外周血单个核细胞miR-146a和微管相关蛋白1轻链3及红细胞沉降率与类风湿关节炎疾病活动的关系

目的观察类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者外周血单个核细胞miR-146a、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)表达及红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)变化,探讨其与RA疾病活动的关系。方法 RA患者105例为RA组,采用28处关节疾病活动度(disease activity score 28, DAS28)评分评估RA疾病活动度,分为疾病缓解组26例、低活动度组44例、中高活动度组35例。同期体检健康者105例为对照组。RA组于入院次日、对照组于体检日采集空腹静脉血,采用实时荧光定量PCR法检测外周血单个核细胞miR-146a、LC3 mRNA相对表达量,采用魏氏法检测ESR。比较RA组与对照组、不同疾病活动度RA患者外周血单个核细胞miR-146a、LC3 mRNA相对表达量及ESR;Pearson相关法分析外周血单个核细胞miR-146a、LC3 mRNA相对表达量及ESR与DAS28评分的相关性;绘制RO...     

外周血检测miR-21方法的建立及在支气管哮喘中的应用

目的设计茎环结构引物,建立外周血检测微小RNA-21(miR-21)的检测方法,并初步应用于支气管哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)样本的检测。方法设计miR-21的茎环结构反转录引物和聚合酶链反应(PCR)扩增引物,以U6为内参照,利用SYBR green实时荧光PCR检测20例支气管哮喘患者和20名健康人的外周血miR-21的表达水平,并分析2组间的差异。结果 SYBR green实时荧光PCR检测U6和miR-21含量的熔解曲线单一,PCR产物特异。在外周血中20例哮喘患者的miR-21水平明显高于20名健康人(P<0.001)。结论本实验成功建立了SYBR green荧光定量PCR检测外周血miR-21表达水平的技术平台,为miR-21在支气管哮喘发生中分子生物学机制研究建立了基础。     

重症肌无力患者外周血单个核细胞中miR-146a表达分析

目的探讨miR-146a在重症肌无力(myasthenia gravis, MG)患者外周血单个核细胞中的表达及其临床意义。方法 MG患者35例为观察组,同期体检健康者30例为对照组,采用Ficoll分层液法分离外周血单个核细胞,实时荧光定量PCR法检测2组外周血单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量;Pearson法分析MG患者单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量与定量MG评分的相关性。结果观察组外周血单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量(3.41±0.25)明显高于对照组(0.95±0.12)(P0.05);全身型MG患者外周血单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量(4.18±0.21)高于眼肌型者(3.01±0.15)(P0.05);MG患者单个核细胞miR-146a mRNA相对表达量与定量MG评分呈正相关(r=0.584,P0.001)。结论 MG患者外周血单个核细胞miR-146a表达明显上调,且与病情严重程度有关。     

肝硬化患者外周血单个核细胞中白蛋白mRNA的表达与病变进展的关系

目的：研究肝硬化患者外周血单个核细胞中白蛋白mRNA表达与病变进展的关系。方法：采用实时荧光定量PCR检测肝硬化患者血清中HBVDNA含量。采用逆转录巢式PCR分别检测代偿性肝硬化、失代偿性肝硬化和健康人外周血单个核细胞中白蛋白mRNA的表达。结果：37例肝硬化患者中21例为代偿期，16例为失代偿期。代偿期肝硬化患者血清HBVDNA阳性率为67％（14／21），HBVDNA含量为（4．3±2．1）×10^6 copies／mL：外周血单个核细胞白蛋白mRNA阳性率为14％（3／21）。失代偿期肝硬化患者血清HBVDNA阳性率为88％（14／16）．HBVDNA含量为（5．1±3．4）×10^7 copies／mL：外周血单个核细胞白蛋白mRNA阳性率为56％（9／16）。20例健康人外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA阳性率为5％（1／20）。肝硬化代偿期和失代偿期患者外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA阳性率差异有显著性（P〈0．1）。结论：HBVDNA与肝硬化患者肝脏病变进程密切相关，外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA表达与肝脏损害相关。二者可作为肝硬化病情进展的评价指标。[著者文摘]     

miR-99a对类风湿性关节炎及TH17/Treg细胞的影响

目的探讨类风湿性关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)中miR-99a的表达与辅助性T细胞17(T helper cell 17,T_H17)、调节性T细胞(regulatory cells, Treg)比率失衡的关系。方法收集于我院就诊的RA患者80例,分为活动期RA组(42例)和稳定期RA组(38例),以体检健康者42例作为健康人对照组。流式细胞术测定各组外周血PBMC中T_H17、Treg细胞数;ELISA法检测各组血清IL-17、IL-6、TFN-α、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别测定T_H17和Treg细胞特异性转录因子RORγt和FoxP3 mRNA以及RA患者PBMC中miR-99a的表达水平;western blot检测各组RORγt和FoxP3蛋白的表达水平。结果与健康人对照组相比,活动期和稳定期RA患者的T_H17细胞数、RORγt mRNA和蛋白质的表达水平均显著升高,Treg细胞数及FoxP3 mRNA和蛋白质的表达水平均显著降低(P均0.01)。活动期RA患者血清IL-17、IL-6、TNF-α、IFN-γ的表达水平均显著升高,而IL-4和IL-10的表达水平均显著降低(P均0.01)。此外,活动期RA患者T_H17细胞中miR-99a的表达水平显著升高,Treg细胞中miR-99a的表达水平显著降低(P均0.01)。Pearson相关分析结果显示,RA患者T_H17细胞中miR-99a与RORγt mRNA的表达水平呈正相关(r=0.721,P0.01),Treg细胞中miR-99a与FoxP3 mRNA的表达水平呈正相关(r=0.815,P0.01)。结论 RA患者T_H17和Treg细胞中miR-99a的表达与T_H17、Treg细胞发育分化关键转录因子RORγt、FoxP3密切相关,miR-99a可能通过影响RORγt和FoxP3,参与RA患者T_H17/Treg细胞比率失衡。     

