冻干去细胞同种异体神经种植类许旺细胞修复坐骨神经缺损的实验研究

目的研究冻干去细胞异体神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果。方法50只成年雌性DA大鼠随机分为5组，每组10只，分别用5种移植物桥接大鼠1．5cm坐骨神经缺损。A组：冻干去细胞异体神经种植类许旺细胞移植组；B组：冻干去细胞异体神经移植组；C组：去细胞异体神经移植组；D组：新鲜异体神经移植组；E组：自体神经移植组。术后4、24周通过大体观察、神经电生理、肌肉湿重及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果。结果术后24周A、E组间差异无统计学意义（P〉0．05），A、E组的各项指标均优于B、C、D组（P〈0．05或P〈0．01）。结论冻干化学去细胞神经是良好的神经移植替代材料。     

成年大鼠许旺细胞复合去细胞神经支架修复坐骨神经缺损

目的  探讨成年许旺细胞(SC)复合去细胞神经支架构建的组织工程化人工神经移植治疗外周神经损伤的效果。方法  从Wallerian变性1周的成年SD大鼠远侧端神经中分离培养得到SC, 复合去细胞神经支架构建组织工程化人工神经。移植分为SC+去细胞SD大鼠神经支架组(SC治疗组)和空细胞SD大鼠神经支架组(阴性对照组), 每组各5只。比较两组大鼠术后2、4、8周损伤侧坐骨神经功能指数(SFI), 术后8周损伤侧坐骨神经传导功能和小腿三头肌湿重恢复率等修复效果的指标。结果  SC治疗组术后2、4、8周损伤侧SFI, 术后8周损伤侧坐骨神经传导功能和小腿三头肌湿重恢复率均优于或高于阴性对照组(均为P < 0.05)。结论  采用成年SC复合去细胞神经支架的人工神经移植治疗外周神经缺损, 可有效促进损伤神经的功能恢复。     

去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复周围神经缺损的实验研究

目的 探讨去细胞异种神经(acellular xenogeneic nerve,AXN)复合骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)修复周围神经缺损的效果.方法 体外培养大鼠BMSCs;取雌性Wistar大鼠60只,随机分为3组,每组20只,建立右坐骨神经10 mm缺损修复模型.A组:BMSCs与AXN复合修复神经缺损;B组:单纯AXN修复神经缺损;C组:自体神经移植组.术后4、12周依次进行干细胞的转归、移植免疫、神经电生理检测、新生神经组织学观察和小腿三头肌肌纤维横径等检测,判断坐骨神经功能恢复情况.结果 术后移植物内均可见细胞生长,A、C组细胞数目较多,排列整齐,只有A组S-100免疫组化染色阳性细胞内可见BrdU阳性表达,术后12周再生神经已通过远端缝合口.A组、C组组织学及电生理检测指标均优于B组(P＜0.05),A组与C组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BMSCs作为种子细胞可以在体内存活,并可分化为SCs,其与AXN复合构建组织工程神经修复神经缺损的效果接近于自体神经移植.     

