日本血吸虫DNA疫苗的构建及其保护性免疫的研究

为探讨血吸虫ＤＮＡ疫苗保护性免疫效果,首先构建、鉴定和表达日本血吸虫ＤＮＡ疫苗（ｐＣＤ－Ｓｊ３２）。实验结果表明：ｐＣＤ－Ｓｊ３２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠能诱导产生抗日本血吸虫感染免疫力,减虫率为３５．６％￣４４．４％,减卵率为３９．４％￣６９．０％;１００μｇＤＮＡ一次肌肉注射,免疫后８周攻击感染组的效果好;ＣＤ８＾＋淋巴细胞、ＩＬ－２、ＴＮＦ和ＩＮＦ－γ可能在血吸虫病免疫功能调控中起重要作用;ｐＣ     

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗不同免疫途径免疫保护效果研究

目的:观察本室所构建日本血吸虫大陆株31kDa组织蛋白B DNA疫苗在BALB/c小鼠体内的不同免疫途径的免疫保护效果.方法:用纯化的空白质粒载体VR1012、重组质粒VR1012-Sj31免疫BALB/c鼠,将36只6～8周龄BALB/c鼠随机分为3组,每组12只,对照组(A组)肌肉注射空白质粒载体VR1012,实验组(B组)皮下注射重组质粒VR1012-Sj31,C组肌肉注射重组质粒VR1012-Sj31.质粒剂量均为100μg,每隔2w免疫1次,共免疫3次,第3次免疫后第21d,每只鼠经腹部感染10条尾蚴,42d后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数,观察诱导产生的减虫和减卵效果,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体.结果:ELISA分析表明,第3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体.与空白质粒对照组比较,2个实验组的减虫率分别为15.0%(P＞0.05)和25.0%(P＜0.05),减卵率分别为38.22%和54.90%(P＜0.001).与皮下免疫组相比,VR1012/Sj31肌肉免疫组的减卵率分别为26.99%(P＜0.001).结论:DNA疫苗VR1012-Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用,肌肉注射的保护效果大于皮下注射.     

日本血吸虫DNA疫苗的构建及其保护性免疫的研究

为探讨血吸虫ＤＮＡ疫苗保护性免疫效果,首先构建、鉴定和表达日本血吸虫ＤＮＡ疫苗（ｐＣＤ－Ｓｊ３２）。实验结果表明：ｐＣＤ－Ｓｊ３２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠能诱导产生抗日本血吸虫感染免疫力,减虫率为３５．６％～４４．４％,减卵率为３９．４％～６９．０％;１００μｇＤＮＡ一次肌肉注射,免疫后８周攻击感染组的效果好;ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞、ＩＬ－２、ＴＮＦ和ＩＮＦ－γ可能在血吸虫病免疫功能调控中起重要作用;ｐＣＤ－Ｓｊ３２能诱导宿主产生高滴度特异性抗体,并在体外能介导巨噬细胞产生抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ＡＤＣＣ）免疫效应。结果提示,ｐＣＤ－Ｓｊ３２有可能发展为新的预防血吸虫病的亚单位疫苗。     

日本血吸虫Calpain的DNA疫苗诱导小鼠免疫保护性研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株Calpain的DNA疫苗对Balb/c小鼠的免疫保护性作用。方法　大量制备pVAC质粒DNA和pVAC -CalpainDNA疫苗 ,Balb/c小鼠 5 0只 ,随机均分为对照组和实验组 ,对照组每只小鼠的股四头肌注射接种 10 μgpVAC质粒DNA ,实验组以同样方式注射 10 μgpVAC -CalpainDNA疫苗 ,第 3周加强免疫一次。第 4周每只小鼠经腹部皮肤感染 ( 2 5± 1)条尾蚴 ,感染 6周后剖杀 ,从门静脉灌流收集计成虫数、碎脾计T淋巴细胞总数、从各鼠肝脏的同一部位切下小块肝组织 ,置 5 %KOH溶液消化后 ,计算每克肝组织虫卵数 ,比较减虫率、减雌率和减卵率。于免疫前、第一次免疫后 2周和感染后 2周分别从尾静脉采血 ,用ELISA测定抗体水平。结果　与对照组相比 ,实验组获得 36.84%的减虫率、36.36%的减雌率和 43.31%的减卵率 ,感染后实验组小鼠IgG抗体水平升高幅度大于对照组 ,对照组T淋巴细胞数显著多于实验组。结论　CalpainDNA疫苗可诱导小鼠产生较好的免疫保护作用 ,具有较大的发展潜力     

