β—半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（AAV—2）载体的构建及其在…

以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ＾－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主细胞后表达了β－半乳糖苷酶基因。此外，用脂质体转染法将载体导入２９３细胞和Ａ５４９细胞，进行了ＬａｃＺ基因瞬时表达研究。结果显示，重组ＡＡＶ载体（ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋））     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β—半乳糖苷酶基因 …

目的 构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β－半乳糖苷酶基因。方法 从人二倍体细胞的Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８．８－８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β－半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲＩ酶切Ａｄ     

4型腺病毒载体的构建和β—半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４质粒，质粒ｐＡｄ４和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂｐ腺病毒晚期表达盒，在所构宾腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ     

4型腺病毒疫苗株载体的构建及β—半乳糖苷酶基因的 …

目的 构建缺失Ｅ３区７８．９－８６ｍｕ的４型腺病毒疫苗株载体。方法 从４型腺病毒疫苗株感染的人胚肺二倍体细胞２ＢＳ中提取病毒ＤＮＡ,经过多卡亚克隆构建成功缺失７８．９￣８６ｍｕ的载体。将含有ＣＭＶ早期启动子的β－半乳糖苷酶基因插入缺失部位,将这一重组质粒与Ａｄ４Ｂｃｌ１大片段共转染２９３细胞,铺含有Ｘ－Ｇａｌ的营养琼脂,经蓝色斑斑纯化三代,ＯＮＰＧ法测定β－半乳糖苷酶基因的表达量。结果 所构建的载     

4型腺病毒载体的构建和β－半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段（７０．５－８３．０基因图谱单位）克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４（７０．５－８３）质粒，质粒ｐＡｄ４（７０．５－８３）和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂＰ腺病毒晚期表达盒，在所构建的腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ３区编码分子量为１９３００糖蛋白基因的３种Ａｄ４载体。将ｌａｃＺ基因插入载体表达区，与Ｂｅｌｌ消化的Ａｄ４ＤＮＡＡ片段共转染Ａ５４９细胞，ＯＮＰＧ法检测证实所构建的载体和表达盒功能良好。本项工作对于在国内研究口服活疫苗及开展基因治疗均具有重要意义。     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景：胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用。 目的：构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。 方法：将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒。采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞。 结果与结论：重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342 bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内。免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1。     

构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

背景：动物研究显示,自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差,这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。 目的：构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体,观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。 方法：构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定,采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建,以PCR及酶切方法验证构建的质粒,构建成功后扩增,并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞,测定最佳感染复数。参照此感染复数值,确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数;对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1,2,4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。 结果与结论：实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体;并获得了滴度达2×10¹¹ v•g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×10⁴ v•g/cell。在以1×10⁴,5×10⁴,1×10⁵ v•g/cell转染人髓核后,均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法,发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶 mRNA表达量相对最高(P < 0.05),4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体,腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA,此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒载体的构建及其表达

目的 :构建Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒 (AAV)载体 ,并转染到人肾小管上皮细胞中表达。方法 :利用基因重组技术 ,采用BamHI和XhoI双酶分别将pcDNA3中的目的基因Smad6 /flag和Smad 7/flag融合基因片断切出 ,再克隆到质粒pAAV MCS中 ,构建重组质粒pAA Smad 6 /flag和pAA Smad 7/flag。采用磷酸钙沉淀法 ,以重组质粒或pAAV LacZ以及pAAV RC、pHelper共转染HEK2 93细胞 ,产生均有传染性的病毒颗粒。再将此病毒颗粒转染到培养的人肾小管细胞中 ,用免疫组化法检测其Smad 6和Smad 7转移基因的表达。结果 :成功地构建Smad 6和Smad 7基因的腺相关病毒载体 ,并可在肾小管上皮细胞中表达Smad 6和Smad 7。结论 :肾小管细胞能稳定、高效表达外源Smad 6和Smad 7,为今后建立Smad 6和Smad 7AAV基因治疗体内肾纤维化的模型奠定了良好的基础     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β-半乳糖苷酶基因的表达

目的构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β半乳糖苷酶基因。方法从人二倍体细胞Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８８８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲⅠ酶切Ａｄ７ｖＤＮＡ共转染２９３细胞，获得表达β半乳糖苷酶重组病毒。结果构建了缺失部分Ｅ３区Ａｄ７ｖ载体，在ＣＭＶ启动子的作用下该载体能有效地表达外源基因。结论Ａｄ７ｖ载体的构建并成功表达外源基因为开发和应用这一载体打下了重要的基础     

