核酶抑制表皮细胞HLA—I类抗原表达的实验研究

目的：表皮细胞可表达ＨＬＡ－Ｉ类抗原，抑制其表达可望延迟其排斥反应。方法：我们将ｐＬＸＲＺ（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ－Ｈ的表达载体）用脂质体结合甘油休克法转染培养的表皮细胞，观察其对排斥反应的影响。结果：通过转染细胞的ＰＣＲ产物证实ｐＬＸＲＺ已整合人细胞基因组ＤＮＡ中，免疫组化染色显示细胞ＨＬＡ－Ｉ类抗原表达较弱，流式细胞术检测显示细胞表达ＨＬＡ－Ｉ类抗原总数减少，结论：Ｒｉｂｏｚｙｍｅ－Ｈ的表达载体能够     

人类胎儿骨髓间充质干细胞的白细胞抗原表达特征

目的:对体外培养不同代数流产胎儿骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)的人类白细胞抗原Ⅰ类(human leukocyte antigen,HLA-Ⅰ)和HLA-Ⅱ类抗原表达情况以及经过不同浓度干扰素γ(IFN-γ)作用后HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类抗原的表达变化进行观察,为建立干细胞库进行细胞移植提供体外实验证据.本研究经北京大学医学部伦理委员会批准.方法:胎儿MSCs取自23～24周流产胎儿,体外培养后取第5和第12代的细胞,流式细胞仪分析HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类抗原的表达水平.经过终质量浓度为5 μg/L或50 μg/L的IFN-γ处理后,于24,48,72,96,120 h 检测HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类抗原的表达;并用RT-PCR方法定性分析第13代细胞HLA-E和HLA-G的mRNA表达.结果:胎儿骨髓MSC表达HLA-Ⅰ类抗原,几乎不表达HLA-Ⅱ类抗原.IFN-γ可以上调MSCs的HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类抗原.流式细胞分析显示HLA-Ⅰ类抗原阳性细胞占总细胞的比例超过50%,但HLA-Ⅱ类抗原阳性细胞不到10%.经过50 μg/L的IFN-γ处理后,第5代细胞HLA-Ⅰ类抗原阳性细胞百分率及荧光强度与未经处理的细胞相比明显增加,且荧光强度随时间延长呈现递增趋势.第12代细胞HLA-Ⅰ类抗原阳性细胞百分率及荧光强度的上调幅度明显低于第5代细胞.相同浓度IFN-γ(50 μg/L)作用于第5代和第12代细胞均可上调HLA-Ⅱ类抗原,第5代细胞于48 h开始上调(59.9%),第12代细胞于72 h开始上调(48.1%).第12代细胞HLA-Ⅱ类抗原上调幅度低于第5代细胞.不同浓度IFN-γ(5 μg/L和50 μg/L)处理后,HLA-Ⅰ类抗原和HLA-Ⅱ类抗原阳性细胞百分率均明显增加.RT-PCR结果显示,胎儿骨髓MSCs有HLA-E和HLA-G抗原的mRNA水平表达.结论:胎儿骨髓MSCs可以被IFN-γ诱导上调HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类抗原表达.体外培养传代能减低IFN-γ作用后的抗原上调幅度.胎儿骨髓MSCs具有HLA-E和HLA-G抗原的mRNA的表达.     

急性排斥反应时移植肾组织HLA-Ⅱ的表达

【目的】检测肾功能异常尤其是急性排斥反应时移植肾组织内HLA-Ⅱ的表达情况。【方法】对同种异体移植肾患者在出现肾功能异常时,随时行经皮肾穿刺活检获取植肾组织,用免疫组化方法检测活检组织中HLA-Ⅱ的表达情况。【结果】53例肾移植受体因肾功能异常共行肾活检64次,其中急性排斥反应28例次,非急性排斥反应27例次,抗排斥后7 d 9例次。急性排斥反应时(AR)HLA-Ⅱ抗原在系膜细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和炎性细胞上的表达均较非急性排斥反应(N-AR)组增加,抗排斥治疗7 d后明显下降。【结论】移植肾组织内HLA-Ⅱ类分子表达与急性排斥反应密切相关。     

