Neu RNAi对卵巢癌细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用

目的探讨nenRNAi对卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用,寻找下调基因表达并逆转化疗耐药的方法,为卵巢癌的基因治疗探索新途径。方法应用含有u6启动子的pSilencer 1．0-U6表达载体构建neu基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（pSilencer—neu）,用脂质体方法将pSilencer—neu转染卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP,另设未转染组及转染pSilencer—control组为对照。显微镜下观察转染前后细胞的变化;用RT—PCR及Western Blot检测neu基因mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化;加入顺铂后检测RNAi对SKOV3／DDP顺铂药物敏感性的影响。结果neuRNAi可明显下调卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP中neu的基因表达;使其细胞生长受到抑制,生长速度减慢,生长曲线低平;细胞凋亡增加且细胞周期发生变化,G1／G0期细胞增多,S期细胞则减少;顺铂耐药实验显示,转染RNAi的SKOV3／DDP细胞IC50明显下调,细胞凋亡率显著增加。结论应用RNAi可以部分阻抑neu基因在卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP中的表达,使SKOV3／DDP细胞生长减慢、凋亡增加,而且对顺铂的敏感性增强。     

siRNA沉默IFITM1对卵巢癌细胞系CP70生物学效应的影响及机制研究

目的:采用siRNA技术沉默IFITM1基因表达,观察对卵巢癌CP70细胞侵袭及凋亡能力的影响及其可能的分子机制。方法:利用脂质体转染法将靶向IFITM1的小干扰RNA转染卵巢癌CP70细胞株;Western blot检测CP70细胞IFITM1蛋白的表达;Transwell侵袭小室、MTT、流式细胞仪检测转染细胞侵袭力、顺铂敏感性和凋亡的变化;Western blot观察转染后CP70细胞caspase-3的表达变化。结果:转染IFITM1 siRNA后卵巢癌CP70细胞的IFITM1表达受到高效而特异的抑制,减低了卵巢癌细胞的侵袭力,增加了细胞对顺铂的敏感性,促进了细胞凋亡,蛋白印迹结果显示转染细胞在顺铂作用下caspase-3磷酸化水平明显上调。结论:沉默IFITM1可以降低卵巢癌细胞的侵袭能力,提高对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡可能与上调凋亡相关的关键分子密切相关,IFITM1可能成为卵巢癌治疗的潜在靶点之一。     

长链非编码RNA FOXD2-AS1对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响

  目的  观察长链非编码RNA（lncRNA）FOXD2-AS1对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响。  方法  收集2017年2月至2017年9月华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉市妇幼保健院）手术切除的16例卵巢癌患者的组织标本,采用荧光实时定量聚合酶链式反应（quantitative PCR,qPCR）检测组织标本、人卵巢癌细胞系及人正常卵巢上皮细胞系中的FOXD2-AS1表达水平。将HO-8910细胞分为实验组和对照组,分别转染siRNA-FOXD2-AS1和阴性对照RNA。细胞计数CCK-8法、Transwell迁移实验分别检测沉默FOXD2-AS1表达对卵巢癌HO-8910细胞增殖活性和迁移能力的影响。生物信息学方法预测FOXD2-AS1的下游靶基因,qPCR检测下游靶基因表达,Western blot法检测葡萄糖调节蛋白94（glucose regulated protein94,GRP94）和信号通路Wnt/β-catenin的蛋白表达。  结果  卵巢癌组织中的FOXD2-AS1相对表达量8.56±0.51明显高于正常癌旁组织的2.38±0.21（P < 0.01）,FOXD2-AS1在卵巢癌细胞系OC3、HO-8910、A2780、SKOV-3中表达明显增加（P < 0.05）。下调FOXD2-AS1表达明显抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖活性和迁移能力（均P < 0.01）。生物信息学方法显示,FOXD2-AS1靶向结合miR-150-5p后,可靶向结合GRP94基因。实验组和对照组miR-150-5p相对表达量分别为5.45±0.91和1.01±0.08（P < 0.01）,GRP94 mRNA相对表达量分别为0.32±0.05和1.02±0.11（P < 0.01）。GRP94和Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达减少。  结论  FOXD2-AS1在卵巢癌组织和细胞系呈高表达,下调FOXD2-AS1可调控miR-150-5p表达,抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖和迁移,可发挥抑癌基因的功能。      