日本血吸虫多价DNA疫苗pBK—Sj26（Sj32）—Sj23免疫效果的观察

为了观察血吸虫病多价DNA疫苗的保护力,将小鼠分成5组：空白对照组、空质粒对照组、单价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj23组、多价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj26-Sj23和pBK-CMV-Sj32-Sj32组。大量提取各组质粒DNA后,各组于0、3、5周在BALB／c小鼠股四头肌注射相应质粒DNA,9周用血吸虫尾蚴攻击感染,15周剖杀小鼠计算减虫率及减卵率。结果显示：与对照组比较,实验组小鼠减虫率及减卵率及极显著性差异（P＜0.01）;与单价pBK-CMV-Sj23组比较,多价DNA疫苗组的减虫率及减卵率有显著性差异,提示血吸虫多价DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单价DNA疫苗。     

日本血吸虫混合DNA疫苗的构建

构建「日本血吸虫混合ＤＮＡ疫苗，为今后多抗原特异ＤＮＡ轩的研究打下基础。在克隆ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ－Ｓｊ２３，ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ Ｓｊ２６，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－３２的基础上，亚克隆构建了真核表达载体ｐＢＫ－２Ｊ２３，ｐＢＫ－Ｓｊ２６，ｐＢＫ－Ｓｊ３２。经过酶切鉴定，ＰＣＲ扩增鉴定及测序后，将此三种不同抗原质粒经不同组合后经肌肉注射免疫小鼠。３周后提取小凤四头肌ＤＮＡ，特异性引物扩增获得目     

日本血吸虫DNA疫苗的研究现状与展望

运用基因工程的技术 ,将编码某种蛋白的外源性基因直接导入动物细胞 ,这种导入的核酸既是载体 ,又是具有免疫原性的抗原 ,故称核酸疫苗。目前研究最多的为ＤＮＡ疫苗。 1994年 5月 ,ＷＨＯ全球疫苗和免疫规划等机构联合召开核酸疫苗会议 ,充分肯定了核酸疫苗的潜在应用价值 ,并强调其研究方向与用一种疫苗预防多种疾病的长远目标相一致[1] 。1　ＤＮＡ疫苗的研究史传统疫苗有两种 :一种是减毒活疫苗或死疫苗 ;另一种为基因工程疫苗。这两种疫苗在效果、安全性及造价等方面还存在许多问题。减毒活疫苗虽可刺激机体产生ＣＩＬ和Ｔｈ及增强体液…     

不同载体的日本血吸虫DNA疫苗诱导小鼠免疫效果的观察

目的　观察不同真核表达载体的日本血吸虫 DNA疫苗的免疫效果 ,筛选合适的血吸虫 DNA疫苗。方法　将小鼠分成 5组 ,于第 0、 3、 5周将日本血吸虫真核表达载体 p BK- Sj2 3 ,p BK- Sj2 6以及 p CD- Sj2 3 ,p CD- Sj2 6,分别接种小鼠股四头肌 ,第 9周每组小鼠以 40± 2条血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击感染 6周后 ,剖杀小鼠 ,计算减虫率和减卵率 ,比较含血吸虫同一抗原分子的不同载体诱导小鼠的抗攻击感染能力。结果　发现疫苗 p CD- Sj2 3和 p CD- Sj2 6诱导小鼠的减虫率和减卵率分别为 3 0 .5 0 %和 3 3 .0 2 % ;疫苗 p BK- Sj2 3和 p BK- Sj2 6诱导小鼠的减虫率和减卵率分别为 18.2 4%和 2 1.70 % ,含血吸虫同一抗原分子的不同载体诱导小鼠的抗攻击感染能力具有显著性差异。结论　由真核表达载体p CD构建的血吸虫 DNA疫苗比由真核表达载体 p BK构建的血吸虫 DNA疫苗具有更好的抗血吸虫感染的能力     

