脂质体介导外源基因体外转染兔角膜内皮细胞条件的优化

目的:观察阳离子脂质体LipofectamineTM 2000是否能介导目的基因转移至兔角膜内皮细胞,并优化转染条件。方法:体外培养兔眼角膜内皮细胞,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,通过体外细胞转染实验,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件,荧光显微镜观察目的基因的表达。结果:角膜内皮细胞内可见脂质体介导的绿色荧光蛋白表达,LipofectamineTM在细胞融合度为80%~90%,脂质体/DNA为3L/g,脂质体的量为1.8μL,转染时间为5h时,转染效率最高。结论:阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至角膜内皮细胞内,GFP可作为报告基因优化脂质体转染条件。     

阳离子脂质体介导的角膜内皮细胞基因转染研究

目前治疗角膜病致盲的惟一方法是角膜移植，但因供体有限且50％以上因内皮细胞密度太低而不能用。应用基因转染技术，增加活体或供体角膜内皮细胞密度有望解决这一临床难题。     

氮酮促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞及毒性的实验研究

目的探讨氮酮(AZONE)促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞的作用及其对细胞活性的影响。方法采用细胞培养方法,利用绿色荧光蛋白基因做报告基因,配制不同转染液,脂质体联合pEGFP-N1、氮酮联合脂质体及pEGFP-N1、氮酮联合pEGFP-N1、单纯pEGFP-N1、单纯脂质体、单纯氮酮,分别处理兔角膜内皮细胞,荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。用RT-PCR方法检测EGFPmRNA表达情况。采用MTT法研究不同转染液对细胞活性的影响。结果单纯氮酮、单纯脂质体及对照组处理的细胞不表达绿色荧光蛋白。氮酮联合脂质体及pEGFP2N1对兔角膜内皮细胞的转染效率为42.6%,脂质体联合pEGFP2N1组的转染效率为22.4%,氮酮联合PEGFP-N1组的转染效率为7.2%,单组质粒组的转染效率为1%。氮酮加脂质体加PEGFP-N1组转染效率高于其他转染组(P<0.01)。各组转染液对角膜内皮细胞活性无影响。结论氮酮可促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞,在有效的转染浓度下对细胞无明显毒性,有望成为促进角膜内皮细胞基因转染的新型试剂。     

脂质体介导Bcl-xL基因体外转染人角膜基质细胞的动态表达

目的:观察脂质体LipofectamineTM(LF)2000介导Bcl-xL基因在人角膜基质细胞中表达的时间规律。方法:Bcl-xL/LF2000载体复合物转染人角膜基质细胞,转染后1～15d,采用定量RT-PCR及流式细胞计数法检测目的基因Bcl-xL表达阳性细胞率,观察目的基因在角膜基质细胞中表达的时间变化规律。结果:RT-PCR及流式细胞计数法均显示:在转染后1d开始检测到Bcl-xL表达阳性细胞,阳性率在转染后3d最高(48.3%),此后逐渐降低,转染后15d有少量细胞仍表达Bcl-xL基因。结论:LF2000能有效介导外源基因Bcl-xL转染人角膜基质细胞。     

脂质体介导基因转染活体眼组织的研究

目的　了解活体内不同途径应用脂质体转染外源基因在眼组织的分布情况。方法　将包有 β 半乳糖苷酶基因质粒的脂质体DOSPER ,分别采用玻璃体腔内注射、尾静脉注射、表面点药及球后注射到小鼠体内 ,2h ,1,2天、1,2 ,4周后用 β gal染色法观察 β 半乳糖苷酶基因在眼组织内的分布情况。 结果　玻璃体腔内注射、尾静脉注射、表面点药及球后注射 4组的小鼠眼球组织包括角膜、虹膜、睫状体、视网膜 ,均有 β 半乳糖苷酶基因表达 ,除表面点药组外 ,其他 3组小鼠脉络膜也有 β 半乳糖苷酶基因表达。用药 1天后开始出现 β 半乳糖苷酶基因阳性表达 ,持续达 1个月以上。 结论　脂质体能有效、稳定地转染外源基因到活体眼组织的角膜、虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜。     

