微板酶联夹心杂交法定量检测人IL-18 mRNA

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术，定量检测人IL-18mRNN。方法：针对人IL-18mRNA RT-PCR产物—条链的不同区域序列设计—对特异探针，其中一条为捕获探针，5’端为氨基修饰，可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合，“竖直”地包被在微孔板内；另一条为检测探针，3’端标记生物素。提取人外周血单个核细胞中总RNA，进行RT-PCR扩增IL-18 mRNA，产物热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交，再加入检测探针与已杂交的产物结合，最后经亲和素-辣根过氧化物酶(SAV-HRP)系统检测杂交信号。结果：该法检测IL-18mRNA RT-PCR产物的灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳，重复性良好，且结果数据化。结论：该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，适合于PCR扩增产物的定量检测。     

微量酶标夹心杂交法定量检测人iNOS-mRNA

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术，对人iNOS-mRNA进行定量检测。方法：设计两条特异探针，其中一条为捕获探针，5'端连接氨基，能与微孔板表面的NOS基团共价结合，“竖直”地包被在微孔中，另一个为检测探针，3'端带有生物素标记。用脂多糖（LPS）刺激人外周血单个核细胞24 h后，提取巨噬细胞总RNA，进行RT-PCR扩增，PCR产物热变性后加入到已包被捕获探针的微孔板内，并加入检测探针进行夹心杂交，最后加入亲和素-辣根过氧化物酶（AV-HRP）及底物，在450 nm波长检测杂交信号。结果：该方法检测iNOS-mRNA的灵敏度明显高于RT-PCR-琼脂糖凝胶电泳；特异性高，RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现；精密度良好。结论：本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化，适合于iNOS-mRNA的定量检测。     

微量酶联夹心杂交法定量检测hIL-8 mRNA PCR扩增产物

目的:建立一种灵敏度高、特异性强、定量、精确、操作简便的微孔板酶联夹心杂交技术,定量检测人IL-8 mR-NA。方法:针对人IL-8 mRNA逆转录聚合酶链反应产物一条链的不同区域序列设计一对特异探针,其中一条为捕获探针,5′端用活性氨基修饰,与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合,“竖直”地包被在微孔板内;另一条检测探针的3′端标记生物素,和辣根过氧化物酶结合。提取人外周血单个核细胞总RNA,进行RT-PCR扩增IL-8 mRNA,双链DNA产物经热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交,加入检测探针与已杂交的产物结合,经亲和素-辣根过氧化物酶系统检测杂交信号。结果:该法灵敏度为检出16个循环的PCR产物、5×103个PBMCs中的IL-8 mRNA、检测PCR终产物的最高稀释倍数为1∶256阳性;特异性试验非目的扩增片段酶联杂交检测未检出阳性杂交信号;精密度试验CV为5.2%。结论:该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点,适合IL-8 mRNA PCR扩增产物的定量检测。     

微量酶联杂交法定量检测HBV基因 竞争PCR扩增产物

目的 建立一种简便、敏感、精确的微反应板酶联杂交技术,以鉴定HBV基因的竞争PCR扩增产物。方法 设计了两种捕获探针,能分别与竞争PCR扩增产物中的野生片段和突变片段杂交。捕获探针通过3′－端修饰的氨基与微量DNA结合板孔表面的NOS基团化学结合而被“竖直”地包被在反应板上;将热变性后的产物加入两种捕获探针反应孔内,产物中带有生物素的野生或突变片段的一条单链与相应的捕获探针杂交;最后用链亲和素－碱性磷酸酶及底物检测杂交信号。结果 该方法检测PCR产物DNA的灵敏度为80ng/ml,大于琼脂糖凝胶电泳染色鉴定法。获得野生片段和突变片段杂交信号值后,可根据公式计算扩增前野生模板的初始量。结论 本方法操作简单、灵敏度高、结果数据化、特异性强,适用于竞争PCR产物分析。     

