实时荧光定量POR检测传代培养细胞Grb10的表达

目的建立一种可靠的Grb10印迹基因实时荧光定量PCR方法，检测传代培养鼠尾成纤维样细胞中Grb10表达的差异。方法通过实时荧光PCR，选择合适的“相对标准品”绘制相对标准曲线，检测传代培养细胞中印迹基因Grb10的表达水平。结果相对标准曲线有较好的线性（r=0．999及0．984）；实时荧光定量PCR方法检测出随着细胞培养代数的增加印迹基因Grb10表达水平上升。结论双标准曲线的实时荧光定量PCR法用于检测Grb10的表达准确可靠；传代培养可能影响鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的表达水平。     

实时荧光定量PCR检测传代培养细胞Grb10的表达

目的 建立一种可靠的Grb10印迹基因实时荧光定量PCR方法,检测传代培养鼠尾成纤维样细胞中Grb10表达的差异.方法通过实时荧光PCR,选择合适的"相对标准品"绘制相对标准曲线,检测传代培养细胞中印迹基因Grb10的表达水平.结果相对标准曲线有较好的线性(r=0.999及0.984);实时荧光定量PCR方法检测出随着细胞培养代数的增加印迹基因Grb10表达水平上升.结论双标准曲线的实时荧光定量PCR法用于检测Grb10的表达准确可靠;传代培养可能影响鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的表达水平.     

Igf2r及Mest印迹基因在供核细胞中的表达及意义

目的：探讨细胞传代培养对胰岛素样生长因子Ⅱ受体（insulin-like growth factor Ⅱ receptor,Igf2r）和Mest基因表达的影响,以及它们在不同部位来源的成纤维样细胞（fibroblast-like cells）中的表达。方法：利用实时定量PCR法检测印迹基因Igf2r和Mest在来源于鼠耳和尾尖的成纤维样细胞中的表达。结果：在鼠尾成纤维样细胞的传代培养中,随着培养代数的增加,Igf2r的表达减弱,Mest的表达无明显变化;Igf2r在鼠尾成纤维样细胞中的表达高于鼠耳。结论：传代培养影响Igf2r基因的表达,Igf2r在不同部位来源的成纤维样细胞中的表达具有差异,为供核细胞的选择及后续的基因印迹研究奠定了基础。     

5-氮脱氧胞苷及曲古抑菌素A影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性及浓度依赖性

目的:探讨甲基转移酶抑制剂——5-氮脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-dC)和组蛋白去乙酰基酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性和浓度依赖性。方法:用不同浓度5-aza-dC及TSA按不同作用时间处理供核细胞(鼠尾尖成纤维样细胞),利用实时定量PCR法检测处理后H19基因的表达。结果:不同浓度的5-aza-dC处理组之间H19的表达无明显差异,但延长作用时间可使H19表达增强；TSA使H19的表达下降,但无时间依赖性。结论:长时间低浓度的5-aza-dC能增强供核细胞中H19基因的表达,而TSA则使H19的表达减弱,为体细胞克隆中表观遗传修饰抑制剂的选择及后续基因印迹研究提供了依据。     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平

目的探讨实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌乒,以表达的方法。方法以BB270femA基因表达为标准,建立实时荧光定量PCR方法,对实验菌株femA表达进行相对定量。结果建立的实时荧光定量PCR方法所得结果标准曲线线性关系好,熔解峰单一。随MIC变化,金黄色葡萄球菌femA表达水平也随之变化。结论用实时荧光定量PCR方法研究金黄色葡萄球菌femA表达量结果可靠、敏感、重复性好。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD58基因的表达

目的：应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法：提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMC CD58基因的表达水平，同时检测血清ALT、AST水平。结果：乙型肝炎各组患者PBMC CD58 mRNA表达水平较正常对照组明显增高，差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMC CD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论：实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达；乙型肝炎患者PBMC CD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

实时荧光PCR法检测HER2基因扩增方法的建立

目的探讨应用双标准曲线的实时荧光PCR法检测原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER2)基因扩增在临床乳腺癌诊治中的可行性。方法收集500例乳腺癌术后新鲜组织标本,抽提组织DNA进行实时荧光PCR检测,采用双标准曲线法定量,通过计算目的基因浓度和内标基因浓度的比值来判断HER2基因的扩增情况。选择灵敏度和特异度均较高的荧光原位杂交方法作为对照方法。结果检测阳性标本72例,阴性样本419例。该方法检测的灵敏度为85.9%,特异度为98.79%,准确度为96.74。与荧光原位杂交法(FISH)检测结果相比,二者具有较好的一致性。结论双标准曲线的实时荧光PCR法用于检测HER2基因扩增相对准确可靠,有较好的临床应用前景。     