阳离子脂质体介导人小梁细胞基因转染实验研究

目的:观察脂质体是否能介导目的基因转移至人小梁细胞及脂质体潜在的毒副作用。方法:通过体外细胞转染实验优化阳离子脂质体与质粒DNA的比例,荧光显微镜观察目的基因的表达。结果:小梁细胞内可见脂质体介导的绿色荧光蛋白表达,高浓度脂质体导致细胞死亡和脱落。结论:阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至小梁细胞内。但高浓度对正常的细胞有一定的毒副作用。     

脂质体介导内皮抑素基因转移抑制兔角膜新生血管的研究

目的　探讨阳离子脂质体介导的内皮抑素 (ES)基因转移对角膜新生血管的抑制作用。方法　新西兰大白兔 30只,角膜缝线法制作角膜新生血管模型,按随机数字表法随机分为A、B、C3组。A组:缝线后立即于上方近角膜缘处结膜下注射 150μl阳离子脂质体与ES重组质粒 (含质粒 20μg)的混合液;B组:同样部位注射 150μl阳离子脂质体与空白质粒(含质粒 20μg)的混合液;C组:同样部位注射 150μl生理盐水。分别于缝线后 3、7、14、21和 28d在裂隙灯显微镜下观察各组角膜新生血管的生长情况,并计算角膜新生血管的面积。通过免疫组化方法检测各时相角膜缘及角膜组织中ES目的基因的表达情况。结果　A组角膜新生血管的出现时间为 ( 6 85±0 69 )d,B组为(3 43±0 53)d,C组为(3 14±0 69)d, 3组间比较差异有统计学意义 (F=100 24, P<0 05 ),A组明显晚于其他两组;在缝线后 14、21、28d,A组角膜新生血管的面积均明显小于其他两组,差异有统计学意义(F=72 662, 75 601, 27 729; P均<0 05)。A组于各观察时相均可在上方角膜缘和角膜组织中发现ES阳性表达,以转染 3d时最为明显, 7d时阳性细胞着色有所变浅, 14d时阳性细胞数明显减少, 28d时只偶见阳性表达;各时相下方角膜及角膜缘组织均未见ES阳性表达。B、C两组各时相均未发现ES阳     

应用全自动角膜内皮细胞分析仪对保存兔角膜内皮细胞定量研究

目的研究保存的兔角膜内皮细胞活性四项定量指标的变化.方法应用非接触式眼库镜及计算机角膜内皮细胞形态定量分析系统对42只(84片)实验兔角膜内皮细胞进行四项指标(平均细胞面积、细胞密度、六棱细胞比率、变异系数)定量分析,并同时检测内皮细胞活性率,其结果进行对比研究.结果改良K3液组与K液对照组保存5天时,四项指标两组无显著性差异(P＞0.05),保存7、10天时,四项指标两组有显著性差异(P＜0.05).改良K3液组及K液组分别与正常兔组进行比较改良K液组在保存10天时,四项指标与正常兔组差异有显著性(P＜0.05).K液对照组在保存7、10天时,四项指标与正常兔组差异有显著性(P＜0.05).改良K3液组在保存10天时,内皮细胞活性率在93.36±1.96%,而四项指标与正常兔组差异已有显著性.K液对照组在保存7、10天时,内皮细胞活性率分别为90.84±1.9%,79.8±4.48%,四项指标均与正常兔组差异有显著性.结论完整的评价角膜植片的活性,单纯依靠既往的内皮细胞活性率测定是不全面的,在有条件的情况下应同时结合四项定量指标进行综合评价,才能确保供体角膜片的质量.     

阳离子脂质体介导的p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响

目的 探讨阳离子脂质体介导的外源标志基因LacZ转染人角膜基质细胞的有效性和安全性及p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响。方法 （1）利用阳离子脂质体lipofectamine^TM reagent介导的外源标志基因LacZ的质粒DNA转染人角膜基质细胞,行X－gal染色,确定转染率;（2）利用免疫细胞化学和四甲基偶氮唑盐法,观察阳离子脂质体lipofectamine^TM reagent介导p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响;（3）用0．5％锥虫蓝染色观察各组细胞活性率。结果 阳离子脂质体lipofectamin^TM reagent可介导含标志基因LacZ的质粒DNA对人角膜基质细胞的转染,在1：4和1：8两组中均观察到转染率随转染时间延长而增高,随观察时间延长而降低,在质粒DNA／脂质体比例为1：8,转染时间为24h,观察2d时达高峰,为40．5％;阳离子脂质体lipofectamine^TM reagent介导外源p21WAF1基因转染可提高人角膜基质细胞中p21蛋白的表达,并抑制该细胞的增殖;0．5％锥虫蓝染色显示各组细胞活性率均≥90％,未见明显细胞毒性。结论 阳离子脂质体可介导外源目的基因对人角膜基质细胞安全、相对高效的转染;其介导的p21WAF1基因转染可抑制人角膜基质细胞的增殖;并无明显细胞毒性反应。     