去细胞异种神经复合同种异体脂肪干细胞修复猕猴周围神经缺损的免疫反应研究

目的观察去细胞异种神经复合同种异体脂肪干细胞修复猕猴周围神经缺损后的全身及局部免疫排斥反应,评价该修复材料的安全性。方法健康成年雄性长白猪1只,体重48 kg,取胫神经制备去细胞异种神经;健康成年雄性猕猴1只,体重4.5 kg,分离培养脂肪干细胞;健康成年雌性猕猴10只,体重3～5 kg,制备25 mm长桡神经缺损动物模型,随机分为复合细胞组和无细胞组(n=5),前者采用去细胞异种神经复合第3代脂肪干细胞移植修复,后者采用去细胞异种神经移植修复。于术前及术后14、60、90 d抽取外周静脉血行淋巴细胞分析;术后5个月取材观察移植物组织免疫反应和神经再生情况,并与自体神经移植组作比较。结果复合细胞组与无细胞组术前及术后各时间点外周静脉血淋巴细胞数量、T淋巴细胞百分率及其数量、CD8+T淋巴细胞百分率、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);术后14 d,复合细胞组CD4+T淋巴细胞百分率低于其余时间点,差异有统计学意义(P<0.05);同一时间点两组间比较,除术后14 d复合细胞组CD4+T淋巴细胞百分率低于无细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)外,其余各时间点各指标组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术后5个月,去细胞异种神经与周围组织有轻度粘连,神经外膜较自体神经厚,未见组织坏死、纤维瘢痕形成,移植物内见再生神经纤维,复合细胞组、无细胞组均有稀疏的CD3+、CD4+、CD8+、CD68+、CD163+T淋巴细胞散在分布,细胞浸润情况与自体神经移植组类似。结论去细胞异种神经移植修复猕猴周围神经缺损后未产生全身及局部免疫排斥反应;复合同种异体脂肪干细胞移植后也未发现免疫排斥反应,且术后早期可能抑制CD4+T淋巴细胞增殖。     

经脂肪源性干细胞诱导的施万样细胞用于组织工程化人工神经的实验研究

目的研究经大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）体外诱导分化的施万样细胞应用于组织工程化外周神经,修复大鼠坐骨神经缺损的效果。方法Wistar大鼠48只,体重200-250g,随机分成3组,每纽i6只,分别用下面3种不同的方法修复15mm坐骨神经缺损：DMEM组（支架内注射培养基）、诱导组（支架内注射施万样细胞）和自体神经移植组．通过足迹实验（坐骨神经功能指数测定）、神经电生理检测、胫前肌湿重比率测定进行功能检测;应用透射电镜、图像分析系统进行组织学观察。结果术后12周诱导组的SFI指数、神经传导速度、潜伏期、波幅以及胫前肌重量恢复、神经纤维数目、轴突直径、髓鞘厚厦好于DMEM组（P〈0．05）,接近自体移植组。再生神经中标记细胞观察显示PKH-26标记的ADSCs,依然呈红色荧光。结论ADSCs诱导分化后的施万样细胞与去细胞同种异体神经两者构建的组织工程化神经能有效地修复大鼠坐骨神经缺损,其效果与自体神经移植相似：ADSCs经诱导后的细胞可以作为组织工程种子细胞新的来源。     

人脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管修复大鼠坐骨神经缺损

目的 探讨诱导后的脐带间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复大鼠坐骨神经缺损的可行性.方法 从正常足月新生儿脐带中分离培养间充质干细胞并诱导分化为神经样细胞,与去细胞神经基膜管共培养以构建组织工程神经;用30只健康成年雄性SD大鼠建立坐骨神经缺损(10 mm)的动物模型并随机分成3组:A组为脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管组,B组为单纯去细胞神经基膜管组,C组为自体神经桥接组.术后10周通过神经电生理检测、组织学观察等评测效果.结果 在局部观察和肌肉测量、神经电生理检测、组织学观察等方面,脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管组(A组)神经再生及肢体功能情况良好,效果接近于自体神经桥接组(C组),明显优于单纯去细胞神经基膜管组(B组).结论 脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管构建的组织工程神经可有效促进大鼠坐骨神经缺损(10 mm)的修复.     