树鼩IL-2TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立检测树鼩IL-2基因TaqMan探针实时荧光定量PCR方法.方法 以经ConA诱导培养的树鼩淋巴细胞总RNA为材料,设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆出树鼩IL-2基因,以构建的树鼩IL-2基因质粒为标准品,建立标准曲线,并进行灵敏度检测.结果 建立了树鼩IL-2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,此法检测灵敏度高,线性范围可达102～109拷贝/ul.结论 成功建立了树鼩IL-2实时荧光定量PCR方法,此方法灵敏度高、特异性强,检测周期短,为探讨IL-2作用的分子作用机制奠定基础.     

胰岛素样生长因子家族成员在早期自然流产中作用的研究

 目的 研究胰岛素样生长因子（IGF）家族成员在早期自然流产中的作用。方法 采用荧光定量PCR方法检测正常早孕及自然流产绒毛组织中IGF2基因,胰岛素样生长因子受体1（IGF1R）基因和胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP-3）基因mRNA表达。比较各指标间的相关性。结果 自然流产绒毛组织中IGF2、IGFIR mRNA表达明显低于正常绒毛组织（P0.05）。正常绒毛组织中IGF2 mRNA表达量与IGF1R mRNA表达量呈正相关（r=0.345, P0.05）。 结论 IGF家族成员IGF2和IGF1R mRNA表达的降低可能与早期自然流产发生有关。     

LASS1基因在鼠脑皮层中的表达研究

目的 探讨LASS1基因在大脑衰老中的作用。方法 分别从胎鼠、新生鼠、1月龄、3月龄、6月龄、11月龄、18月龄和24月龄鼠大脑皮层组织提取总RNA，RT—PCR扩增获得LASSI的cDNA片段并植入pGEM-T载体，以重组质粒载体为定量标准模板，采用Taqman荧光探针，一步法实时定量RT—PCR检测LASS1 mRNA表达，并以肌动蛋白基因（B—actin）和18S rKNA基因作为看家基因。结果在胎鼠至青壮年鼠（1—3个月龄）发育过程中大鼠脑皮层LASS1表达水平呈上调趋势，之后随年龄增长逐渐下降；β—actin表达量在胎鼠厦新生鼠明显高于成年鼠和老年鼠；18S rRNA基因表达相对稳定。结论成功建立了大鼠LASS1基因表达的荧光实时定量RT—PCR检测方法；大鼠脑皮层中LASS1基因转录水平随年龄变化呈现相应的规律性，这将为进一步研究该基因在衰老过程中的作用提供实验室依据；同时，作为看家基因用于衰老研究，18Sr RNA较β-acfin基因更为可靠。     

急性髓细胞性白血病病人TCRζ链基因表达特点

目的建立实时定量PCR方法检测TCRξ链表达水平的方法，了解急性髓细胞性白血病病人外周血TCRξ链基因表达水平。方法采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测31例急性髓细胞性白血病患者（M1型6例，M2型15例，M3型10例）和30例正常人外周血的单个核细胞的TCRξ链表达情况，以β2微球蛋白基因（β2M）作为内参，根据相对定量公式2^-△△α计算急性髓细胞性白血病患者与正常人TCRξ链表达差异倍数。结果与正常人相比，急性髓细胞性白血病患者TCRξ链表达特点可以分为表达缺失（16％）、表达下降（26％）和表达上升（58％）三种情况。而三种不同亚型急性髓细胞性白血病之间的TCRξ链表达模式相似。结论本研究成功建立了SYBR Green Ⅰ荧光实时定量PCR和相关定量分析TCRξ链表达水平技术，并首先报道了急性髓细胞性自血病病人TCRξ链表达水平的变化。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD_(58)基因的表达

目的:应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法:提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMCCD58基因的表达水平,同时检测血清ALT、AST水平。结果:乙型肝炎各组患者PBMCCD58mRNA表达水平较正常对照组明显增高,差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMCCD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论:实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达;乙型肝炎患者PBMCCD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