抑制survivin基因对人卵巢癌SKOV3细胞顺铂药物敏感性的影响

目的：探讨应用RNAi技术下调survivin基因对人卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡及顺铂敏感性的影响。方法：构建survivin基因shRNA真核表达载体,转染人卵巢癌SKOV3细胞。定量PCR和Western blotting观察SKOV3细胞survivinmRNA和蛋白表达的改变;噻唑蓝（Myr）检测细胞增殖活性和药物敏感性;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：SKOV3-siRNA组细胞survivinmRNA及蛋白表达下降,同时细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡率显著增加（P〈0．05）。SKOV3-siRNA组细胞对顺铂的化学敏感性升高,顺铂的IC50值降低（P〈0．05）。结论：下调survivin基因表达能够抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖能力,诱导细胞凋亡,增强细胞顺铂药物敏感性。因此,survivin基因可能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点。     

黄腐酚类似物通过cAMP/Wnt/β-catenin信号通路抑制卵巢癌细胞增殖降低对顺铂的耐药性

目的:探究黄腐酚（xanthohumol,XN）类似物通过cAMP/Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌细胞增殖的作用及对顺铂耐药性的影响。方法:以人卵巢癌细胞株HO-8910为研究材料,分为不同浓度(0、5、7.5、15、20 μmol/L)黄腐酚类似物组、对照组、顺铂组、黄腐酚类似物+顺铂组。采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法、实时荧光定量酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测黄腐酚类似物对HO-8910细胞增殖及对顺铂耐药性的影响。结果:与对照组比,黄腐酚类似物能够明显抑制HO-8910细胞增殖,差异具有统计学意义（P<0.05）;黄腐酚类似物a13+顺铂组HO-8910细胞对顺铂的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）显著低于顺铂组,细胞活性抑制率（inhibition rate,IR）显著高于顺铂组,差异具有统计学意义（P<0.05）;PKIβ（cAMP抑制剂）、IWP-2（Wnt/β-catenin抑制剂）可降低黄腐酚类似物a13对HO-8910细胞增殖的抑制作用,逆转黄腐酚类似物a13抑制HO-8910细胞对顺铂的耐药作用,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:黄腐酚类似物可提高顺铂对卵巢癌细胞增殖的抑制作用,降低细胞对顺铂的耐药性,作用机制与激活cAMP/Wnt/β-catenin信号通路有关。     

αvβ6整合素siRNA抑制人卵巢癌细胞体外及体内侵袭作用的研究

目的:研究整合素αvβ6小干扰RNA对人卵巢癌HO-8910PM细胞侵袭生长的抑制作用.方法:以脂质体法将整合素αvβ6-siRNA(siRNA组)及无义寡核苷酸质粒(Neo组)转染人卵巢癌HO-8910PM细胞,通过实时定量PCR及蛋白质印迹试验,分别测定siRNA组、Neo组和空白时照组αvβ6整合素mRNA和蛋白的表达,MTT法和Transwell小室法分别测定其体外增殖能力和侵袭力.将各组细胞接种于裸小鼠皮下,观察移植瘤生长速度,并用免疫组化法检测整合素αvβ6的表达.结果:与Neo组和空白对照组相比较,siRNA组中αvβ6整合素mRNA和蛋白表达强度明显降低;转染的卵巢癌HO-8910PM细胞侵袭力明显下降(P<0.01);各组细胞体外增殖能力差异无统计学意义(P>0.05),但siRNA组细胞裸鼠皮下移植瘤生长速度明显低于其他两组,免疫组化显示,转染整合素αvβ6-siRNA的移植瘤中整合素αvβ6为阴性表达.结论:αvβ6整合素siRNA转染HO-8910PM细胞后.通过降低αvβ6整合素mRNA和蛋白表达水平,抑制其对细胞外基质的侵袭,进而抑制裸鼠移植瘤的生长.     