荧光定量RT-PCR检测糖尿病病人PBMC中TGF-β1表达水平

目的：应用荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ—RT—PCR），检测糖尿病病人外周血单个核细胞（PBMC）中TGF-β1mRNA的表达水平。方法：分离外周血单个核细胞，用Trizol裂解液提取总RNA，逆转录为cDNA，在扩增体系中加入SYBR Green I，应用FQ—RT—PCR定量检测TGF-β1mRNA。结果：重组质粒测序证明插入的片断为TGF-β1特异性片断。荧光定量RT—PCR检测TGF—β1mRNA的灵敏度达10^5拷贝／ml，线性范围为10^5～10^11拷贝／ml，批内、批问变异系数分别为2．27％～2．56％和4．78％～5．22％．临床应用显示．糖果病惠者PBMC中TGF—β1 mRNA含量显著高于正常。结论：FQ-RT-PCR检测TGF-β1mRNA具有灵敏、特异、快速等特点．为临床应用提供了方法学依据。     

2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-375的表达及调控研究

目的探讨2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-375的相对表达,进一步探讨其潜在的调控机制。方法收集我院2015-2016年20例初诊的2型糖尿病患者及20例健康对照者外周抗凝全血,运用Ficoll法分离外周血单个核细胞;运用实时荧光定量PCR检测基因的相对表达量;运用生物学信息软件targetscan7.0预测miR-375调控的靶基因;采用常规法培养细胞;并构建双荧光报告基因载体验证miR-375与靶基因的结合作用。结果 PRKD1是miR-375调控的靶基因之一,miR-375在2型糖尿病患者外周血单个核细胞中呈高表达,而PRKD1呈低表达,两者的相对表达量具有负相关性。共转染WT-PRKD1-3’UTR表达载体与miR-375 mimics至HT29细胞,荧光活性明显减弱,差异具有统计学意义(P0.05),转染mut-PRKD1-3’UTR表达载体与miR-375 mimics至HT29细胞,荧光活性无显著改变(P0.05);抑制miR-375的表达,促进PRKD1的表达。结论 2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-375的表达显著升高,PRKD1是其潜在的靶基因。这为揭示2型糖尿病的发病机制提供了线索。     

荧光定量聚合酶链反应检测胃癌let-7 MicroRNA

目的建立一种快速、准确、特异、定量检测let-7 miRNA的方法并探讨其在胃癌发生发展中的意义。方法提取20例胃癌及癌旁正常胃黏膜组织总RNA,采用颈环逆转录引物进行逆转录;以let-7a micro RNA为靶基因,设计合成引物和荧光（MGB）探针;建立荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测let-7 miRNA,并检测其在胃癌组织中的表达。结果该方法检测let-7a miRNA的灵敏度为1．0×10^1拷贝;检测总RNA的下限为0．05ng。20例临床标本中,7例（35％,7／20）胃癌组织中let-7a miRNA表达明显低于其远癌端正常胃黏膜对照组织。结论应用颈环逆转录引物及MGB探针技术荧光定量PCR方法能够准确、快速、特异、敏感地检测胃癌let-7 miRNA,且其表达下调可能与胃癌的发生发展有密切关系。     

As2O3影响慢性粒细胞白血病细胞VEGF,MMP-2 mRNA表达的实验研究

目的研究As2O3对慢性粒细胞白血病（CML）骨髓单个核细胞，血管内皮生长因子（VEGF），基质金属蛋白酶2（MMP-2）mRNA及培养上清VEGF蛋白表达的影响作用，从而对白血病的发病机制及As2O3的作用机制进行探讨。方法用RT—PCR技术检测20例CML患者与5例正常人骨髓细胞MMP-2，VEGFmRNA的表达。用ELISA方法检测20例CML患者骨髓单个核细胞经As2O3作用前、后培养上清液VEGF水平的变化，用RT—PCR法检测VEGF，MMP-2mRNA表达阳性患者骨髓单个核细胞mRNA含量的变化。结果CML患者VEGF，MMP-2mRNA水平明显高于正常对照者，5&#215;10^-6mol／L As2O3可明显下调CML患者骨髓单个核细胞培养上清VEGF蛋白的表达（P〈0．05）；As2O3对骨髓单个核细胞VEGF，MMP-2mRNA的表达有下调作用，并为剂量依赖性。结论CML中VEGF与MMP-2mRNA表达异常增高。As2O3下调白血病细胞VEGF，MMP-2的表达可能是其抗白血病作用的机制之一。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血APRIL基因表达水平初探

目的 建立检测人增殖诱导配体（APRIL）mRNA的实时荧光定量PCR方法,探讨外周血单个核细胞APRIL mRNA表达水平与原发性胆汁性肝硬化（PBC）的相关性。方法 采用实时荧光定量PCR法检测30例正常人和40例PBC患者外周血单个核细胞（PBMC）APRIL基因的相对表达量,以Ct值比较法计算APRIL基因相对表达水平。结果 PBC患者外周血单个核细胞APRIL mRNA的△Ct值为9．3±2.0,与正常对照组比较．差异显著（P〈0．05）。采用2^-△△Ct法进行数据分析后,PBC组APRIL mRNA相对表达量比正常对照组高3．5倍。PBC患者中抗核抗体（ANA）阳性占80％,其中荧光模式为核膜型19例。其他型13例（着丝点型10例,混合型3例）,其APRIL基因相对表达量比正常对照组高6.5和1．7倍。结论 PBC患者外周血单个核细胞APRIL mRNA表达水平显著升高,且与ANA荧光模式相关。