许旺细胞诱导下脂肪来源干细胞向神经细胞方向分化的研究

目的 探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)和SD大鼠许旺细胞(Schwann cells)利用Transwell非接触式共培养时生长增殖特性和向神经元样细胞分化的规律.方法 取1月龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,按酶原消化法获取脂肪来源干细胞,同时取大鼠坐骨神经按改良植块法获取许旺细胞.取P3代脂肪来源干细胞分三组:A组使用ADSCs和许旺细胞构建Transwell非接触式共培养体系,B组利用β-巯基乙醇(BME)、丁酸酯羟基茴香醚(BHA)作为脂肪来源干细胞诱导因子使其向神经方向诱导,C组脂肪干细胞为对照组.比较各组细胞形态,观察脂肪来源干细胞代谢、轴突生长、免疫荧光染色情况,并做统计学分析.结果 A组脂肪来源干细胞部分分化为具有细长突起的细胞,B组诱导培养后,大多数存活的细胞也同样转变为类似于神经元的形态,A组突起长度(11.64±1.64)μm,B组突起长度 (13.03±1.35)μm,差异有统计学意义(P>0.05),细胞生长代谢旺盛.A组B组诱导分化后的细胞NF表达阳性率分别为(54.16±9.35)%和(62.25±8.95)%,两者差异无统计学意义,而GFAP染色阴性.在细胞数量上,A组为(4.08±0.68)×107/L,C组(4.20±0.79)×107/L,差异无统计学意义(P>0.05),但明显高于B组(3.23±0.37)×107/L(P<0.05).结论 许旺细胞能促进脂肪来源干细胞向神经方向分化,效果与使用β-BME加BHA试剂诱导的结果相近,并能有效防止脂肪来源干细胞损伤.     

骨髓源神经干细胞修复大鼠周围神经缺损的实验研究

目的: 探讨骨髓源神经干细胞用于组织工程化人工神经修复大鼠坐骨神经缺损的治疗效果。方法: 36只Wistar大鼠随机分为3组, 每组12只。A组: 将骨髓源神经干细胞与ECM凝胶混合, 种植于几丁糖神经导管中修复10mm坐骨神经缺损; B组: 仅将ECM凝胶种植于神经导管中; C组: 坐骨神经切下10mm, 翻转180°后缝合。16周后, 行大体观察、神经电生理检测、腓肠肌湿重测定、组织学染色, 免疫组化染色和轴突计数等检查。结果: A组的各项检测指标与C组相近, 明显优于B组, 差异显著(P<0. 05)。结论: 骨髓源神经干细胞可作为周围神经组织工程的种子细胞修复周围神经缺损。     

周围神经缺损修复研究进展

周围神经缺损修复仍是临床难题之一。传统的修复较短神经缺损的方法是神经端一端缝合或端一侧缝合,长段神经缺损的首选方法是自体神经移植,但受限于供体神经来源有限、需多次手术等。许旺细胞或干细胞（可诱导分化为许旺细胞样细胞）复合生物材料构建组织工程化神经,可修复长段神经缺损。该文就神经移植材料、种子细胞、神经营养因子、组织工程化神经在周围神经缺损修复中的相关问题及研究进展作一综述。     

化学去细胞异体神经修复神经缺损长度的实验研究

[目的]研究神经长度是否影响化学去细胞神经的质量及化学去细胞异体神经修复犬神经缺损的适当长度范围。[方法]切取犬的坐骨神经全长，截取直径近似段长度12cm，去除神经外膜的脂肪组织及血管，在5．0％Triton X-100和5．0％脱氧胆酸钠中重复消化得到化学去细胞神经；部分神经用于组织学评价，将12cm神经按顺序切割为6段，石蜡包埋制备切片，厚度5μm。HE染色和Fastblue染色，观察去细胞程度、神经细胞外基质结构完整性、髓鞘染色强度，观察每段神经的差异。在体内实验中，用化学去细胞异体神经桥接犬的坐骨神经缺损，缺损长度分别为8、10cm组，每组各有6条成年犬，随访时间12个月。观察动物肢体功能恢复、肌电图变化及再生神经组织学表现，包括HE染色、S-100免疫组织化学染色、乙酰胆碱酯酶染色。[结果]去细胞神经全长各段在去细胞程度、结构完整性及残余髓鞘染色综合评价中无差异。体内移植实验结果显示8cm去细胞异体神经移植组的犬在术后12个月踝关节可直立行走，而10cm去细胞异体神经移植组犬12个月时踝关节不能直立行走。肌电图检查结果显示，两组动物的手术肢体均可记录到诱发的运动和感觉电位。肌电图波幅、时限及运动神经传导速度结果显示，8cm移植组明显高于10cm移植组（P〈0．05）。组织学检查显示8cm移植组再生的神经轴突通过移植段神经到达远侧的神经中，并与所支配的肌肉建立新的运动终板联系，坐骨神经支配的小腿三头肌中有大量新生的运动终板形成。在10cm移植组有部分再生的神经纤维通过移植段神经进入远端的神经，小腿三头肌中新生的运动终板数量和大小明显低于8cm移植组（P〈0．05）。[结论]在化学去细胞神经的制备中，神经的长度对去细胞的质量无影响；化学去细胞异体神经修复神经缺损的长度若不超过8cm可取得较满意的功能康复结果。     