各型乙型肝炎HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原免疫组织化学研究

用免疫组织化学桥联酶标APAAP法和PAP法对各型乙型肝炎113例检测了肝内的HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原、T细胞亚群、HBsAg和HBcAg,同时测定血清HBV DNA(斑点杂交)和β_2微球蛋白(RIA)。结果表明;急性肝炎、慢性活动性肝炎、重症肝炎患者的肝细胞HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达增强,尤以Ⅰ类抗原明显,慢性迁延性肝炎则几乎无表达。肝细胞HLA-Ⅰ类抗原表达与肝内炎症反应、肝细胞膜型HBSAg和浆膜型HBcAg关系密切,肝内活动性病变主要浸润细胞为CD_2~ 细胞,CD_0~ 细胞构成主要的细胞亚群。认为抗原依赖的、HLA限制的细胞毒性T细胞效应是构成乙型肝炎免疫损害的主要机制。     

原发性肝细胞癌的HLA—Ⅰ类抗原表达

目的 确定体内原发性肝细胞癌细胞的HLA-Ⅰ类抗原表达情况。方法 采用免疫组织化学LSAB法对6例原发性肝细胞癌冰冻组织进行研究。结果 6例标本的肝癌细胞都有较强的HLA-Ⅰ类抗原表达。结论 从HLA-Ⅰ类抗原表达角度看,研制肝癌CTL疫苗是可行的。     

CⅡTA基因在五种人类恶性血液病细胞株细胞中的表达及意义

目的:探讨5种血液病细胞株细胞的HLA-Ⅱ类抗原表达,以及对IFN-γ诱导HLA分子表达的反应性与MHCⅡ类分子反式激活因子 (CⅡTA) 表达的关系.方法:采用流式细胞术和免疫组化法检测肿瘤细胞HLA分子及CⅡTA 蛋白的表达,RT-PCR检测肿瘤细胞CⅡTA基因表达.混合淋巴细胞反应检测肿瘤细胞刺激外周血T细胞反应的能力.结果:肿瘤细胞HLAⅡ类分子表达与CⅡTA表达一致; 结构型或诱导型表达CⅡTA的肿瘤细胞,经IFN-γ作用后其HLAⅠ、Ⅱ类抗原表达增高;IFN -γ诱导后仍不表达CⅡTA的肿瘤细胞,其对IFN-γ促HLAⅡ表达的作用不反应.Jurkat诱导后刺激T细胞表达高水平的IL-2 mRNA.结论:某些恶性血液病细胞株细胞对IFN-γ不能诱导HLA分子表达与CⅡTA诱导型表达缺陷有关,表明CⅡTA参与调控肿瘤细胞 HLAⅠ、Ⅱ类抗原表达,可能在肿瘤免疫逃逸中起重要作用.     

人肝癌细胞的HLA-Ⅰ类抗原表达

为了为肝癌细胞毒性T细胞疫苗设计、构建及免疫治疗策略的决策提供体外实验研究依据,采用免疫细胞化学LSAB法及流式细胞术观察了体外培养人肝癌细胞的HLA-Ⅰ类抗原表达情况.结果显示,人肝癌细胞株Alexander、HepG2、SMMC-7721、QGY-7703都有较强的HLA-Ⅰ类抗原表达,这使细胞毒性T细胞杀伤肝癌细胞成为可能.     

