hsa-miR-223通过靶向ARTN调控食管癌KYSE-150细胞的迁移和侵袭能力

探讨hsa-miR-223对人食管癌细胞迁移和侵袭能力的影响,研究hsa-miR-223影响食管癌细胞功能改变的作用机制。方法:通过Real-time PCR和Western blot检测hsa-miR-223和ARTN在人食管癌细胞系中的表达;建立了稳定过表达成熟miR-223的人食管癌KYSE-150细胞系,通过细胞划痕实验和Boyden chamber检测细胞迁移和侵袭能力的改变;在此基础上,通过报告基因分析和Western blot探讨hsa-miR-223引起食管癌细胞生物学功能改变的作用机制。结果:Real-time PCR结果表明hsa-miR-223在高转移潜能的人食管癌细胞KYSE-150中呈低表达,而ARTN在KYSE-150中呈高表达;在人食管癌细胞KYSE-150中过表达hsa-miR-223后降低细胞的迁移和侵袭能力。双荧光素酶报告基因分析表明成熟的miR-223能够作用于ARTN的3'UTR区降低荧光素酶的活性,Western blot进一步证实了hsa-miR-223能够抑制内源性ARTN的表达。结论:hsa-miR-223在高转移能力的食管癌细胞KYSE-150中呈低表达,具有类似抑癌基因的作用调控ARTN的表达,降低了食管癌细胞KYSE-150的迁移和侵袭能力,ARTN是miR-223的靶基因,有可能成为肿瘤生物治疗的一个靶点。      

微小RNA-181a在人食管癌EC9706细胞中对靶基因PRDM1调控作用的研究

目的:构建微小RNA(microRNA,miR)-181a的真核表达载体和靶基因PRDM1(encoding PR domain containing1,with ZNF domain)的3’非翻译区(3’-untranslated region,3’UTR)荧光素酶报告载体,在人食管癌EC9706细胞中验证miR-181a对靶基因PRDM1的调控作用。方法:根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游200个碱基序列,以人食管癌KYSE150细胞基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增包含miR-181a前体的序列,克隆到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后亚克隆到质粒pCDNA3.1(+)上,对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。通过实时定量PCR法检测人食管癌EC9706细胞转染重组表达载体pCDNA3.1-miR-181a后成熟miR-181a的表达水平。应用生物信息学预测软件对miR-181a的靶基因进行预测,将候选靶基因PRDM1的3’UTR融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基因检测miR-181a对靶基因PRDM13’UTR的调控作用。将pCDNA3.1-miR-181a表达质粒转染到人食管癌EC9706细胞中,蛋白质印迹法检测其对PRDM1蛋白表达的影响。结果:成功构建miR-181a真核表达载体,实时定量PCR验证表明pCDNA3.1-miR-181a在EC9706细胞中能够过表达成熟miR-181a。生物信息学预测PRDM1可能是miR-181a的靶基因之一,于是构建了PRDM1的3’UTR荧光素酶报告载体pMIR-PRDM1,在此基础上对PRDM1的3’UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明,miR-181a能够作用于PRDM1基因的3’UTR。蛋白质印迹法进一步证实,miR-181a能够抑制性调控内源性PRDM1蛋白的表达。结论:MiR-181a作用于PRDM1基因的3’UTR,在转录后水平上调PRDM1蛋白的表达,提示PRDM1是miR-181a直接调控的靶基因。     

miR-132在食管癌细胞系KYSE150 中对靶基因FOXA1的调控作用

 目的构建miR-132真核表达载体和融合靶基因FOXA1表达载体,在食管癌细胞KYSE150中验证miR-132对靶基因 FOXA1的调控作用。方法根据miR-132序列在基因组中的位置及其上下游序列,以EC9706细胞基因组DNA为模板,扩 增包含miR-132前体序列,克隆到pMD18-T Simple中,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后亚克隆到质粒pcDNA3.1(+)上;通过 Real-time PCR检测转染重组表达载体pcDNA3.1-miR-132的KYSE150成熟miR-132的表达水平。用生物信息学软件对 miR-132的靶基因进行预测,将候选靶基因FOXA1的3′UTR区融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基 因检测分析miR-132对靶基因FOXA1的调控作用。将pCDNA3.1-miR-132表达质粒转染人食管癌细胞KYSE150,通过 Western blot检测miR-132对FOXA1蛋白表达的影响。结果成功构建了miR-132真核表达载体,Real-time PCR验证表 明pCDNA3.1-miR-132在KYSE150细胞中能够显著地过表达成熟miR-132。生物信息学预测FOXA1可能是miR-132的靶基 因。双荧光素酶报告基因分析表明miR-132能够作用于FOXA1的3′UTR。Western blot进一步证实miR-132能够抑制 内源性FOXA1蛋白的表达。结论FOXA1是miR-132直接调控的靶基因。     