大鼠脂肪干细胞诱导分化为类许旺细胞的表型和功能特征

目的 研究大鼠脂肪干细胞(ADSCs)在体外分化为类许旺细胞的表型和功能特征,为外周神经组织工程应用提供实验基础.方法 采用β-巯基乙醇、全反式视黄酸、forskolin、血小板源生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和heregulin依次联合诱导,双重免疫荧光细胞化学法和Western blot鉴定神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白等许旺细胞标志蛋白的表达,与原代背根神经节(DRG)感觉神经元共培养研究诱导后细胞的功能.结果 诱导后ADSCs形态类似许旺细胞.双重免疫荧光细胞化学法显示S-100和GFAP的最高表达率分别为(78.08±6.08)%和(72.38±6.43)%,双重表达率为(60.76±6.43)%.Western blot显示诱导后细胞同时表达这两种蛋白.诱导后细胞能明显增加DRG神经元的突起向外生长.结论 诱导后ADSCs的表型和功能特征证实大鼠ADSCs在体外可分化为类许旺细胞.     

经诱导的骨髓基质干细胞应用于组织工程化人工神经的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞应用于组织工程化人工神经修复大鼠10mm长坐骨神经缺损的效果。方法 28只体重在160～200g的雌性F344大鼠随机分成4组，每组7只。A组：种植经诱导5d后的同源骨髓基质干细胞并具有内部支架结构的中空管；B组：种植同源许旺细胞并具有内部支架结构的中空管；C组：无细胞只具有内部支架结构的中空管；D组：自体神经移植组。术后3个月，进行系列神经电生理监测、坐骨神经功能指数测定、神经组织学观察、S—100及神经微丝蛋白兔疫组化染色和轴突计数等检查。结果 术后12周内，实验组(A组)的各项检测指标均优于C组(P＜0．05或0．01)，与B和D组间差异无显著性(P＞0．05)。结论 初步结果显示经诱导的骨髓基质干细胞可作为外周神经组织工程中的种子细胞，并应用于人工神经修复外周神经缺损。     

组织工程化脂肪基质细胞诱导脊柱融合的实验研究

目的 探讨组织工程化脂肪基质细胞诱导脊柱融合的能力.方法 从成年大鼠腹股沟处无菌获取脂肪组织,消化分离培养出脂肪基质细胞.在大鼠脊柱融合模型中将32只大鼠随机分为4组,每组8只,分别植入骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因重组的腺病毒载体转染的脂肪细胞(A组)、LacZ基因重组的腺病毒载体转染的脂肪细胞(B组)、未转染脂肪细胞(C组)、胶原海绵对照(D组).测定A组和B组的BMP-2的定量表达.比较4组术后4、6、8周X线片评分.8周后处死大鼠,进行MicroCT扫描分析和组织学观察.结果 ELISA法结果显示A组BMP-2表达水平为3.46 ng/mL,而B组无BMP-2表达.A组4、6、8周X线片评分分别为(4.56±1.01)分、(4.72±0.24)分、(4.92±0.13)分,均明显高于其他组,差异有统计学意义(P＜0.05).Micro CT和组织学切片均显示A组全部获骨性融合,而其他组均未融合.结论 组织工程化的脂肪基质细胞能够很好地诱导脊柱融合,有望成为一种新颖、有效的治疗方法.