RNA干扰人胃癌BGC-823细胞中DNA聚合酶β基因表达的初步研究

目的 研究RNA干扰DNA聚合酶β(polβ)基因对人胃癌BGC-823细胞生物学行为的影响.方法 针对DNA polβ基因序列构建小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,用脂质体介导转染人胃癌BGC-823细胞,G418筛选出稳定细胞株;采用荧光定量PCR和Western blot测定各组细胞的DNA polB mRNA和蛋白表达水平;用流式细胞术和裸鼠体内成瘤检测各组细胞的增殖情况.结果 成功构建了针对polβ基因的siRNA表达载体.转染pol β靶向siRNA的BGC-823细胞,其polβmRNA和蛋白表达水平均明显降低,且载体pRNAT-U6.l-sipoβ2(抑制程度83%)的沉默抑制作用强于载体pRNAT-U6.l-sipolβl(抑制程度56%);与无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组相比,转染pRNAT-U6.1-sipellM的细胞G0/G1期比例显著升高,S期比例及细胞增殖速度显著下降(P<0.05);转染pRNAT-U6.l-sipolβ2的细胞C0/C1期比例显著降低,S期比例及细胞增殖率显著升高(P<0.05).结论 靶向DNA polβ的siRNA可以显著抑制polβ的表达;polβ的高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态;通过siRNA将BGC-823细胞中polβ表达沉默到合适的低水平,可能对肿瘤的生长起到抑制作用.     

RNA干扰沉默Bmi-1基因对胃癌细胞BGC-823生长及顺铂敏感性作用的研究

目的:探讨Bmi-1基因对胃癌细胞BGC-823增殖、侵袭及顺铂耐药的作用及可能机制。方法:采用LipofectamineTM2000向胃癌细胞BGC-823随机转染成功构建靶向沉默Bmi-1表达的siRNA,分别利用Western Blot、CCK-8、Transwell小室等方法对转染Bmi-1 siRNA的BGC-823细胞的增殖、侵袭能力及顺铂耐药进行检测。结果:转染Bmi-1 siRNA后,BGC-823细胞的增殖、侵袭能力显著下降（P<0.05）,而且顺铂敏感性显著提高。结论:Bmi-1基因与胃癌BGC-823细胞系的增殖、侵袭及顺铂耐药相关,可能是胃癌治疗的靶点。     

Survivin-siRNA抑制肺癌A549细胞的增殖并增强其对顺铂的敏感性

目的：构建靶向存活素（survivin）的干扰RNA（siRNA）质粒,观察其对A549细胞增殖、凋亡以及顺铂敏感性的影响。方法：应用pSilencerU6质粒构建survivinsiRNA干扰质粒,RTPCR和Western blotting检测survivin mRNA和蛋白的表达,DAPI染色法检测细胞的凋亡,MTT法检测细胞的增殖。结果：成功构建了survivinsiRNA干扰质粒。SurvivinsiRNA质粒转染可明显下调A549细胞中survivin mRNA和蛋白的表达、抑制A549细胞的增殖、促进细胞的凋亡、增强A549细胞对顺铂的敏感性。结论：SurvivinsiRNA沉默survivin在肺癌细胞中的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡,并能增强肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性,survivin 可作为肺癌治疗的潜在靶点。     

siRNA沉默DNA聚合酶β基因对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

目的:观察siRNA沉默DNA聚合酶β(DNA polymerase β,pol β)基因后对胃癌BGC-823细胞增殖的影响.方法:用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)和Western印迹法检测先前构建好的转染不同siRNA载体的各组细胞中pol β mRNA和蛋白质表达水平,用FCM法和裸鼠体内成瘤实验检测各组细胞的增殖情况.结果:转染pol β靶向siRNA的BGC-823细胞中pol β mRNA和蛋白质表达水平均明显降低,且siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ2(抑制程度83%)的沉默抑制作用强于siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ1(抑制程度56%);与无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组相比,转染pRNAT-U6.1-sipolβ1组细胞的S期比例及细胞增殖速度明显下降,而转染pRNAT-U6.1-sipolβ2组细胞的S期比例以及细胞增殖则明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:DNA pol β高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态;BGC-823细胞中pol β表达通过siRNA沉默到合适的低水平,对肿瘤的生长可以起到抑制作用.     

siRNA干扰Id1表达增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性

[目的]探讨体外DNA结合抑制因子（inhibitor of DNA bindingor differentiation,Id）的表达对卵巢上皮癌SKOV3对顺铂化疗敏感性的影响。[方法]构建靶向Id1基因siRNA慢病毒载体并转染SKOV3细胞,筛选出稳定转染的SKOV3细胞克隆。实验分为4组：实验组（Cell＋LvshRNA-Id1）、阴性对照组（Cell＋Lv-shRNA-NC）、病毒对照组（Cell＋Lv-control）与空白对照组（Cell group）。CCK8检测各组SKOV3细胞不同时间增殖活性以及暴露于不同浓度顺铂（0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg/ml）48h后顺铂对各组SKOV3细胞的半数抑制浓度,分析沉默Id1基因后卵巢癌细胞对顺铂化疗敏感性的影响。[结果]三组对照组细胞增殖活性随着时间增加显著,而实验组则增加缓慢。在48h和72h时,实验组细胞增殖活性值分别为0.449±0.072μg/ml、0.885±0.232μg/ml,与三组对照组比较差异均有统计学意义（P均〈0.05）;实验组顺铂对SKOV3细胞的半数抑制浓度为1.5±0.71μg/ml,明显低于对照组（P〈0.01）。[结论]抑制Id1基因表达可以增加顺铂对卵巢癌细胞的生长抑制作用,为临床进一步提高卵巢癌的疗效提供了研究基础。     