RT-PCR-ELISA方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度的初步研究

目的 应用核酸扩增产物测定的固相杂交酶联显色法(RT-PCR-ELISA)检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度。方法 应用RT-PCR-ELISA。将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的疫苗病毒基因产物。与微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交，通过辣根过氧化物酶标记的链亲和素进行酶联显色。读取吸光度(A值)。判断结果。应用此法检测了11批甲肝活疫苗滴度。并与常规细胞培养法(CCID50)比较。结果 本方法与细胞培养法的敏感性相仿，具有简便、快速、特异的优点。结论 RTPCR-ELISA法有望代替常规细胞培养法应用于甲肝减毒活疫苗病毒滴度的检测。     

采用PCR微板核酸杂交-ELISA技术进行HBV DNA基因分型的研究

目的 采用PCR微板核酸杂交－ELISA技术对HBV DNA进行基因分型研究。方法 采用PCR、核酸杂交和酶联显色技术,首先将HBV DNA进行PCR扩增,并将扩增产物加入预先包被HBV通用探针的微孔板,再加入HBV各基因型显色探针,同时进行微板核酸夹心杂交－ELISA显色,对152例临床诊断为不同程度乙型肝炎患者血清中HBV DNA进行基因分型。结果 152例不同临床表面的肝炎患得血清中的HBV DNA的基因型大多集中在B、C和D这3种基因型,其所占比例分别为：B型28．29％（43／152）,C型（37．50％（57／152）、D硎型18．42％（28／152）;A型、E型、F占比例很少,各占有3．29％（5／152）。还存在一定比例的混合基因型,B、C、D三型不同组合的混合型共占10．53％（16／152）。结论 PCR微板核酸杂交－ELISA方法可以准确、快速、简便进行HBV基因分型,在探讨HBV的流行病学及观察各基因型毒力强弱及致病性大小方面有重要意义。     

聚合酶链反应-微孔板杂交法检测输血传播病毒DNA

目的 建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）－微孔板杂交检测ＴＴ病毒（ＴＴＶ）ＤＮＡ的方法,探讨不国因素对方法敏感度和特异性的影响。方法 硫氰酸胍裂介异丙醇沉淀提取ＴＴＶ ＤＮＡ,以ＰＣＲ扩增,扩增产物上标记的生物素与包被在微孔板上的链亲和素结合标记有荧光素的探针与产物杂交,再与酶标抗荧光素抗体结合,经底物显果在各种影响因素中,当ＮａＯＨ浓度为０．３ｍｏｌ／Ｌ,杂交时间６０ｍｉｎ,酶反应时间为４５ｍｉｎ时,结     

用逆转录PCR-核酸探针杂交法对柯萨奇B组病毒分型诊断

目的 建立一种逆转录PCR-核酸探针杂交法对柯萨奇B组病毒(CVB1～6)进行分型诊断。方法 一对通用PCR引物，它能有效扩增所有CVB1-6型的特异性DNA片段；另选取6条各型特异性寡核苷酸探针，将它们分别共价结合在不同的微孔板上。经过一次PCR扩增，扩增后的产物分别与包被有不同探针的微孔板进行杂交检测，从而有效鉴别CVB各型。结果 本法与ELISA法的分型比较显示它们具有很好的一致性，无错误分型。对152例IgM抗体阳性标本的检测，该方法阳性率为71．7％。结论 本法可准确对CVB进行分型，为CVB的临床诊断及流行病学调查提供了一种有效的方法。     

山西汉族可溶性HLA-Ⅰ类抗原检测

目的:定量检测正常人血清中可溶性人白细胞抗原-Ⅰ(sHLA-Ⅰ),以探讨山西汉族人群的正常参考值.方法:ELISA法检测血清sHLA-Ⅰ类抗原水平.将不同浓度的标准品和待检血清分别加入包被有特异性sHLA-Ⅰ抗体的酶标板,与生物素化的sHLA-Ⅰ、辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素共同孵育,弃上清并用洗涤液洗涤,加底物应用液四甲基联苯胺(TMB)显色,以酶标仪450nm测定吸光度值,根据不同浓度标准品显色后测得的吸光度值绘制标准曲线,测定60例健康山西人的sHLA-Ⅰ含量.结果:ELISA法能够准确检测sHLA-Ⅰ含量,60例健康山西人的sHLA-Ⅰ含量为(382.62±106.68)ng·ml-1.结论:山西汉族人群sHLA-Ⅰ正常值为(382.62±106.68)ng·ml-1.     

