糖基化终产物对人肾系膜细胞MMP-2表达的影响

目的：观察糖基化终产物（advanced glycosylation end products,AGEs）对人肾系膜细胞（human renal mesangial cell,HRMC）基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase,MMP-2）表达的影响。方法：运用糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）干预体外培养的HRMC,Western blot检测系膜细胞MMP-2蛋白表达。结果：HRMC的MMP-2蛋白表达水平随AGE—BSA浓度增加和干预时间延长而降低（P〈0．01）。结论：MMP-2可能参与AGEs所致的糖尿病肾病的发生发展。     

依贝沙坦对糖基化终产物诱导的肾系膜细胞增殖的影响

目的观察依贝沙坦对糖基化终产物（AGEs）干预的人肾小球系膜细胞（HRMC）增殖的影响。方法用4-甲基偶氮四唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法观察AGEs对HRMC的增殖作用，以及不同作用时间和不同浓度依贝沙坦对这种增殖作用的影响，并通过流式细胞仪检测细胞周期变化。结果依贝沙坦在一定范围内以时问依赖和剂量依赖关系抑制糖基化终产物诱导的肾小球系膜细胞过度增生，并使G0～G1期细胞比例增高。S期细胞数减少。结论依贝沙坦能够抑制AGEs诱导的HRMC增生。这种作用可能是通过抑制细胞分裂、复制实现的。     

糖基化终产物对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素-3基因表达的影响

目的:研究糖基化终产物(AGEs)对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素-3(galectin-3)表达的影响。方法:将培养的人肾小球系膜细胞(HRMC)用不同浓度(50、100、200及400 mg.L-1)的AGEs干预24 h或同一浓度(200 mg.L-1)的AGEs干预0、24、48及72 h,以无血清培养基(DMEM)和相应浓度的牛血清白蛋白(BSA)为对照。用RT-PCR检测细胞中半乳糖凝集素-3的mRNA水平。结果:不同浓度AGEs组HRMC的半乳糖凝集素-3 mRNA水平与对照组相比均有显著差异(P<0.01),且随着AGEs浓度的增高,半乳糖凝集素-3 mRNA水平也逐渐增高(P<0.05);AGEs干预HRMC 24、48、72 h,半乳糖凝集素-3mRNA水平与对照组相比有显著差异(P<0.05),且随着干预时间的延长,半乳糖凝集素-3 mRNA水平也逐渐增高(P<0.01)。结论:AGEs以时间及剂量依赖的方式促进HRMC半乳糖凝集素-3 mRNA的表达。     

糖基化终产物对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子及纤维连接蛋白基因表达的影响

目的：探讨体外培养条件下糖基化终产物（AGEs）对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子（CTGF）及纤维连接蛋白（FN）基因表达的影响。方法：用不同浓度体外制备的AGEs干预系膜细胞及同一浓度的AGEs干预细胞不同时间。应用RT-PCR检测细胞中CTGF和FN的mRNA水平。结果：随着AGEs干预浓度的增加或干预时间的延长,系膜细胞CTGF和FNmRNA水平与对照组相比显著上升。结论：AGEs可导致人肾小球系膜细胞CTGF和FNmRNA的表达增加,在糖尿病肾病的发生、发展中起一定作用。     

AGEs-BSA 对人肾系膜细胞分泌RANTES的影响初探

目的探讨糖基化终产物(AGEs)对人肾系膜细胞(HRMC)分泌正常T细胞表达的调节活化蛋白(RANTES)的影响.方法常规制备糖基化终产物-牛血清白蛋白(AGEs-BSA),干预体外培养的HRMC,用ELISA法检测培养上清RANTES水平.结果AGEs-BSA(640mg*L-1) 干预HRMC后8h,培养液中RANTES水平开始逐步升高,于48h达峰值,对照组BSA则未见升高(P<0.01).结论AGEs呈时间依赖方式增加HRMC对RANTES的分泌.     