顺铂对五种肿瘤细胞系Survivin基因表达的影响

目的 探讨顺铂在抑制肿瘤细胞生长的过程中对Survivin基因的影响及其可能的作用机制.方法 选取五种肿瘤细胞系:人胃腺癌细胞株(SGC-7910)、人卵巢癌细胞系(HO-8910)、高转移卵巢癌细胞(HO-8910pm)、人喉癌细胞(Hep-2)、人胰腺癌细胞(PC-2),应用RT-PCR方法检测顺铂作用后Survivin基因表达的变化.结果 五种肿瘤细胞系中Survivin基因均有较高的表达,顺铂对SGC-7910、HO-8910、HO-8910pm细胞系中Survivin基因有显著的抑制作用,Hep-2、PC-2细胞系在顺铂作用后Survivin基因的表达与正常组没有显著差异.结论 顺铂可能是通过抑制Survivin基因诱导SGC-7910、HO-8910、HO-8910PM细胞凋亡而发挥其抗肿瘤功效,而对Hep-2、PC-2细胞系Survivin基因的表达没有明显作用.     

TIZ基因mRNA在卵巢癌细胞系中的表达及其RNA干扰载体构建

目的检测卵巢癌细胞株中TIZ基因的mRNA表达水平,并构建TIZ基因的特异性RNA干扰（RNAi）载体。方法通过RT-PCR方法检测卵巢癌细胞系（SKOV3、SKOV3顺铂耐药细胞、SKOV3卡铂耐药细胞、A2780、A2780卡铂耐药细胞、H08910）中TIZmRNA的表达;根据Genebank上TIZ的mRNA序列,设计5对siRNA干扰片段,采用脂质体转染法介导siRNA干扰片段并下调卵巢癌细胞系中TIZmRNA的表达。采用pTG19-T质粒构建TIZ和β-actintmRNA表达重组质粒并制备其标准品。采用实时定量PCR（QRT—PCR）检测siRNA干扰片段对TIZ基因的下降效率,并筛选最佳siRNA干扰片段。以pGPU6／GFP／Neo载体和质粒DNA测序方法构建pGPU6／GFP／Neo-siRNA—TIZ-573重组质粒。结果①除卵巢癌细胞H08910细胞无TIZ基因mRNA表达外,其余细胞均有TIZ基因mRNA表达。②细胞siRNA干扰片段筛选结果显示介导TIZ-573片段后可下调60％细胞TIZmRNA表达。③成功构建了TIZ基因RNAi载体pG-PU6／GFP／Neo-TIZ-573。结论多数卵巢癌细胞系表达TIZmRNA。siRNA-TIZ-573为最佳下调细胞TIZmRNA片段。构建的pGPU6／GFP／Neo-TIZ-573重组质粒可用于下一步的实验研究。     

Livin异构体基因沉默对肺腺癌SPC-A1 细胞化疗增敏效应研究

背景与目的 前期研究发现,凋亡抑制蛋白家族(IAP)新成员Livin尤其是Livinα,参与肺癌的发生发展,是肺癌细胞化疗耐药的重要机制之一.本研究的目的是利用基因转染和RNA干涉(RNAi)技术,在肺腺癌SPC-A1细胞中建立Livin异构体α和β特异的基因沉默体系,探讨其对增加SPC-A1细胞化疗敏感性的不同作用及价值.方法 在SPC-A1细胞中稳定表达Livinα β、Livinα和Livinβ特异性小干涉RNA(siRNA),体外实验用甲基偶氮唑蓝(MTT)法,研究Livin基因沉默后SPC-A1细胞对化疗药物的敏感性改变;体内实验利用荷瘤裸鼠模型,研究Livin基因沉默后荷瘤小鼠对顺铂的敏感性改变.结果 Livinα β、Livinα和Livinβ基因沉默后,SPC-A1细胞对顺铂、卡铂、环磷酰胺、阿霉素等多种化疗药物敏感性增加(P＜0.05),其中,Livinα β基因沉默能更有效增加肺癌细胞化疗敏感性(P＜0.01).动物实验表明,pSilencer-Livinα β组、pSilencer-Livinα组和pSilencer-Livinβ组抑瘤率分别为146.1%、130.7%、110.5%.结论 Livin异构体尤其是Livinα β可作为肺癌细胞化疗增敏的分子靶点,其基因沉默有望成为非小细胞肺癌基因治疗新手段.     