HLA-G与原因不明复发性流产

HLA-G诱导的母胎免疫耐受是保证胎儿免遭母体排斥、妊娠得以顺利进行的关键。HLA-G属非经典HLA-Ⅰ类抗原,可在胎盘绒毛外滋养细胞选择性高表达,主要通过与NK、T细胞表面的杀伤抑制性受体结合,激活胞内免疫受体酪氨酸抑制基序,抑制杀伤及细胞毒活性。滋养细胞HLA-G表达降低或异常表达,影响其与NK、T细胞的结合而阻碍抑制性信号转导,母胎界面出现NK细胞表型以及NK、T细胞功能异常、功能性细胞因子分泌改变等妊娠期免疫紊乱现象,造成母体对胚胎抗原的免疫攻击,导致引发原因不明复发性流产。     

沙眼衣原体感染对Hela细胞HLA-Ⅰ类分子表达的影响

目的 探讨沙眼衣原体(Ct)感染对上皮细胞系Hela细胞HLA-Ⅰ类分子表达的影响。方法 用直接免疫荧光和流式细胞仪分析等方法,对感染Ct的Hela细胞HLA-Ⅰ类分子表达水平进行检测。结果 Ct感染的Hela细胞HLA-Ⅰ类分子表达水平随感染剂量增加和感染时间延长而下降,并且IL-10抗体能部分抑制这种下降。结论 Ct感染可下调Hela细胞HLA-Ⅰ类分子表达,下调与感染过程中分泌的IL-10有关,这可能是衣原体持续感染的一种重要原因。     

RNAi抑制大鼠骨髓源树突状细胞MHC-Ⅱ表达的研究

目的:应用RNAi技术探讨靶向主要组织相容性复合物Ⅱ类抗原反式转录激活因子(C Ⅱ TA)的shRNA质粒载体抑制大鼠骨髓源树突状细胞(DC)表面MHC-Ⅱ类抗原表达的可行性.方法:体外培养大鼠骨髓源DC:流式细胞仪检测DC表面抗原MHC-Ⅱ、OX-62表达情况;体外合成针对C Ⅱ TA mRNA序列特异性C Ⅱ TA shRNA并构建质粒,在阳离子脂质体介导下转染DC;流式细胞仪检测细胞表面抗原MHC-Ⅱ表达水平的变化.结果:(1)经体外培养DC可用于后续反应,体外构建质粒成功;(2)流式细胞仪检测显示C Ⅱ TA-shRNA质粒组中DC转染后MHC-Ⅱ的抗原水平均较对照组明显降低.结论:利用C Ⅱ TA shRNA质粒载体沉默C Ⅱ TA基因从而下调MHC-Ⅱ的表达的策略是可行的,为降低移植排斥反应提供了实验依据.     

间接抗原递呈途径在同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用研究

目的　探讨间接同种异型识别在体外培养的同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用。方法　体外分离培养人表皮细胞 (Epidermalcells ,EC)、异体人外周血淋巴细胞 (Peripheralbloolymphocytes ,PBL)和单个核细胞 (Peripheralbloodmononuclearcells ,PBM ,含单核细胞 )。将毒性T淋巴细胞相关抗原 4(CTLA4Ig)腺病毒载体转染EC。转染与未转染的EC中均加入异体PBL或PBM共同培养 ,应用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷 ( 3H TdR)掺入法 ,测定各培养系中PBL、PBM增殖情况。结果　CTLA4Ig腺病毒载体能成功转染EC并表达相应蛋白。未转染的EC刺激异体PBL轻度增殖 (P <0 .0 5 ) ,以及刺激含单核细胞的PBM明显增殖 (P <0 .0 1) ;经CTLA4Ig腺病毒载体转染的EC刺激PBL、PBM增殖则明显减弱 (P <0 0 5 )。结论　间接同种异型识别在EC排斥中发挥了重要作用 ,CTLA4Ig能明显减轻该作用。     