日本血吸虫多价DNA疫苗pBK-Sj26(Sj32)-Sj23免疫效果的观察

为了观察血吸虫病多价DNA疫苗的保护力,将小鼠分成5组空白对照组、空质粒对照组、单价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj23组、多价抗原DNA疫苗pBK-CMV-Sj26-Sj23和pBK-CMV-Sj32-Sj23组.大量提取各组质粒DNA后,各组于0、3、5周在BALB/c小鼠股四头肌注射相应质粒DNA,9周用血吸虫尾蚴攻击感染,15周剖杀小鼠计算减虫率及减卵率.结果显示与对照组比较,实验组小鼠减虫率及减卵率有极显著性差异(P<0.01);与单价pBK-CMV-Sj23组比较,多价DNA疫苗组的减虫率及减卵率有显著性差异.提示血吸虫多价DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单价DNA疫苗.     

日本血吸虫（大陆株）融合蛋白保护性免疫力的研究

采用日本血吸虫(大陆株)融合蛋白加福氏佐剂免疫小鼠,攻击感染后,不但可减少虫负荷(减虫率为29.2—51.0%),还可降低血吸虫雌虫的产卵量(减卵率为52.1—74.3%),血清抗体在初次免疫后3周即明显升高,并持续维持较高的水平。结果表明,经大肠杆菌表达的日本血吸虫重组融合蛋白能诱导抗攻击感染的保护性免疫力,可望作为混合多价疫苗的候选组份而大规模的生产。     

Immune responses against Schistosoma japonicum after vaccinating mice with a multivalent DNA vaccine encoding integrated membrane protein Sj23 and cytokine interleukin-12

Background The vaccination of mice with DNA encoding single candidate antigens has failed to induce significant protection against Schistosoma japonicum ( S. japonicum) challenge infections. In this study, we evaluated the feasibility of using a multivalent DNA vaccine which co-expressed S.japonicum integral membrane protein Sj23 and murine cytokine IL-12 to induce protective immune responses.Methods The plasmid pVIVO2-IL12-Sj23, a eukaryotic expression vector expressing Sj23 and murine IL-12 simultaneously, was constructed, identified, and tested for expression in vitro. Its ability to protect against S. japonicum challenge infections was analyed according to worm reduction rate and egg reduction rate after vaccination of BALB/c mice. The serum levels of specific IgG antibody were determined by enzyme-linked-immuno sorbent assay (ELISA) and Western blot analysis. Using cultured spleen cells, IFN-γ and IL-4 post-stimulation were quantified by ELISA. The phenotypes of splenocyte populations were analyzed by flow cytometry (FCM).Results The plasmid DNA pVIVO2-IL12-Sj23 was proven to express well in vitro by transient transfection of HEK-293 cells. Immunization resulted in a worm reduction rate of 45. 53% and egg reduction rate of 58.35%. ELISA and Western blot analysis indicated that immunized mice generated specific IgG against Sj23. Spleen cells showed significant increases in IFN-γ but decreases in IL-4.No significant differences in CD4^ and CD8^ subgroup ratios were observed after the challenges.Conclusions The multivalent DNA vaccine pVIVO2-1L12-Sj23 is sufficient to elicit moderate but highly significant levels of protective immunity against challenge infections. Cytokine IL-12, as a gene adjuvant, was able to enhance the Thl responses and, hence, the protective immunity.     