山西汉族可溶性HLA-I类抗原检测

目的：定量检测正常人血清中可溶性人白细胞抗原-I（sHLA-I）,以探讨山西汉族人群的正常参考值。方法：ELISA法检测血清sHLA-I类抗原水平。将不同浓度的标准品和待捡血清分别加入包被有特异性sHLA-I抗体的酶标板,与生物素化的sHLA-I、辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素共同孵育,弃上清并用洗涤液洗涤,加底物应用液四甲基联苯胺（TMB）显色,以酶标仪450nm测定吸光度值,根据不同浓度标准品显色后测得的吸光度值绘制标准曲线,测定60例健康山西人的sHLA-I含量。结果：ELISA法能够准确检测sHLA-I含量,60例健康山西人的sHLA-I含量为（382．62±106．68）ng·ml-1。结论：山西汉族人群sHLA-I正常值为（382．62±106．68）mg·ml-1。     

CLIP-PCR直接检测血液中疟原虫雌性配子体特异转录产物s25 mRNA

目的建立一种疟原虫雌性配子体的分子检测法。方法根据疟原虫雌性配子体特异性mRNA靶标(待测靶序列)即动合子表面蛋白(s25)的转录产物,设计特异性的捕获探针和连接探针。血液样品经裂解释放的mRNAs,无需核酸提取,通过"三明治"杂交被捕获到96孔板表面。洗去未结合探针后,将结合在mRNA靶标上的连接探针进行连接,得到两端为特殊设计序列的单链扩增模板。再用通用引物进行染料法qPCR扩增,或在端部设计TaqMan探针序列,用通用引物和通用TaqMan探针进行探针法qPCR扩增。评价这一基于捕获和连接扩增的方法(CLIP-PCR)的灵敏度、特异性和重复性并与普通的RT-qPCR方法进行比较,将其应用于临床样品的检测。结果该CLIP-PCR具有较高的灵敏度和特异性。与普通的RT-qPCR一样,均可检测低至11拷贝数的s25 mRNA靶标;而且该CLIP-PCR操作更简便。该CLIP-PCR可准确检测到疟疾患者血液中的雌性配子体。可将96个样品的检测时间缩短至3 h。结论建立了灵敏高效的染料法和通用TaqMan探针法CLIP-PCR检测疟原虫雌性配子体,为疟疾传播的控制、配子体大规模筛查奠定了基...     

一种基于酶标纳米金探针的蛋白质检测方法

目的研究酶标纳米金探针的制备条件,并构建利用酶标纳米金探针检测蛋白质的检测体系,实现对蛋白质的高灵敏度检测。方法首先标记捕获抗体的磁珠探针、抗原及标记检测抗体和辣根过氧化物酶（Streptavidin—peroxidase,SA．HRP）的纳米金探针（AuNP probes）进行免疫反应形成三明治结构,然后利用磁力分离器收集三明治结构,再加入四甲基联苯胺（Tetrabenzidine,TMB）溶液发生酶促显色反应,最后在450nm处进行分光光度检测,从而间接测定蛋白质含量。结果通过一系列优化实验建立检测体系,具体为：纳米金探针重悬液确定为50mmol Tris（pH7．8,1．25％蔗糖,0．2％BSA,0．05％PEG,0．05％PVP,0．15％Tween20）：检测体系中纳米金的最适加入量为3μl;2步孵育最适时间依次为1h和45min。使用该方法检测并绘制癌胚抗原（CEA）标准曲线,表明CEA浓度在250pg／ml—25ng／ml区间时线性关系良好,R^2为0．991。通过灵敏度实验表明该检测体系的最低检测灵敏度为25pg／ml,而传统ELISA方法的检测灵敏度仅为1．65ng／ml。结论酶标纳米金探针检测体系实现了通过普通光学仪器进行高灵敏度蛋白质检测的目标,是一种很有发展前景的蛋白质检测技术。     

