—hly；SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为72ku，重组蛋白主要以包涵体形式表达。表达量占菌体总蛋白的20．8％；Western免疫印记表明具有良好的反应原性。结论在国内首次构建重组质粒pGEX-6p-hly，并以融合蛋白的形式进行了高效表达，同时该蛋白具有特异的抗原反应性，为研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制中的作用奠定了基础。     

双曲钩端螺旋体溶血素基因tlyA的克隆、表达及初步功能鉴定

目的研究双曲钩端螺旋体(简称双曲钩体)是否含有溶血素基因,并鉴定其溶血活性。方法对双曲钩体LEBIa2503基因编码产物进行结构域预测、序列比对后,PCR扩增目的片断,克隆到原核表达载体pET28b( ),转化宿主细胞,并诱导表达产物进行初步功能鉴定。同时,以RT-PCR检测LEBIa2503的转录情况。另外,也对双曲钩体菌体本身有无溶血活性进行检测。结果双曲钩体LEBIa2503基因与问号钩体tlyA溶血素基因在蛋白水平上有相同的结构域,属于直系同源基因(orthologues gene)。原核表达的重组融合蛋白在羊血平板上出现β-溶血环。以RT-PCR的方法能检测到在双曲钩体中有LEBIa2503基因的转录,但双曲钩体菌体本身则检测不到溶血活性。结论未发现双曲钩体有溶血活性,但其含有溶血素基因tlyA,并且在普通培养环境下能被转录,这对进一步研究其内在机制奠定了基础,并对探索致病性问号钩体致病机制提供了一定线索。     

迟缓爱德华菌溶血活化蛋白EHA的原核表达及生物学活性

目的研究迟缓爱德华菌(Et)溶血活化基因(eha)原核表达蛋白EHA的生物学特性。方法构建重组载体pET28a+-eha,转入大肠埃希菌BL21,得到克隆子pEHA1。克隆子pEHA1超声破碎后离心,上清用SDS-PAGE电泳分析。在不同条件下,IPTG诱导pEHA1菌表达EHA蛋白,该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,检测其溶血活性及Vero细胞毒性。结果测序结果表明,pET28a+-eha重组质粒的eha序列完全正确。SDS-PAGE电泳显示表达出一条17kDa左右的条带。在30℃,IPTG浓度为0.5mmol/L的情况下,克隆子pEHA1被诱导6h产生的蛋白量最多。纯化的EHA蛋白无溶血活性及Vero细胞毒性。结论eha基因不是溶血素结构基因,可能是一个调控基因。     

粪肠球菌心内膜炎抗原EfaA在生物膜形成中的作用

目的 探讨粪肠球菌心内膜炎抗原EfaA在生物膜形成中的作用。方法 微量滴定板法测定生物膜形成能力,将efaA⁺、efaA^- 粪肠球菌S₁₄、S₁₄-pAT28、S₁₄-pAT28-efaA分别接种到96孔板,37 ℃培养24 h形成生物膜,结晶紫染色,测定孔板底部生物膜的OD₅₇₀ 值;MTT法比较S₁₄、S₁₄-pAT28、S₁₄-pAT28-efaA所形成的生物膜的活菌含量OD₄₉₂;共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察比较efaA⁺、efaA^-肠球菌形成的生物膜的平均厚度、最大厚度。结果 efaA⁺ 转化株在各培养时间点微量滴定板法测定的生物膜形成能力OD₅₇₀ 值、MTT法测定的OD₄₉₂活菌含量、CLSM观察的生物膜的平均厚度、最大厚度均大于野生株及空质粒转化株,P<0.05;空质粒转化株与野生株比较无显著性差别,P>0.05。结论 粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因有利于肠球菌生物膜的形成。     