RNA干扰ERCC1基因表达对肺腺癌细胞A549/DDP顺铂耐药的影响

背景与目的核苷酸切除修复机制可修复顺铂(DDP)造成的DNA损伤,作为其中的关键酶之一,切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)的表达可能与DDP耐药有关.本研究旨在探讨小干扰RNA沉默ERCC1基因表达对肺腺癌耐药细胞A549/DDP药物敏感性的影响.方法将体外设计合成针对ERCC1的小分子RNA(siRNA)转染A549/DDP细胞,RT-PCR检测ERCC1 mRNA水平;Western blot检测ERCC1蛋白表达的变化;MTT检测RNA干扰后细胞药物敏感性改变.结果 ERCC1 RNAi干扰后ERCC1 mRNA表达指数降低,明显低于对照组,干扰后ERCC1 mRNA表达抑制率为90.4%.转染ERCC1 siRNA降低TERCC1蛋白的表达水平.MTT显示分别用2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL顺铂处理细胞48 h,转染ERCC1 siRNA细胞组较对照组敏感性明显增高,干扰前A549/DDP细胞IC50为12.49μg/mL,干扰后A549/DDP细胞IC50下降为9.27 μg/mL.结论 ERCC1siRNA干扰可以降低ERCC1的表达水平,并可提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性.     

靶向GLI1基因增强卵巢癌细胞化疗敏感性的实验研究

目的探讨载体表达的小干扰RNA(siRNA)影响卵巢癌耐药细胞株GLI1基因的表达,促进凋亡并逆转其顺铂耐药的可行性。方法体外构建GLI1小发夹状RNA(shRNA)的表达质粒,脂质体法介导将其转染入SKOV3/DDP细胞。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测GLI1 mRNA的表达;使用免疫细胞化学法(ICC)检测GLI1蛋白的表达;使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定各组细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术检测其对卵巢癌细胞凋亡的影响。结果 GLI1 shRNA转染组细胞GLI1 mRNA的表达与其他两组相比明显减弱(P0.01),GLI1蛋白表达明显下调(P0.01);顺铂敏感性比正常对照组提高了约2.5倍;流式细胞仪检测结果显示:顺铂作用24 h后,特异性转染组细胞周期分布发生明显改变,G_0/G_1期细胞比例增多,而S期细胞比例减少,凋亡率显著升高。结论针对GLI1合成的siRNA能够有效地抑制GLI1 mRNA和蛋白的表达,促进卵巢癌耐药细胞凋亡并能恢复其对顺铂的敏感性。应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的耐药性。     

巨噬细胞游走抑制因子在卵巢癌侵袭中的作用与意义

背景与目的:巨噬细胞游走抑制因子(maerophage migration inhibitory factor,MIF)与肿瘤的恶性进展密切相关.本研究探讨MIF基因对卵巢癌HO-8910和OVCAR-3细胞侵袭和增殖能力的影响及其在卵巢癌组织中表达的意义.方法:瞬时转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向敲除MIF基因,RT-PCR和Western blot检测MIF在mRNA和蛋白水平的表达,通过体外迁移、侵袭实验和噻唑蓝比色法(MTT)分析MIF对HO-8910和OVCAR-3细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响;免疫组织化学检测MIF蛋白在卵巢癌组织中的表达情况.结果:与阴性对照组细胞比较,瞬时转染MIF siRNA的HO-8910和OVCAR-3细胞中MIF基因表达水平明显降低.MTT结果显示,转染MIF siRNA的两株卵巢癌细胞增殖率显著低于阴性对照组(P＜0.05).转染MIF siRNA的HO-8910细胞穿膜细胞数(MIF-si1:48.0±7.3;MIF-si2:38.0±3.6)与阴性对照组(78.0±8.5)比较差异有统计学意义(P＜0.05),其穿过铺了Matrigel膜的细胞数(MIF-sil:35.0±5.0:MIF-si2:30.0±5.6)也显著少于阴性对照组(P＜0.05).同样,转染了MIF siRNA的OVCAR-3细胞穿膜细胞数(MIF-si1:40.0±4.5;MIF-si2:42.0±3.0)与阴性对照组(65±2.1)比较,差异也有统计学意义(P＜0.05),其穿过铺了Matrigel膜的细胞数(MIF-sil:25.0±3.0:MIF-si2:27.0±3.4)也明显低于阴性对照组(P＜0.05).53.6%(37/69)卵巢癌组织中有MIF蛋白表达.MIF蛋白表达与肿瘤临床分期呈显著正相关(P＜0.01).结论:MIF基因可能通过促进肿瘤细胞的增殖和侵袭能力在卵巢癌的发生发展中发挥重要作用,有可能成为分子靶向治疗卵巢癌的潜在靶点.     