Hsa-miR-132通过靶向FOXA1基因影响食管癌细胞的增殖和侵袭

目的:探讨hsa-miR-132(miR-132)对人食管癌细胞增殖和侵袭的影响及其可能的机制。方法:构建pCDNA3.1(+)-miR-132表达载体并转染高转移潜能的人食管癌细胞KYSE150,G418筛选稳定过表达miR-132的KYSE150细胞。软琼脂克隆形成实验和Transwell小室实验检测KYSE150细胞的增殖和侵袭,Real-time PCR和Western blotting检测miR-132和叉头框蛋白A1基因(forkhead box protens A1,FOXA1)在KYSE150细胞中的表达,双荧光素酶报告基因分析和Western blotting检测过表达miR-132对FOXA1的调控作用。结果:成功构建pCDNA3.1(+)-miR-132质粒,获得稳定过表达miR-132的KYSE150细胞。亲本KYSE150细胞中miR-132低表达,而FOXA1蛋白高表达。与转染空载体和未转染KYSE150细胞相比,转染pCDNA3.1(+)-miR-132不影响KYSE150细胞的增殖(13.9±0.33 vs 15.4±0.11、17.1±0.20,P>0.05),但细胞体积较小且表面比较光滑;其可显著降低KYSE150细胞的侵袭能力[(55±1.6)vs(129.0±3.1)、(124.0±2.8)个细胞,P<0.01]。miR-132能够作用于FOXA1 3’-UTR,从而抑制内源性FOXA1的表达。结论:食管癌KYSE150细胞低表达miR-132,外源性过表达miR-132可负向调控FOXA1的表达,从而抑制KYSE150细胞的侵袭能力。     

子宫内膜癌中microRNA-125b对HER2基因3' 非翻译区的调控作用

目的:明确miR-125b在子宫内膜癌中对HER2基因3'UTR的靶向调控作用.方法:分别构建野生型和突变型HER2基因 3'UTR荧光素酶载体;软件预测HER2基因 3'UTR靶向miRNAs;共转染miR-125b和荧光素酶载体于HEC-1B细胞中,双荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性.结果:通过软件预测在HER2 3'UTR第37bp位置有一个miR-125b结合位点;与转染对照miR组和突变型载体组相比,miR-125b前体能明显降低野生型载体的荧光素酶活性.结论:miR-125b能够靶向负性调控HER2基因 3'UTR活性.     

miRNA-1靶向DDX5抑制食管癌细胞增殖、迁移及侵袭

目的:探讨微小RNA(miR)-1对食管癌细胞株EC-109生长、侵袭及迁移的影响和其相关作用调控机制。方法:采用脂质体瞬时转染技术,对体外培养的EC-109细胞转染miR-1 mimics,分别采用CCK-8法和Transwell实验检测miRNA-1对食管癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响;生物信息学预测miR-1可能的靶基因,并用双荧光素酶报告基因和Western blot法验证其靶基因。结果:过表达miRNA-1后,CCK-8和Transwell实验结果显示食管癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力显著降低(P<0.05);生物信息学分析显示DDX5可能是miR-1的靶基因;双荧光素酶报告基因结果显示miR-1与DDX5 mRNA 3' UTR相结合;Western blot结果显示高表达miR-1后,DDX5表达下降。结论:miRNA-1可能通过靶向负调控DDX5的表达抑制食管癌细胞增殖、迁移及侵袭。     

miR-1271-5p在肾细胞癌组织和细胞中的表达及其对A-498 细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨miR-1271-5p 在肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）组织和细胞系中的表达及其对RCC细胞株A-498 增殖及凋亡的影响。方法：用实时荧光定量PCR（qPCR）检测手术切除并经病理确诊为RCC组织和癌旁组织,以及RCC细胞系ACHN、A498、HK-2、786-O、CaKi-1 和人胚肾细胞株HEK293 中miR-1271-5p 的表达水平。用miR-1271-5p（实验组）和miR-NC（对照组）分别转染A-498 细胞。通过生物信息学预测鸟嘌呤交换因子DOCK1 为miR-1271-5p 可能的靶基因,构建DOCK1 基因的3’UTR 野生型及突变体序列双荧光素酶报告基因载体并进行荧光素酶活性检测,qPCR检测两组细胞中DOCK1 mRNA表达水平,Western blotting 检测两组细胞中DOCK1、p-ERK、p-AKT、Bcl-2 和Bax蛋白的表达情况,MTS法、集落形成实验和流式细胞术检测A-489 细胞增殖、集落形成数目和凋亡情况。结果：RCC组织和细胞系中miR-1271-5p 表达水平显著低于癌旁组织和人胚肾HEK293 细胞（均P<0.01）。双荧光素酶报告基因系统结果显示DOCK1 是miR-1271-5p 的靶基因(P<0.01)。与miR-NC组细胞相比,miR-1271-5p 组A-498 细胞中DOCK1 mRNA的表达水平显著下降(P<0.01);DOCK1、p-ERK、p-AKT、Bcl-2 蛋白表达水平显著下调(P<0.05),Bax 蛋白明显上调(P<0.05);A-498 细胞增殖活力显著降低(P<0.01);集落形成数显著减少(P<0.05);细胞凋亡率显著增高(P<0.01)。结论：RCC组织和细胞系中miR-1271-5p 表达下调,通过干扰DOCK1 基因表达能明显抑制A-489 细胞的增殖及诱导其凋亡,miR-1271-5p 可能成为未来RCC治疗的分子靶标。     