Abstract：

Objective To assess the capability of inducing spinal fusion by adipose derived stromal cells in a rat model. Methods Adipose derived stromal cells were isolated from inguinal fat pads in rats.In the rat model of spinal fusion,32 rats were randomized into 4 groups.In group A,the cells infected with AdBMP-2 were implanted.In group B,cells infected with AdLacZ were implanted.In group C,uninfected cells were implanted.In group D,only collagen sponges were implanted.Expressions of BMP-2 were quantified in groups A and B.The radiographic scores were compared at weeks 4,6 and 8 among the 4 groups.After sacrifice at week 8,the spine samples were assessed by radiographs,MicroCT,and histological analysis. Results ELISA revealed a 3.46 ng/mL expression of BMP-2 in group A but no expression in group B.The mean radiographic scores for group A at weeks 4,6 and 8 were 4.56 ± 1.01,4.72 ± 0.24,4.92 ±0.13,significantly higher than those for the other groups ( P ＜ 0.05) .MicroCT and histological analysis revealed spinal fusion in all the rats in group A.None of the rats in the control groups developed fusion.Conclusion Because tissue engineered adipose derived stromal cells can induce spinal fusion,they may be a promising strategy for spinal fusion in the future.     

组织工程神经在修复周围神经缺损中的应用

周围神经缺损的修复与重建是当前神经领域的一大难题。目前，国内外学者已着力研究雪旺细胞和生物材料复合构建组织工程化人工神经，并将其与日益完善的显微外科技术结合起来，提高周围神经损伤的修复水平。本文结合国内外研究成果，对周围神经损伤修复的研究进行回顾，着重从组织工程方面阐述周围神经修复方法的现状与前景。     

富含血小板血浆凝胶复合脂肪间充质干细胞构建可注射组织工程髓核

目的:探讨以自体富含血小板血浆(PRP)凝胶复合脂肪间充质干细胞(ADSCs)构建可注射组织工程髓核的可行性。方法:将体外扩增的第3代兔ADSCs经流式细胞仪鉴定后接种至自体PRP凝胶中,体外立体培养2周、4周、8周时分别行大体观察、组织学检查、5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)免疫荧光法观察细胞在PRP凝胶中的分布及存活情况;分光光度法检测PRP凝胶-细胞复合体中糖胺聚糖(GAG)含量,实时荧光定量PCR法检测低氧诱导因子(HIF-1α)、蛋白多糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)基因表达情况。结果:流式细胞仪检测显示体外扩增的第3代细胞CD90阳性率为95.2%,CD45阳性率为0.9%。培养2、4、8周时PRP凝胶细胞复合体均为表面光滑的凝胶状,弹性较好;番红O染色2周时细胞外基质几乎不着色,4周时可见细胞周围呈粉色的弱阳性染色,8周时多数细胞周围呈红色阳性染色。HE染色和扫描电镜各时间点均可见细胞均匀分布于网络状支架内;BrdU免疫荧光法显示细胞在支架中生存状态良好,培养4周时阳性细胞数较培养2周时明显增多(P<0.05),8周时较4周时明显增多(P<0.05)。培养4周时GAG含量较培养2周时明显增高(P<0.05),8周时较4周时明显增高(P<0.05);培养4周时与培养2周时比较3个目的基因mRNA表达量均增高,差异有显著性(P<0.05),8周时与4周时比较亦明显增高(P<0.05)。结论:以兔自体PRP凝胶与ADSCs构建的复合体在体外培养时细胞可以向类髓核样细胞分化,用此方法构建可注射组织工程髓核具有可行性。     