氨基胍对糖基化终产物干预后人肾系膜细胞fractalkine表达的影响

目的观察氨基胍(AG)对体外制备的糖基化终产物(AGEs)诱导的人肾系膜细胞(HRMC)趋化因子fractalkine表达的影响。方法分别给予无血清的DMEM培养基、牛血清清蛋白(BSA)、糖基化终产物-牛血清清蛋白(AGE-BSA)干预HRMC,以及不同浓度AG与AGE-BSA共同干预HRMC 24 h;采用RT-PCR和Western-blot法分别检测HRMC fractalkine mRNA和蛋白表达。结果与DMEM、BSA组相比,AGE-BSA明显升高HRMC frac-talkine mRNA和蛋白表达(P<0.05),AG以浓度依赖的方式下调HRMC fractalkine mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论 AG可能通过拮抗AGEs对fractalkine表达的增加作用而发挥其肾脏保护作用。     

晚期糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞分泌炎症性趋化因子的影响及机制

目的 观察晚期糖基化终产物(AGE)对血管平滑肌细胞(VSMC)分泌单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白细胞介素8(IL-8)的影响并初步探讨可能的细胞内信号转导机制.方法 分离、培养原代大鼠VSMC并进行鉴定.采用糖基化血清白蛋白(GSA)模拟AGE,观察不同浓度GSA(10、100和500 μg/ml)对VSMC分泌MCP-1和IL-8的影响和时间曲线;并对其进行细胞增殖率校正以消除VSMC数量增加对测定的影响;p38MAPK抑制剂(SB203580)、ERK1/2抑制剂(PD98059)及NF-κB抑制剂(PDTC)、Proteasome抑制剂(MG132)预处理后观察GSA刺激VSMC分泌MCP-1和IL-8水平的改变.结果 与空白对照组相比,100 μg/ml GSA作用24 h VSMC分泌MCP-1(13.01ng/ml±0.12ng/ml比7.02 ng/ml±0.26 ng/ml,P＜0.05)和IL-8(12.6ng/ml±0.86 ng/ml比3.07 ng/ml±0.35ng/ml,P＜0.05)水平最高.经过细胞增殖校正后,GSA仍然能够促进VSMC表达MCP-1和IL-8.MAPK抑制剂和NF-κB抑制剂预处理后发现PDTC(10 μmol/L)、SB203580(5 μmol/L)以及MG132(10 μmol/L)可以抑制GSA刺激VSMC表达MCP-1和IL-8.结论 GSA可以促进VSMC分泌致炎性趋化因子MCP-1和IL-8,这种作用独立于细胞增殖,可能是通过激活细胞内p38MAPK信号转导通路,促进核因子NF-κB的活化而实现.

Abstract：

Objective To investigate the effects of advanced glycation end products (AGEs) on the secretion of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and interleukin-8 (IL-8) in vascular smooth muscle cells (VSMCs) and explore its possible intracellular signaling mechanism. Methods Primary rat VSMCs were isolated and identified. VSMCs were treated with glycation serum albumin (GSA), an important component of AGEs, in series of concentrations and time. The role of MAPK and NF-κB inhibitors was confirmed. The levels of MCP-1 and IL-8 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results VSMCs were treated with GSA at the doses of 10 μg/ml, 100 μg/ml and 500 μg/ml respectively. In comparison with the control group, the levels of MCP-1 ( 13.01 ng/ml ± 0.12 ng/ml vs 7. 02 ng/ml ±0. 26 ng/ml, P＜0.05) and IL-8 (12. 6 ng/ml ±0. 86 ng/ml vs 3. 07 ng/ml ±0.35 ng/ml,P＜0.05) increased in the GSA-treated group, especially at the concentration of 100 μg/ml. After adjustment for cells proliferation, the levels of MCP-1 and IL-8 were still higher in the GSA-treated group.After a pretreatment of PDTC ( 10 μmol/L), SB203580 (5 μmol/L) and MG132 ( 10 μmol/L), the levels of MCP-1 and IL-8 decreased. However, it had no change when pretreated with PD98059 (20 μmol/L).Conclusion GSA promotes the secretion of MCP-1 and IL-8 in VSMCs. Such an effect is not dependent on cellular proliferation. It may be realized through an activation of NF-κB by p38MAPK-sensitive intracellular signaling pathway.     