粪肠球菌ace阳性和阴性菌株体外生物被膜形成能力比较

目的 比较粪肠球菌ace基因阳性、阴性菌株的生物被膜形成能力,探讨粪肠球菌ace基因是否有利于细菌生物被膜的形成。方法 微量滴定板法检测46株临床分离粪肠球菌的生物膜形成能力,PCR方法检测其ace基因,比较生物膜阳性组、阴性组粪肠球菌ace基因检出率;将粪肠球菌ATCC29212(ace⁺)、野生株U8-ace^-、空质粒对照株EU8-ace^-、转化株ZU8-ace⁺接种到96孔板,培养3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h,结晶紫染色,测定OD₅₇₀,微量滴定板法比较ATCC29212(ace⁺)、U8-ace^-、EU8-ace^-以及ZU8-ace⁺的生物被膜形成能力;将ATCC29212(ace⁺)、U8-ace^-、EU8-ace^-、ZU8-ace⁺在含盖玻片的细胞培养皿内培养6 h~72 h,共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察比较ace⁺、ace^-粪肠球菌形成的生物膜平均厚度和密度。结果 生物膜阳性组粪肠球菌ace基因检出率为76.67%,高于生物膜阴性组31.25%的检出率,差别有统计学意义 (χ²= 9.04,P> 0.05);微量滴定板法显示不同时间点ATCC29212(ace⁺)以及转化株ZU8-ace⁺的OD₅₇₀值都大于U8-ace^-的OD₅₇₀值,P< 0.01,而EU8-ace^-与U8-ace^-比较,OD₅₇₀值无统计学差别,P> 0.05;CLSM观测的ace⁺ 粪肠球菌在不同阶段所形成的生物膜的平均厚度、密度均高于ace^-粪肠球菌,P< 0.01,空质粒对照株与野生株比较,生物膜的厚度、密度无统计学差别,P> 0.05。结论 粪肠球菌胶原黏附素ace基因或有利于肠球菌生物被膜的形成。     

迟缓爱德华菌eha基因对大肠埃希氏菌溶血基因clyA转录的调控

目的研究迟缓爱德华菌溶血活化基因eha是否能影响大肠埃希氏菌DH5α溶血素基因clyA的转录。方法将重组eha表达质粒pED101转入DH5α中,以载体质粒pACYC184为对照,观察其溶血情况。并用RT-PCR分别检测受体菌DH5α,含pED101的DH5α菌以及含载体的DH5α菌中clyA基因的转录情况。结果eha基因表达质粒的转入,可以使DH5α出现clyA基因阳性条带,且和载体无关。结论迟缓爱德华菌eha基因能正性调控DH5αclyA基因的转录,从而使其表现为溶血。     

产单核细胞李斯特菌plcB基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达产单核细胞李斯特菌plcB基因。方法利用PCR技术从产单核细胞李斯特菌基因组中扩增不含编码信号肽的plcB基因。采用T-A克隆构建pGEM-T-plcB重组质粒,BamHI、XhoI双酶切pGEM-T-plcB获得plcB片段后再插入pGEX-6p-1原核表达载体,获得pGEX-6p-1-plcB重组表达质粒并在表达宿主菌BL21中诱导表达。对表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western-blotting、磷脂酶活性实验分析。结果克隆的plcB基因长834bp,与GenBank上公布的序列完全相同;表达的与GST标签蛋白融合的广谱磷脂酶C蛋白(GST-PC-PLC)具有磷脂酶生物活性和免疫原性。结论成功构建产单核细胞李斯特菌plcB基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,这为进一步研究PC-PLC蛋白的致病与免疫机理奠定了基础。     

基因重组人巨细胞病毒pp150蛋白片段的原核表达及鉴定

目的以人巨细胞病毒（HCMV）AD169病毒株基因为模板,经PCR扩增了编码pp150蛋白片段的UL32基因,转入pMD18-T克隆载体后经酶切与表达载体pET-11a连接,转入大肠杆菌BL21,重组大肠杆菌经诱导表达pp150蛋白片段.经SDS-PAGE分析,其相对分子量约为21.5 kD,表达量约占菌体蛋白的16.38%,Western blot鉴定为阳性.表明成功构建了pp150蛋白片段的表达载体,并成功诱导表达了pp150蛋白,为进一步纯化该蛋白奠定了基础.