RNAi抑制肾癌细胞MDR1基因表达及对顺铂化疗耐药的逆转

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对肾癌细胞多药耐药基因1(multidrug resistance,MDR1)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对顺铂(cisplatin)敏感度的变化.方法:根据MDR1基因序列设计3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染肾癌A498细胞;RT-PCR法检测转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆;Western印迹法检测MDR1蛋白表达水平;MTT法检测干扰前后顺铂对半数细胞抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))的变化.结果:3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDR1基因,使MDR1 mRNA表达水平下降67%;筛选得到稳定转染的细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降(P<0.01),并使顺铂对细胞的IC_(50)值降低约83.37%(P<0.01).结论:RNAi能有效抑制肾癌A498细胞MDR1基因的表达,并可显著增加其对顺铂的敏感度,从而使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能.     

质粒表达的短发夹状RNA特异性抑制鼻咽癌细胞的增殖

目的观察pmU6-sibclD重组体在细胞内表达的bcl-xL短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)能否特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖.方法将自行构建的表达短发夹状RNA的重组质粒转染到人鼻咽癌CNE-2Z细胞株、卵巢癌HO-8910细胞株和正常人类肝脏L-O2细胞株中,流式细胞仪检测转染率,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果bcl-xLshRNA能特异地抑制CNE-2Z细胞株的生长增殖,而对正常人类肝脏细胞株的生长增殖和HO-8910细胞中的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的表达无抑制作用.结论pmU6-sibclD重组体在细胞内表达的短发夹状RNA能特异性抑制鼻咽癌细胞的生长增殖,为质粒介导的RNAi技术运用于肿瘤的基因治疗提供一定的理论依据.     

沉默CXCR4的表达逆转肺癌细胞顺铂耐药

目的:探讨沉默CXCR4对肺癌细胞顺铂耐药的影响,并研究其分子作用机制。方法:利用RT-qPCR测定肺癌耐药（A549/DDP）及药物敏感细胞株（A549）中CXCR4 mRNA的表达水平;利用LipofectamineTM 2000将siRNA-CXCR4转染至肺癌耐药细胞株中,RT-qPCR及蛋白质印迹法（Western blot）验证siRNA对CXCR4基因的靶向沉默效率;利用CCK-8法检测沉默CXCR4后肺癌耐药细胞的增殖活性;利用流式细胞仪测定沉默CXCR4后肺癌耐药细胞的凋亡率;利用MTT法测定沉默CXCR4后肺癌耐药细胞对顺铂的敏感性;利用Western blot实验测定沉默CXCR4后CYP1B1蛋白的表达水平。结果:RT-qPCR实验结果显示,肺癌耐药细胞株A549/DDP中CXCR4 mRNA的表达量显著高于药物敏感细胞株（P＜0.01）;体外转染siRNA-CXCR4可明显下调A549/DDP细胞株中CXCR4的表达（P＜0.001）;CCK-8实验结果显示,沉默CXCR4的表达抑制了A549/DDP细胞的增殖活性（P＜0.01）;流式细胞仪实验结果显示,沉默CXCR4的表达促进了A549/DDP细胞凋亡（P＜0.01）;MTT实验结果显示,沉默CXCR4的表达增加了A549/DDP细胞对顺铂的敏感性（P＜0.01）;Western blot实验结果显示,沉默CXCR4后CYP1B1蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。结论:沉默CXCR4的表达抑制肺癌耐药细胞增殖、促进凋亡,逆转肺癌细胞顺铂耐药,CXCR4正向调控CYP1B1的表达,可能是CXCR4逆转肺癌细胞顺铂耐药的作用机制。