细胞内活性氧在晚期糖基化终产物促肾小球系膜细胞合成纤维连接蛋白中的作用

目的 观察晚期糖基化终末产物(AGEs)对大鼠肾小球系膜细胞合成和分泌纤维连接蛋白的影响及细胞内活性氧(ROS)在其中的作用.方法 在体外制备AGEs,分别用不同浓度的(0,100,500,1000 μg/mL)AGEs及抗氧化剂N-酰-L-半胱氨酸(NAC 30 mmol/L)作用于肾小球系膜细胞,以氧化敏感的荧光染料2、7-二氢二氯荧光素(DCFH)染色,流式细胞仪测定细胞内ROS强度;再用RT-PCR和ELISA方法测定系膜细胞中纤维连接蛋白的表达.结果 AGEs能使细胞内ROS水平明显升高(P<0. 05),呈现浓度依赖效应;AGEs同时以时效和量效方式促进肾小球系膜细胞中纤维连接蛋白基因和蛋白的表达(P<0.05);而NAC能够明显抑制AGEs所致的细胞内ROS升高,同时抑制肾小球系膜细胞中纤维连接蛋白的合成和分泌(P<0. 05).结论 AGEs可能部分通过诱导细胞内ROS,促进肾小球系膜细胞表达分泌纤维连接蛋白,从而引起肾小球系膜基质增生,最终导致肾小球纤维化,而抗氧化治疗可能有助于阻止糖尿病肾病的氧化应激损害和肾小球纤维化的发展进程.     

糖尿病肾病患者血清CC趋化因子升高并与AGE-肽相关

目的:观察糖尿病肾病(DN)患者血清单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和受活化调节、由正常T细胞表达分泌的趋化蛋白(RANTES)水平,并探讨它们与糖基化终产物-肽(AGE-P)的相互关系。方法:设健康对照(NC)组46例,糖尿病(DM)患者176例分为正常蛋白尿(DM N)组、微量白蛋白尿(DM Mi)组及显性蛋白尿(DM Ma)组。流动注射分析法检测血清AGE-P,ELISA法检测血清MCP-1和RANTES。结果:(1)DM患者血清MCP-1、RANTES和AGE-P水平均明显高于NC组(均为P<0.01);(2)DM Ma组和DM Mi组血清MCP-1水平均显著高于DM N组(均为P<0.05);(3)DM Ma组血清AGE-P水平明显高于DM Mi组和DM N组(P<0.05和P<0.01);(4)DN患者血清AGE-P与RANTES及MCP-1水平之间呈正相关(r=0.31,P<0.05;r=0.53,P<0.001)。结论:DM患者血清AGE-P、RANTES和MCP-1水平升高;血清AGE-P及MCP-1水平与DN病变程度平行,DN患者血清AGE-P与RANTES及MCP-1呈正相关。     

晚期糖基化终产物对人肝癌细胞HepG2耐药性的影响

目的:探讨晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对肝癌细胞耐药性的影响及其机制。方法:体外培养人肝癌细胞HepG2,以终浓度分别为100、200、400μg.ml-1的AGEs联合2 000 nmol.L-1盐酸阿霉素(adramycin,ADM)处理细胞24 h,并设空白对照和ADM组进行比较。应用倒置显微镜观察不同浓度AGEs联合ADM孵育下HepG2形态学变化,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期的改变,应用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞株活性,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)测定不同浓度AGEs作用下,HepG2细胞多药耐药基因(multidrug resistance-1,MDR1)蛋白表达情况。结果:在2 000 nmol.L-1ADM作用下,HepG2细胞生长停滞或死亡,而AGEs能促进细胞生长,抑制其死亡。细胞周期和细胞活性实验表明,与ADM组相比,随着AGEs浓度增加,G1期细胞百分率显著下降,S期及G2期细胞增加,细胞活性有上升趋势。Western blotting检测表明AGEs能增加MDR1的蛋白表达。结论:AGEs能通过促进MDR1基因的表达,降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