实时荧光定量PCR检测人IL-9 mRNA方法的建立及应用

目的：建立检测人白介素-9（interleukin-9,IL-9）mRNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR（real—time fluorescence quantitative PCR,qRT—PCR）方法。方法：分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear ceils,PB—MC）,经PMA和离子霉素刺激活化后提取总RNA并逆转录成cDNA。扩增产物与pMD-18T载体连接构建质粒标准品。采用qRT—PCR方法检测IL-9mRNA的表达水平。评价该方法的线性及特异性,应用该方法检测Graves病患者PBMC中IL-9 mRNA表达水平。结果：建立了人IL-9的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该法的标准曲线相关系数r^2为0．995～0．998,熔解随线分析产物为单峰。Graves病患者PBMC中IL-9 mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组（P〈0．01）。结论：建立的检测人IL-9 mRNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法灵敏、特异性好,为进一步临床应用提供了实验基础。     

SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平

目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平.方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin的mRNA进行检测.结果:标准曲线呈良好的线性关系.标准品的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,说明基本无非特异性扩增.结论:所建SYBR荧光实时定量PCR方法操作简便,费用低,特异性好,准确度、灵敏度高,为后续研究构建了理想的平台.     

细小病毒H-1感染对胃癌细胞核修复相关基因表达的影响

目的 探讨细小病毒H-1诱导胃癌细胞死亡的可能机制。方法 选取对细小病毒H-1敏感和不敏感的胃癌细胞株HGC27和BGC823，H-1病毒感染48h后提取细胞总RNA。应用不同标记的dCTP逆转录制备荧光探针，与含有8000点人类体细胞基因序列的表达谱cDNA芯片杂交，计算机荧光扫描分析HGC27细胞核修复相关基因表达谱的改变。实时定量PCR检测HGC27和BGC823细胞部分核修复相关基因的表达。结果基因芯片分析显示，HGC27细胞的64对核修复相关基因中，12对基因表达水平下调至0．5以下，6对基因表达水平上调至2倍以上。PCR定量检测证实，HGC27细胞BTG2表达明显下调，MBD2表达显著上调，XRCC4和H2A-Z的表达无明显改变；BGC823细胞BTG2表达明显下调，XRCC4、H2A．Z和MBD2表达无明显改变。结论 细小病毒H-1可能通过影响胃癌细胞核修复通路相关基因的表达，使细胞基因转录或细胞周期停止，从而诱导胃癌细胞死亡。     

Stathmin mRNA在树突状细胞中的表达及其意义

目的探讨StathminmRNA在树突状细胞中的表达及其意义。方法分离和培养小鼠的树突状细胞,用细菌脂多糖（LPS）刺激0h、3h、12h后,收集细胞,并提取细胞总RNA,经RT-PCR反转录为cDNA,再通过荧光定量实时PCR检测Stathmin的mRNA水平。结果定量PCR标准曲线的相关系数为-0.99,且融解曲线峰单一,表明已成功建立了准确、特异的实时定量PCR方法。经LPS刺激后,树突状细胞Stathmin的mRNA表达水平降低,随时间的延长而递减（P〈0.01）。结论树突状细胞的Toll样受体4信号途径与Stathmin的表达相关。     

BMPR-Ⅱ基因mRNA荧光定量PCR检测标准品的构建

目的构建检测BMPR-Ⅱ基因mRNA表达水平差异的标准品。方法以人胚肺成纤维细胞的总RNA为模板、O ligo(dT)18为引物逆转录产生cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人BMPR-Ⅱ基因相应的cDNA片断,构建pMD-18-BMPR-Ⅱ重组质粒,经鉴定测序,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果成功克隆了人BMPR-ⅡcDNA,并以其为标准制作出荧光定量PCR标准曲线。结论成功构建了BMPR-Ⅱ基因荧光定量PCR标准质粒,为今后BMPR-ⅡmRNA的荧光定量PCR检测打下了基础。     

成骨相关基因在强直性脊柱炎与正常人成纤维细胞的表达差异

目的：探究强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis,AS）患者与正常人脊上韧带成纤维细胞的原代爬出时间、生长曲线及两组细胞之间的成骨相关性指标的差异.方法：取AS和正常人棘上韧带,离体原代培养成纤维细胞.记录组织爬出成纤维细胞时间和四甲基偶氮唑盐（MTT）检测法检测两组细胞生长曲线.原代细胞爬出后传代培养,取对数期细胞RNA并逆转录CDNA,实时荧光定量PCR法检测两组细胞之间成骨相关基因表达的差异.结果：两组细胞的爬出时间有明显差异（P＜0.05）,生长曲线大致成“S”型,两组细胞生长曲线未见明显差异.Ⅰ型胶原酶（COL1A1）在两组之间表达无差异（P＞0.05）,骨钙素（OC）基因起始表达量过低,可记为不表达.结论：AS组与正常人组成纤维细胞成骨性相关基因原始表达量和生长曲线均无明显差异.