构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体及在HepG2细胞中的表达

背景：内皮脂肪酶主要由血管内皮细胞分泌并作用于血管内皮,内皮脂肪酶可能在动脉粥样硬化等疾病的发生发展中起重要作用,但目前机制尚不明确。 目的：构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体,产毒感染HepG2细胞,评价重组载体提高内皮脂肪酶表达的效果。 方法：RT-PCR调取大鼠内皮脂肪酶基因,SpeⅠ、Eco RⅠ双酶切后,将内皮脂肪酶基因插入慢病毒载体PRRL.sin.CMV.eGFP中构建内皮脂肪酶过表达慢病毒表达载体PRRL.sin.CMV.EL-eGFP;使用PRRL.sin.CMV.EL-eGFP质粒及病毒包装系统于293FT细胞中包装产毒,用于感染HepG2细胞,RT-PCR及Western blot检测感染后HepG2细胞内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。 结果与结论：酶切及测序鉴定证实内皮脂肪酶基因成功插入PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒;转染PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒后,HepG2细胞中可见内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。说明重组PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒可感染HepG2细胞,并使其表达内皮脂肪酶mRNA和蛋白。     

构建以痘苗病毒为载体的人用狂犬病基因工程疫苗株的研究

构建了一个可以适于人用的表达狂犬病病毒糖蛋白的重组痘菌病毒疫苗株。构建的方法是：先构建一个表达β－半乳糖苷酶基因（简称ｌａｃ基因）的不经传代细胞的重组痘苗病毒，以此为亲本株，再与载体ＰＴｋ１１ｋＲＧ（狂犬病病毒糖蛋白基因插在胸苷激酶Ｔｋ区，并置于痘苗病毒１１ｋ启动子下游，Ｔｋ侧冀序列和启动子均来自痘苗病毒天坛株），在鸡胚细胞中同源重组，以蓝色空斑中挑白斑的方法筛选阳性重组病毒，用免疫荧光方法和ＡＰＡＡＰ免疫酶法证明，该病毒能较好地表达狂犬病病毒糖蛋白。动物实验表明，该病毒能较好地诱导小鼠和狗的抗狂犬病毒的中和抗体，并对狂犬病病毒ＣＶＳ株和ＳＲＶ（街毒）的攻击有保护作用。     

小鼠NGE基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的：构建小鼠β-NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法：用基因重组技术，将小鼠β-NGF的成熟cDNA序列及其前导序列，克隆到真核表达载体pcDNA3．1 中，用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENET^TM6方法，转染NIH3T3细胞。转染后72h，用G418筛选阳性克隆并培养至20d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Western blot分析并观察该上清中NGF对PCI2细胞突起生长的作用。结果：β-NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论：重组真核表达载体PcDNA3．1 ／NGF构建成功，NGF蛋白在NIH3T3细胞中表达，并具有良好的生物学活性，为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础。     

pWX146-β-半乳糖苷酶融合蛋白表达载体的构建及对疟原虫基因的表达

本文根据抗原分子特性，用限制性内切酶ＨｐａⅠ和ＥｃｏＲⅠ及三对ＸｈｏⅠ－ＥｃｏＲⅠ接头，对β－半乳糖苷酶融合蛋白表达载体ｐＷＲ４５０进行了改建，截去其β－半乳糖苷酶Ｃ端约３００个氨基酸的编码序列，构建了一组含β－半乳糖苷酶Ｎ端１４６个氨基酸编码序列的ｐＷＸ１４６融合蛋白表达载体，以ｐＷＸ１４６－Ⅰ作为载体，３０６ｂｐｐｆＨＲＰⅡ基因片段在大肠杆菌中得到了高效表达     

微小隐孢子虫CPl5基因高效真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的：构建隐孢子虫CP15真核表达载体pCB3．1—15，观察其在Hela细胞中的表达。方法：用BglⅡ从pMD18-T-15中酶切得到CP15基因，将其插入真核表达载体pCR3．1( )的BamH I位点，构建CP15真核表达载体pCR3．1—15，脂质体介导法将其转染Hela细胞，并用G18加压筛选，用RT—PCR方法检测外源CP15基因的转录，用ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果：酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pCR3．1-15；外源CP15基因能在转染细胞中有效转录；ELISA法和间接免疫荧光法实验结果表明表达产物具有良好的生物活性。结论：构建的pCR3．1—15真核表达载体在Hela细胞中具有良好的表达活性。     

大鼠微小RNA miR-16的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆微小RNA rno-miR-16,构建其慢病毒表达载体pLV-miR-16并包装成慢病毒颗粒,为进一步研究miR-16的功能奠定了实验基础.方法 从大鼠细胞基因组中用PCR 的方法扩增miR-16 的前体,构建了miR-16的重组表达载体pLV-miR-16,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物(pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV)共转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果 经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR-16基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得108＞ifu/ml.结论 成功构建大鼠慢病毒载体pLV-miR-16,为深入研究rno-miR-16的生物学功能奠定了基础.     