人肝脏星状细胞糖基化终产物受体表达的研究

目的　研究人肝脏星状细胞（ ＨＳＣ） 上糖基化终产物受体（ＲＡＧＥ） 的表达。方法　用生物素将体外制备的糖基化终产物（ ＡＧＥｓ － ＢＳＡ） 标记成配基,以细胞化学法显示细胞表面受体高亲和性结合。用反转录聚合酶链反应（ ＲＴ－ＰＣＲ） 检测ＡＧＥｓ 受体基因的表达。结果　细胞化学法显示ＡＧＥｓ － ＢＳＡ 与ＨＳＣ 呈高亲和性结合,部分被内化。用按人ＲＡＧＥ 基因序列设计的引物,反转录扩增出２８３ ｂｐ ＤＮＡ 片段。结论　人肝脏星状细胞表达的ＡＧＥｓ 受体可能在糖尿病人加速的肝纤维化过程中起一定作用     

糖基化终产物对人肾小管上皮细胞Fractalkine表达的影响

目的 既往实验已观察到糖基化终产物(advanced glycation end products, AGE)可增加人肾系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)、RANTES等表达,fractalkine(FKN)在糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)中的作用尚不明确.本实验探讨AGE对人肾小管上皮细胞(tubular epithelial cells, TEC)株HK-2 FKN表达的影响.方法 运用AGE-BSA按不同的时间和浓度干预HK-2,分别用RT-PCR和ELISA法检测FKN mRNA的表达及蛋白分泌;用AGE-BSA及AGE-BSA加FKN中和抗体分别干预HK-2,用Transwell小室、共培养及荧光染色法检测HK-2趋化和黏附单核细胞株U937的功能.结果 AGE-BSA干预组的HK-2 FKN的mRNA表达和蛋白分泌较对照组显著增加(P＜0.05),且随干预时间和浓度的增加而进一步增加.AGE-BSA干预组HK-2趋化及黏附的U937数较对照组和加FKN抗体组明显增加(P＜0.01). 结论 AGE可能部分通过FKN/CX3CR1途径参与DN肾小管间质病变的发生发展.     

人晚期糖基化终产物受体胞质内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的 构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化，研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法 采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段。并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后，转化大肠杆菌BL21，以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果 PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST／hRAGE-C原核表达载体完全正确，继而表达、纯化获得了相对分子质量约35000的融合蛋白(符合预期大小)。结论 将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。     

IL—1β对人肾系膜细胞合成和分泌细胞外基质的影响

目的：探讨IL－1β对人肾小球系膜细胞合成和分泌细胞外基质（ECM）的影响。方法：利用ELISA法和放免法分别检测IL－1β对人肾小球系膜细胞刺激后培养上清FN、PCⅢ、Ⅳ．C的水平。结果：IL－1β对人肾小球系膜细胞合成和分泌FN、PCⅢ、Ⅳ．C具有明显的刺激作用（与对照组相比,P＜0．05）,在刺激24h时的作用最强。结论：IL－1β可能通过增加FN、PCⅢ、Ⅳ．C的合成和分泌,引起ECM的积聚,致肾组织进行性纤维化和硬化。     

针刺艾灸推拿治疗对膝骨关节炎RANTES和MCP-1表达影响研究

目的：观察针灸推拿对膝骨性关节炎的镇痛疗效和对RANTES及MCP-1表达的影响,探讨针灸推拿膝骨性关节炎的镇痛抗炎机理。方法：采用随机原则将膝骨关节炎患者分为艾灸组、毫针组、推拿组,共63例患者,连续治疗1周。分别于治疗前后采用疼痛VAS评分比较,抽取膝关节滑液分离细胞,检测RANTES及MCP-1表达变化,观察比较各疗法的镇痛疗效和对RANTES及MCP-1调控机制。结果：三组均有明显的镇痛效果,艾灸组和推拿组治疗后RANTES及MCP-1显著降低,推拿组具有更强的抑制RANTES和MCP-1表达的作用,统计学有显著性差异。结论：针灸推拿对膝骨关节炎止痛效果良好,在抑制RANTES及MCP-1介导的炎症反应方面,毫针疗法没有显示抑制作用,艾灸和推拿疗法具有明显的抑制作用,且推拿疗法优于艾灸疗法。     