Lipid-mediated gene transfer of acidic fibroblast growth factor into human corneal endothelial cells

The aim of this study was to optimize non-viral gene transfer conditions and investigate the effect of fibroblast growth factor-1 (FGF-1) gene transfer on human corneal endothelial cell (HCEC) proliferation. Five non-viral vectors (Lipofectin, DMRIE-C, DAC-30, Effectene, FuGene6) were used to transfect HCEC with plasmids coding for enhanced green fluorescent protein (EGFP) and FGF-1. Transfection efficiency and toxicity (n=6) were quantified and optimized using the EGFP construct by FACS-analysis. Using optimal conditions HCEC were transfected with the FGF-1 plasmid and cell proliferation as well as expression of FGF-1 were determined at days 4 and 7 by counting and western blotting, respectively. Lipofectin (17+/-2.02%) transfected HCEC more successfully than DMRIE-C (11+/-1.46%), Effectene (9+/-0.62%), FuGene (9+/-0.93%) and DAC-30 (7+/-0.59%). Toxicity of the lipids ranged from 2 to 4%. Optimal HCEC proliferation was achieved with DAC-30/FGF-1 (P<0.05), whereas all other vectors did not result in significantly increased cell proliferation. However, all of the transfected cells produced FGF-1 in different amounts as indicated by western blotting. Efficient and almost non-toxic transfer of the FGF-1 gene into HCEC can be successfully achieved by lipid-based techniques. Using optimal conditions significantly increased cell proliferation was independent on gene transfer efficiency. This may indicate that even a low transfection rate is sufficient to produce a concentration of FGF-1 that will have a stimulatory effect on HCECs.     

小梁切除手术前后角膜内皮细胞观察

目的:观察小梁切除术对角膜内皮细胞有无影响.方法:采用非接触型角膜内皮显微镜,对40例56眼行小梁切除术的患者,做术前术后角膜内皮细胞密度和细胞形态学的检测.结果:行青光眼小梁切除术的患者40例56眼,除了4眼有2度浅前房的患者外,其余52眼术前角膜内皮细胞密度均值为2 580.90±323.20个/mm2,术后1 wk均值为2 558.28±341.83/mm2,细胞形态学方面,最大细胞面积、最小细胞面积、平均细胞面积、细胞面积标准差、细胞面积变异系数、六角形细胞百分数术前术后无显著性差异(P＞0.05).结论:在通常情况下,小梁切除术不会对角膜内皮细胞产生不良影响.     

The study of human PDGF-B gene transferred to cat corneal endothelial cells

AIM: To demonstrate that human platelet-derived growth factor-B (PDGF-B) cDNA could be expressed in primary cultured cat corneal endothelia cells by using gene transfer techniques; to explore a useful tool for the further studies of the molecular mechanisms of corneal endothelium failure and provide a potential effective genetic therapy for the blind patients. METHODS: Human PDGF-B cDNA was isolated from human placent by RT-PCR and inserted into pcDNA4 vector to construct recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA4-PDGF-B. The full length was confirmed by the DNA sequencing analysis. By tearing endothelium technique we obtained pure single layer of cat corneal endothelial cells. The pcDNA4-PDGF-B eukaryotic expression vector was transferred into cat corneal endothelial cells by EffecteneTM lipofectine. The transfection efficiency of EffecteneTM lipofectine in pcDNA4-B was detected with pcDNA4-GFP. 5 days later, RT-PCR was used to check the PDGF-B expression. Cell viability was tested by modified tertrozalium salt (MTT) method. Cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope. RESULTS: The human PDGF-B cDNA was isolated successfully from healthy parturien placent tissue and the sequence was confirmed by computer automatic sequence and PCR analysis. Pure single layer cat corneal endothelial cells were successfully cultured by tearing endothelium technique. EffecteneTM lipofectine transfection technique could be effectively used to transfer pcDNA4-PDGF-B into cat corneal endothelial cells in vitro, the transfection efficiency was 30%. RT-PCR result showed that human PDGF-B gene was highly expressed in transfected cat corneal endothelial cells. The expressed PDGF-BB protein promoted the viability of cat corneal endothelial cells. CONCLUSION: Human platelet-derived growth factor-B (PDGF-B) cDNA could be highly expressed in cultured cat corneal endothelial cells by gene transfection techniques. Expressed PDGF-BB protein significantly promoted the viability of cat corneal endothelial cells, thus provided a potential effective method for corneal endothelium blindness genetic therapy.     