β—葡萄糖醛酸苷酶基因转染人胆管癌细胞的生物学观察

目的 建立高表达β－葡萄糖醛酸苷酶（以下简称βＧ）基因的胆管癌模型,并观察转染βＧ基因的胆管癌细胞的超微结构及基因表达产物的定位。方法 构建真核表达的逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－βＧ。利用阳离子脂质体将其转入人胆管癌细胞株,经免疫组化染色和免疫电镜等检测其表达,并用民镜观察转染细胞超微结构的变化。结果 经Ｇ４１８筛选后的阳性细胞克隆,为高表达βＧ的胆管癌模型。免疫组织化学染色和免疫电镜证实,其在转染β     

CTLA4-Ig重组腺相关病毒载体的构建及转染表达效果

重组腺相关病毒 (recombinantadeno associatedvirus,rAAV)载体是目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一。本研究通过构建CTLA4 Ig基因重组腺相关病毒载体 (rAAV CTLA4 Ig) ,研究其对大鼠转染的表达效果及规律。大肠杆菌Sure 2和 2 93细胞均由武汉同济医院心血管内科研究室提供 ;质粒pUF1 CTLA4 Ig、pXX2和pXX6由美国匹兹堡大学分子生物实验室XiaoX教授提供 ;近交系Lewis大鼠 ,2 0 0～ 2 5 0g,雄性 ,购自中国医学科学院实验动物研究所。仓鼠抗小鼠的CTLA4 Ig购自Pharm ingen公司 ,辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG购自Vec…     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

慢病毒载体的构建及其介导的绿色荧光蛋白在胰岛β细胞中的表达

目的获得能够在大鼠胰岛β细胞中高效表达的慢病毒载体。方法以PCR的方法扩增绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)片段,并将其通过穿梭质粒装入pLenti6/V5表达质粒,然后用脂质体转染试剂将plenti6/V5GFP、pLP1、pLP2以及pLP/VSVG转染入293FT细胞,获得的病毒用人纤维瘤细胞系的HT1080细胞进行滴定。然后用一定滴度的慢病毒转导大鼠胰岛β细胞系INS-1,观察转导效率。结果通过限制性内切酶和琼脂糖凝胶电泳方法,观察到所克隆入pLenti6/V5表达质粒的GFP片段大小正好与PCR扩增出的片段一致。经测序验证,序列与NCBI网站上GFP序列完全一致。转染结果显示,经293FT细胞所产生的慢病毒,转导效率达到80%以上。而在1×106/ml病毒颗粒的情况下,AAV-GFP病毒几乎不能转导β细胞。结论与同一滴度的AAV-GFP病毒相比,胰岛β细胞的转导效率有非常显著的差异。即慢病毒载体表达系统在对胰岛β细胞转导的能力上,明显优于重组腺辅病毒表达系统。表明慢病毒载体在糖尿病基因治疗中,特别是对胰岛β细胞的转基因工作中,有着良好的应用前景。     

应用Gateway技术构建过表达β-catenin基因的慢病毒载体

目的 应用Gateway技术构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体,验证该载体的功能.方法 利用多位点Gateway克隆技术,通过BP重组反应,构建穿梭载体pDown-Ctnnb1;再通过LR重组反应,将pUp-EF1A、pDown-Ctnnb1、pTail-IRES/DsRed-Express2和母载体pLV.Des3d.P/puro 4个质粒构建成表达载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A＞Ctnnb1 ＞IRES/DsRed-Express2;再转化到感受态细胞stbl3,经PCR筛选菌落阳性克隆测序鉴定.将成功构建的慢病毒表达载体转染293T细胞,用实时荧光定量PCR法验证重组载体对β-catenin基因mRNA水平的影响.结果 菌落PCR筛选和DNA测序鉴定显示入门克隆和表达载体插入片段序列正确,实时荧光定量PCR证实β-catenin基因mRNA水平显著上调(P＜0.01).结论 成功构建能显著上调β-catenin基因mRNA表达的慢病毒载体.