补脾肾活血中药对糖尿病大鼠肾皮质糖基化终产物受体mRNA表达的影响

目的观察补脾肾活血中药对糖尿病大鼠肾皮质糖基化终产物(AGEs)含量及其受体mRNA(RAGE mRNA)表达的影响,探讨补脾肾活血中药防治糖尿病肾病(DN)的机制.方法采用链脲佐菌素(STZ)左下腹腔内单次注射造成糖尿病大鼠模型,随机分糖尿病组、中药组及氨基胍组,另设正常对照组.用荧光光谱法测定肾皮质AGEs含量,用RT-PCR的方法检测肾皮质RAGEmRNA的表达.结果糖尿病组大鼠肾皮质AGEs含量明显增加,RAGE mRNA出现过度表达.中药组治疗12周后肾皮质AGEs含量明显减少,RAGE mRNA表达明显下调,与糖尿病组比较都有显著差异(P＜0.01).结论补脾肾活血中药能够通过减少AGEs在肾皮质的积累,下调糖尿病大鼠肾皮质RAGE mRNA的过度表达,从而防治糖尿病肾病.     

晚期糖基化终产物与其受体相互作用对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响

目的 糖尿病患者结肠癌的发病率显著高于非糖尿病人群,晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)在糖尿病患者体内生成明显增多.文中观察AGEs对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及其机制.方法 体外培养人结肠癌细胞SW-480,以终浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的AGE-BSA处理细胞24h,并设正常对照组和BSA对照组进行比较.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测SW-480细胞活力,利用流式细胞术检测细胞周期的改变,实时荧光定量PCR测定晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)mRNA、细胞周期素D1(cyclin D1)mRNA的表达.结果 ①MTT结果示100μg/ml、200μg/ml、500μg/mlAGE-BSA作用SW-480细胞24h后可以显著促进细胞增殖(P<0.05),并呈浓度依赖性.②流式细胞术结果示200μg/mlAGE-BSA干预组24h后可以减少SW-480细胞G1期百分率,同时增加S期百分率,与正常对照组比较具有统计学差异(P<0.05).③实时荧光定量PCR结果示与正常对照组相比,200μg/mlAGE-BSA干预后可以上调RAGEmRNA和cyclin D1mRNA的表达(P<0.05).结论 AGEs能促进SW-480细胞的增殖,其机制可能与上调RAGEmRNA和cyclin D1mRNA的表达,加速细胞G1期向S期转换相关.     

糖基化终产物对人单核细胞EMMPRIN基因表达的影响

目的:探讨糖基化终产物(AGEs)对人单核细胞细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)表达的影响。方法:在培养的人单核细胞株中分别加入不同浓度AGEs干预24h和同一浓度AGEs干预不同的时间点,以1640培养基和相应浓度的牛血清白蛋白为对照组。用逆转录聚合酶链反应检测EMMPRIN mRNA的表达水平。结果:AGEs干预人单核细胞的EMMPRIN mRNA水平与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);且其表达呈时间和浓度依赖性降低(P<0.05)。结论:AGEs以时间及浓度依赖的方式减少人单核细胞EMMPRIN mRNA的表达。     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定

目的构建人可溶性晚期糖基化终产物受体(hsRAGE)His融合蛋白表达载体并在原核细胞表达与纯化。方法PCR扩增hRAGE基因编码区的胞质外段，利用分子克隆技术将其重组于pET-14b载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性转化大肠杆菌BL21(DE)3，用异丙基b—D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达。以尿素对获得的包涵体进行处理，用金属螯合亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性。以Western印迹和ELISA法对融合蛋白的免疫原性及与AGE的结合活性进行鉴定。结果克隆的hsRAGE完全正确．经过表达与纯化．获得了相对分子质量约45000的融合蛋白。纯化得到的变性蛋白经复性后可被相应抗体识别。所得到的hsRAGE具有与AGE相互结合的活性，并能够抑制AGE绣导的内皮细胞NF-κB的表达．结论成功地构建了hsRAGE融合蛋白原核表达载体且获得高效表达．得到大量的复性蛋白；该蛋白具有特异的免疫原性，保持与AGE的结合活性．并能够有效阻断AGE-RAGE相互作用。