二重逆转录—聚合酶链反应及微孔板反向杂交法检？…

目的 为适应临床上需同时检测庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染情况，建立了二重逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）及微孔板反向杂交法。方法 根据ＨＣＶ与ＨＧＶ基因与ＨＧＶ特异探针微孔板反向杂交检测ＣＰＲ产物。结果 ＰＣＲ产物经测序，ＨＣＶ与Ｔａｋａｍｉｚａｗａ等及Ｃｈｏｏ等报道的核苷酸同源性分别为９３．１％￣９４．１％与９２．５％￣９３．７％，ＨＧＶ与Ｓｉｍｏｎｓ等、Ｌｉｎｎｅｎ等     

肺炎大鼠心肌TNF-α、IL-6mRNA表达及腺苷对其影响

目的:观察金葡菌感染大鼠肺炎时心肌组织TNF-α、IL-6mRNA表达, 以及腺苷对其影响。方法:50只SD大鼠被随机分为5组, 为对照组、肺炎组和腺苷治疗A、B、C组。金葡菌经气管插管注入复制肺炎大鼠模型, 于注菌后第2、3、4d静脉点滴腺苷治疗, 每天90min, 剂量分别为50、100、150μg·kg^-1·min^-1。第5d处死大鼠, 立即取心脏液氮保存, 心肌组织用于病理检测和采用RT-PCR方法检测TNF-α、IL-6mRNA的表达。结果:(1)肺炎组心肌中TNF-α、IL-6mRNA的表达显著高于对照组(均P<0.01);(2)腺苷治疗B、C组心肌中TNF-α、IL-6mRNA的表达低于肺炎组(P<0.01), 且治疗C组心肌IL-6mRNA表达低于治疗B组(P<0.01);而A组心肌中TNF-α、IL-6mRNA的表达与肺炎组无明显差异(P>0.05);(3)腺苷治疗可以减轻心肌的病理损伤(P<0.01)。结论:金葡菌感染大鼠肺炎可致心肌损害, 细胞炎症因子IL-6和TNF-α参与心肌损伤的发生和发展, 外源性腺苷治疗可抑制炎症因子TNF-α、IL-6的分泌, 从而有利于减轻炎症和保护心肌。     

IL-13 cDNA探针的制备及应用

采用缺口平移的方法用生物素标记hIL-13的cDNA片段作为探针,检测传代培养的肿瘤细胞株中IL-13的基因表达,RNA斑点杂交和Northern杂交的结果均显示这些肿瘤细胞株有不同程度IL-13基因的表达.该探针本身的显色灵敏度较高,用5～10pg量的探针点膜可见明显的显色.探针的特异性良好,含IL-13mRNA的核酸杂交结果呈阳性,而不表达IL-13基因的RNA与该探针的杂交结果呈阴性.IL-13cDNA探针的制备为进一步研究IL-13的生物学特性提供有效的手段.     

弓形虫IgG时间分辨免疫荧光分析法的建立

建立了高灵敏弓形虫-IgG的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)检测方法.样品或参考标准加入到由弓形虫抗原包被的96孔微孔板上,用Eu3+标记羊抗人IgG,建立间接弓形虫-IgG TRFIA检测法.本法检测范围为0.7～200 U/mL, 灵敏度为0.7U/mL;方法的平均批内和批间CV分别为4.5%和5.6%;标准曲线可测范围为0.7～14U/mL. 本文建立的弓形虫-IgG的TRFIA法灵敏度高、稳定性好,具有良好的应用前景.     