miR-25在人胃癌组织中的表达分析及其靶基因TOB1的鉴定

  目的   分析miR-25在胃癌组织中的表达水平并鉴定其新的靶基因。   方法   选取10例胃癌患者的胃癌及癌旁正常组织样本, 用qRT-PCR法检测miR-25的表达水平。利用miRNA靶基因预测数据库预测miR-25的靶基因。构建荧光素酶载体(pMIR-TOB1)及绿色荧光蛋白报告载体(pMIR-GFP-TOB1)(含有miR-25结合位点的TOB1的3'UTR片段), 利用荧光素酶活性实验和GFP荧光强度报告实验鉴定miR-25的预测靶基因(TOB1)。qRT-PCR法和Western blot法分别检测TOB1的mRNA和蛋白质的表达水平。   结果   miR-25在80%(8/10)的胃癌组织样本中表达上调。miR-25模拟物显著抑制了荧光素酶的活性(P < 0.01)和GFP荧光强度。miR-25模拟物显著下调了AGS细胞中TOB1的mRNA(P < 0.05)和蛋白质的表达。   结论   miR-25在人胃癌组织中表达上调, miR-25能结合TOB1的3'UTR并下调TOB1的mRNA和蛋白质的表达。      

miR-141靶向YAP1抑制肝癌细胞HCC-LM3增殖、迁移和侵袭

目的:探究microRNA-141（miR-141）对肝癌细胞HCC-LM3增殖、迁移、侵袭的影响。方法:通过荧光定量PCR（qPCR）检测肝癌细胞系（HepG2、Huh7、HCC-LM3）与肝上皮细胞THLE-3中miR-141的表达量；免疫印迹试验（Western blot）分析Yes相关蛋白1（YAP1）的表达量。采用噻唑蓝（MTT）实验分析过表达miR-141或沉默YAP1对HCC-LM3细胞增殖的影响，Transwell实验检测细胞的侵袭、迁移能力。采用生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验验证miR-141的靶基因。功能性实验检测过表达YAP1对miR-141调控的HCC-LM3细胞增殖、迁移、侵袭作用的影响。结果:qPCR和Western blot的结果表明，肝癌细胞系（HepG2、Huh7、HCC-LM3）中miR-141的表达量下调，YAP1的表达量上调；过表达miR-141和沉默YAP1可以抑制HCC-LM3细胞增殖、侵袭、迁移；生物信息学预测YAP1可能是miR-141的靶基因，双荧光素酶报告基因证实YAP1是miR-141的靶基因；过表达YAP1逆转miR-141对HCC-LM3细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论:miR-141直接靶向YAP1抑制肝癌HCC-LM3细胞增殖、迁移、侵袭。     

miR-155在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达及对细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的:探讨miR-155在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭的影响机制。方法:通过生物信息学网站预测miR-155的可能靶基因,双荧光素酶报告基因实验进行验证;采用qRT-PCR测定NSCLC组织及细胞中miR-155和ZIC3的表达;通过LipofectamineTM2000试剂盒向A549细胞中分别转染miR-155 mimic和mimic NC,共转染miR-155 mimic+pMIR-ZIC3;Western blot检测转染miR-155 mimic对ZIC3蛋白表达的影响;MTT法、划痕实验及Transwell侵袭实验分别检测miR-155对A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果:生物信息学网站预测显示ZIC3-3' UTR与miR-155存在结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证ZIC3是miR-155的靶基因,ZIC3表达受miR-155的负向调控。NSCLC组织及细胞中miR-155显著低表达,ZIC3显著高表达（P＜0.05）;过表达miR-155抑制了ZIC3蛋白的表达水平（P＜0.05）。转染miR-155 mimic显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力（P＜0.01）;共转染miR-155 mimic+pMIR-ZIC3逆转了miR-155 mimic对NSCLC细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用（P＜0.05）。结论:NSCLC中miR-155显著低表达,其过表达可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭;miR-155可能通过靶向负调控ZIC3影响NSCLC细胞的生物学行为。