重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫保护作用的研究

目的研究重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫对感染小鼠的免疫保护作用。方法大量制备重组日本血吸虫32kDa蛋白(rSjGST-Sj32)和铁蛋白(GMCSF-SjFer)。48只昆明小鼠随机分为A,B,C,D4组,每组12只。B组和C组分别为rSjGST-Sj32和GMCSF-SjFer免疫组,每鼠注射50μg重组蛋白加弗氏完全佐剂(FCA);D组为联合免疫组,每鼠注射50μg重组32kDa蛋白和50μg铁蛋白的混合物加FCA;A组为FCA对照组。分别于0、2、6w共免疫3次。第3次免疫后2w,每鼠经腹部皮肤攻击感染40±1条尾蚴,感染后第45天剖杀所有小鼠,比较各组间减虫率和鼠肝卵减少率。结果联合免疫组与FCA对照组相比,获得了36.53%的减虫率和68.44%的每条雌虫肝组织产卵减少率,而单独rSjGST-Sj32免疫组的减虫率及每条雌虫肝组织产卵减少率分别为22.80%和43.12%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001);单独GMCSF-SjFer免疫组分别为21.05%和41.91%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001)。结论rSjGST-Sj32蛋白和GMCSF-SjFer蛋白联合免疫可显著地提高这两种蛋白单独应用时的免疫保护作用。     

重组日本血吸虫SjGST-Sj32蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究

应用基因工程技术分别表达出ＳｊＧＳＴＳｊ３２,Ｓｊ３２和ＳｊＧＳＴ,用于保护性免疫的动物实验及其体液免疫机制的初步探讨。结果：与对照组相比,重组ＳｊＧＳＴＳｊ３２组,Ｓｊ３２组,Ｓｊ３２＋ＳｊＧＳＴ组均有明显的减虫效果（Ｐ＜０．０５）。上述三组及ＳｊＧＳＴ组的肝脏虫卵计数均较对照组为少（Ｐ＜０．０１）。提示重组Ｓｊ３２ｋＤ蛋白可诱导小鼠产生明显的抗日本血吸虫攻击感染的保护性免疫及抗生殖免疫效果,而ＳｊＧＳＴ仅表现出一定的抗生殖免疫效果。     

赖型钩体flaB2与VR1012中的CpG基序分析

目的：对问号赖型钩端螺旋体（赖型钩体）DNA疫苗[包括内鞭毛蛋白基因（flaB2)和质粒DNA表达载体（VR1012）]的CpG基序（CpG motifs)进行分析，为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础。方法：以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原，对flaB2及VR1012全核苷酸序列进行计算机分析（分类、计数和定位）。结果：CpG的“C”的侧翼为两个嘌呤，“G”的侧翼为两个嘧啶，在flaB2中共3个，分别为GACGCT，GACGTC和GACGCC；在VR1012中共11个，分别为GACGTC1个，GACGCT2个，GACGCC1个，GACGTT1个，GGCGTT2个，GGCGCT2个，GGCGCC1个，AACGCT1个，其中特别重要的TGACGTCA4个和TAACGCCA有1个，位于5'端456－463；509－516；592－599；778－785和486－493；4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5'端且相对集中。结论：赖型钩体flaB2与VR1012构成的DNA疫苗含有TGACGTCA等CpG，这些基序又称免疫刺激序列，构成了DNA疫苗中的佐剂。     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达（英文）

目的 克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因，构建真核表达重组质粒，转染真核细胞，观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBCSK＋／Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段，重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3．1（＋）／Sjcb2转染HeLa细胞，间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗；重组质粒在HeIJa细胞中获得表达。结论Sicb2基因能够在体外真核细胞中表达。     

日本血吸虫基因组DNA的提纯与鉴定

本研究采用酚─氯仿法提纯了日本血吸虫基因组ＤＮＡ，并对基因组ＤＮＡ进行了定量分析及微电泳鉴定。结果表明，１００ｍｇ日本血吸虫成虫（湿重）可提纯出约８０μｇ的ＤＮＡ，其基因组ＤＮＡ的大小＞３１Ｋｂ。该法提取的血吸虫基因组ＤＮＡ较纯，适合于以后进行ＤＮＡ限制性核酸内切酶谱分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。