角膜葡萄膜炎患者角膜内皮细胞相关性分析

目的:探讨角膜葡萄膜炎患者角膜内皮细胞在治疗前后相关参数的变异和临床意义。方法:对我院眼科2012-10/2013-12收治的角膜葡萄膜炎患者52例52眼,在治疗前后分别应用非接触型角膜内皮细胞仪测量角膜内皮细胞的相关参数,并进行统计学分析。结果:与正常组比较,患病组内皮细胞水肿明显,变异大;治疗时间越短,内皮细胞恢复越好,细胞丢失越少;反之,愈合时间越长,正常六边形细胞比率越小,变异系数较大。治疗前后各参数比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:患者病程直接影响角膜内皮细胞功能的恢复。     

前葡萄膜炎患者角膜内皮细胞的计算机图像分析

目的探讨前葡萄膜炎患者角膜内皮细胞相关参数的变化及其临床意义。方法选择我院收治的前葡萄膜炎患者115例(115眼),分为首次发病组(45例)、首次复发组(35例)、多次复发组(35例),并将首次发病组按病程分为2～4周组、4～8周组、8～12周组,另设正常对照组35例(35眼)。应用非接触型角膜内皮细胞仪测量角膜内皮细胞的相关参数,并对结果进行统计学分析。结果首次发病组六边形细胞百分比与细胞面积变异系数分别为(53.8±5.4)%、(33.8±5.4)%,与正常对照组(55.7±5.7)%、(31.6±2.9)%比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05);首次复发组最大细胞面积、细胞面积变异系数、六边形细胞百分比分别为(769.8±103.0)μm2、(34.3±6.1)%、(53.2±6.9)%,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05);多次复发组各参数与正常对照组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。8～12周组细胞面积变异系数与2～4周组、4～8周组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05);8～12周组六边形细胞百分比与2～4周组比较,差异有统计学意义(P<0.05);各组间其余参量比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论前葡萄膜炎对角膜内皮有明显影响,角膜内皮细胞损害与前葡萄膜炎发病频数呈正相关,与病程及疾病严重程度有直接关系。     

角膜内皮细胞治疗研究进展

人角膜内皮细胞(HCECs)是一种有丝分裂后的单层内皮细胞,因此,其在体内和体外的增殖能力十分有限。HCECs在严重受损的情况下会发生内皮失代偿,极易引起失明。目前,唯一有效的治疗方法是使用含健康角膜内皮的供体植片进行角膜移植。因此,世界范围内供体材料的严重短缺推动了对角膜内皮替代来源的研究。随着HCECs的细胞培养研究的不断开展,细胞治疗为角膜内皮失代偿提供了希望。本文对角膜内皮细胞治疗方面的最新研究进展进行综述。     

白内障超声乳化手术与角膜内皮细胞损伤

白内障是目前眼科最常见的致盲性眼病,超声乳化手术以切口小、反应轻、术后恢复快已被世界公认为最先进而成熟的主流手术方式。现代白内障手术从复明手术逐渐向以改善视功能为目标的屈光性手术发展。角膜作为屈光系统中最重要的组织,其透明度的维持很大程度上取决于角膜内皮细胞的功能,白内障手术不可避免地在一定程度上损伤角膜内皮细胞,由此引起的角膜水肿、混浊甚至失代偿等并发症严重的影响了白内障患者术后视力的改善,本文对白内障超声乳化手术及其角膜内皮细胞损伤因素进行综述。