CCK-8抑制LPS诱导大鼠肺间质巨噬细胞TNF-α转录及NF-κB活性

目的:观察硫酸化八肽胆囊收缩素(CCK-8)对体外脂多糖(LPS)诱导大鼠肺间质巨噬细胞(PIMs)TNF-α基因表达的影响,探讨核因子κB(NF-κB)是否参与这一过程,以揭示CCK-8抗炎作用的信号转导机制。方法:分离大鼠肺PIMs,经LPS、CCK-8、CCK受体拮抗剂丙谷胺及溶剂单独或联合应用孵育3h,用RT-PCR技术检测细胞TNF-αmRNA的表达,孵育1h,用电泳迁移率改变分析方法检测NF-κB活性,孵育30min,用Westernblot技术检测胞浆IκBα蛋白表达情况。结果:CCK-8(10^-8-10^-6mol·L^-1)明显降低了LPS诱导的TNF-αmRNA表达及NF-κB活性,增加了胞浆中IκBα蛋白水平,呈剂量依赖性,并可被丙谷胺所拮抗。结论:对LPS激活的肺PIMs,CCK-8通过抑制NF-κB活性而抑制其TNF-αmRNA表达,该作用由CCK受体介导,并与CCK-8减少IκBα蛋白降解有关,此为CCK-8抗炎作用的机制之一。     

利用亲和捕获法筛选杂交体(SHAC):一种获得染色体特定区带富集的cDNA片段的方法

作者介绍了一种分离染色体特定区带cDNA片段的方法——利用亲和捕获法筛选杂交体(SHAC)。 在倒置显微镜下切割持定的染色体或染色体区带,然后用DOP-PCR进行两轮扩增,PCR产物用生物素标记后进行原位杂交检则其特异性;以特定组织的mRNA为模板构建cDNA文库,在cDNA的两端都加上一个连接体接头。生物素标记的PCR产物用Cot-1基因组DNA封闭重复顺序后与变性的cDNA文库在液相中杂交,杂交后用带有链霉亲和素的磁珠捕获带生物素的杂交体,然后用碱变性法释放所捕获的cDNA并进行PCR扩增。为了检测所     

C反应蛋白对人外周血CD14单核细胞TLR4信号转导的影响

目的: 观察C反应蛋白(CRP)对CD14⁺单核细胞Toll样受体4(TLR4)表达的影响,以探讨CRP在急性冠脉综合征(ACS)致炎机制中的作用。方法: 不同浓度(5、25、50、100 mg/L)和不同作用时间(6、12、24、48 h)的CRP刺激正常人外周血CD14⁺单核细胞,或者不同浓度TLR4抑制剂预先干预CD14⁺单核细胞后,再给予CRP刺激。应用流式细胞仪检测细胞表面TLR4蛋白的表达,定量PCR方法检测TLR4 mRNA和髓样分化蛋白2(MD-2)mRNA表达,ELISA检测刺激前后细胞上清液肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、金属蛋白酶9(MMP-9)水平。结果: CRP可剂量依赖和时间依赖地增加CD14⁺单核细胞表达TLR4和MD-2,高浓度TLR4抑制剂可完全阻断CRP对TLR4、MD-2的影响。TNF-α、IL-6、MMP-9与TLR4、MD-2也呈现相同的变化。结论: CRP可激活正常人CD14⁺单核细胞TLR4信号转导途径,并诱导产生TNF-α、IL-6、MMP-9,提示CRP可作为病原相关分子模式(PAMP),通过TLR4模式受体介导而产生炎症反应,参与动脉粥样硬化形成,促进ACS炎症的发展。     

增加5''''RACE法特异性的简单改进

5'RACE（即cDNA末端快速扩增）法是克隆特定mRNA5'末端的一种快速、灵敏的方法。尤其在基因捕获（Gene－trap）中很有价值，利用5'RACE法能快速、可靠地鉴定被捕捉的外显子。但是，原有的RACE法特异性低，PCR产物在琼服糖凝胶电泳时通常出现成片条带现象；而且多数情况下特异的PCR产物不能用溴化乙锭（EB）染色显示扩增结果，尤其对于5'端GC含量高或者表达水平低的mRNAs，更易出现这种情况．因此，为了检测到特异的PCR产物，通常还需要进一步做片段大小选择性扩增或进行Southern杂交分析．我们在寻找鼠胚胎发生过程中控制生…