大鼠脂肪干细胞生物学特性的研究

目的研究大鼠脂肪干细胞的生物学特性，为外周神经组织工程应用提供实验基础。方法从F344大鼠的脂肪组织分离得到脂肪干细胞，体外培养并扩增，倒置相差显微镜观察其形态，绘制生长曲线研究增殖能力，流式细胞仪检测表面标志，核型分析研究遗传学性能，最后以5．溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）进行体外标记。结果脂肪干细胞形态以梭形为主，CD11b、CD45、CD49d、CD80、CD86表达阴性，MHCⅠ、MHCⅡ表达弱阳性，CD29、CD44、CD54的表达阳性。第11代以前的脂肪干细胞有较强的活力和增殖能力，体外培养至第10代，其细胞仍稳定为二倍体核型。BrdU可标记其核。结论脂肪干细胞具有较强的自我更新能力，其形态和表面标志均类似大鼠骨髓间充质干细胞。     

去细胞神经种植脂肪干细胞的体外培养

目的探讨大鼠脂肪干细胞（ADSCs）与去细胞神经体外结合培养的方法。方法从成年F344大鼠的脂肪组织中分离培养ADSCs，用携带绿色荧光蛋白基因的复制缺陷性重组腺病毒载体（Ad-GFP）转染ADSCs。采用Triton X-100和脱氧胆酸钠去除大鼠坐骨神经中的细胞成分，将转染GFP的ADSCs通过微注射方法注入去细胞神经。用HE染色、电镜、荧光显微镜观察神经萃取及细胞种植后ADSCs的生长情况。结果Ad—GFP转染后，约85％的ADSCs可激发出绿色荧光。化学萃取可有效去除神经纤维中的细胞，ADSCs可在去细胞神经内生长并迁移。结论ADSCs通过微注射方法注入去细胞神经而构建的复合体可能成为一种新的神经缺损修复材料。     

腺病毒介导肝细胞生长因子基因感染脂肪干细胞

目的 观察腺病毒介导的肝细胞生长因子(Ad-HGF)对脂肪干细胞的感染效率以及感染后是否可形成有效的肝细胞生长因子(HGF),确定感染强度(MOI)值.方法 利用消化分离方法和脂肪干细胞贴壁生长的特性,分离人脂肪干细胞,利用相同MOI的Ad-HGF感染脂肪干细胞,ELISA法检测HGF的表达.结果 脂肪干细胞均呈贴壁生...     

不同培养条件对人脂肪源性干细胞生长状态的影响

目的 观察不同培养条件对人脂肪源性干细胞(hADSCs)体外生长状态的影响.方法 取腹部手术患者皮下脂肪组织,用0.1％的Ⅰ型胶原酶消化法分离出hADSCs,将获得的细胞分别在以下3组培养条件下培养:高糖DMEM培养基、高糖DMEM培养基+碱性成纤维生长因子(bFGF)、间充质干细胞培养基(MSCM).取第2代或者第3代细胞进行以下实验:细胞免疫荧光及流式细胞仪行细胞表面标志物CD31、CD34和Stro-1鉴定;绘制细胞生长曲线观察3组细胞的生长状态;采用不同的培养条件对3组细胞进行体外培养,观察细胞的增殖.结果 通过胶原酶消化法可成功地分离出hADSCs.流式细胞仪检测DMEM组CD31、CD34、Stro-1阳性率分别为0.9％、2.9％、56.7％;DMEM+ bFGF组CD31、CD34、Stro-1阳性率分别为1.3％、2.5％、73.5％;MSCM组CD31、CD34、Stro-1阳性率分别为0.7％、2.4％、84.5％.采用不同的培养条件对hADSCs进行培养,DMEM组、DMEM+ bFGF组、MSCM组细胞的倍增时间分别为93.7、64.5、49.1h,差异有统计学意义(p＜0.01).此外,各组中所培养的细胞在MSCM和高糖DMEM+ bFGF的培养条件下的增殖速率明显高于高糖DMEM培养条件(P＜0.05).结论 采用MSCM培养hADSCs可以在短期内获得大量细胞,在传统的高糖DMEM培养基中加入bFGF后也可以获得相似的效果,可以满足组织工程研究的种子细胞数量的要求.