HLA-Ⅰ、CD8和CD4在宫颈不同病变组织中的表达及意义

目的 检测人类白细胞抗原1（HLA-Ⅰ）类抗原、CD8和CD4分子在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变（CIN）、宫颈癌和癌旁组织中的表达,探讨其表达与宫颈不同病变的关系.方法 宫颈癌、CIN、慢性宫颈炎和癌旁组织标本各20份,采用免疫组织化学SP法检测HLA-Ⅰ类抗原、CD8和CD4分子的表达.结果 在宫颈癌、CIN、慢性宫颈炎和癌旁组织中,HLA-Ⅰ类抗原的阳性表达率分别为40%、95%、100%和100%,宫颈癌组的表达率明显降低（P＜0.01）;CD8分子的阳性表达率分别为35%、95%、100%和100%,宫颈癌组的表达率明显降低（P＜0.01）;CD4分子的阳性表达率分别为45%、80%、100%和100%,宫颈癌组的表达率亦明显降低（P＜0.01）.HLA-Ⅰ类抗原和CD8分子的表达呈正相关（r=0.913,P＜0.001）.结论 HLA-Ⅰ类抗原、CD8和CD4分子在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中表达减少及无表达,3者在宫颈病变程度由低到高的发生发展过程中可能起着重要的保护作用.     

整合素β1在人表皮细胞株HaCaT增殖中影响的研究

目的探讨β1整合素对表皮细胞增殖的影响.方法将重组整合素β1小干扰RNA表达载体(siIntegrin β1)转染到HaCaT细胞株中,应用免疫印迹(Western blotting)方法检测靶基因的抑制情况,应用细胞计数法检测表皮细胞增殖情况.结果重组siIntegrinβ1 转染HaCaT细胞株能够抑制靶基因整合素β1 的表达,抑制细胞增殖.结论在人表皮细胞株HaCaT中抑制整合素β1表达可抑制HaCaT增殖,为进一步研究整合素在表皮细胞中的基因表达调控奠定了基础.     

肾移植交叉反应组配原则临床应用分析

目的探讨人类白细胞抗原(HLA)交叉反应组(CREGs)配型原则在临床肾移植中的应用及意义.方法对传统配型原则Ⅰ类抗原错配(MM)2个以上位点的149例肾移植,采用CREGs配型原则选择供受者,观察其术后一年存活率及术后一月内急性排斥反应发生率情况.结果 在不考虑DR位点的情况下, 按CREGs配型原则选择供受者,供受者HLA-Ⅰ类抗原0、1和2MM数分别为36例(24.16%),62例(41.61%)和51例(34.22%);术后一月内急性排斥反应发生率分别为16.67%(6例)、27.40%(16例)和43.14%(22例);术后一年存活率分别为97.22%(35例)、93.55%(58例)和 82.35%(42例).结论 在传统配型不满意的情况下,对HLA-Ⅰ类抗原采用CREGs配型原则选择供受者,可以获得满意的移植肾一年存活率,减少术后排斥反应发生率,为等待供肾的患者提供了更多机遇,同时亦为获得配型良好的供肾提供了机会.     

人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA及表达载体的构建

目的 针对Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链设计、构建人鼠同源的Ⅰ型胶原siRNA(COL1A1-siRNA)及其表达载体,并证实其有效性.方法 利用软件设计人鼠完全同源的一对Ⅰ型胶原siRNA序列,并构建其表达载体.直接将Ⅰ型胶原siRNA和构建的质粒转染至大鼠系膜细胞,利用KT-PCK方法观察对系膜细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制作用.结果 Ⅰ型胶原siRNA转染至大鼠系膜细胞后,与空白对照组及MOCK组比较,能够抑制Ⅰ型胶原的表达.其质粒对Ⅰ型胶原表达的抑制作用更加显著,呈剂量依赖性.结论 所设计的Ⅰ型胶原siRNA为人与大鼠完全同源的siRNA序列,所有碱基完全匹配.可以成功转染到大鼠系膜细胞,并有效抑制Ⅰ型胶原在细胞内的表达.质粒载体的方法同样能够抑制Ⅰ型胶原的形成,而且表达更稳定,作用更显著.     

腺病毒介导mIFN-β基因转染的小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性

目的研究腺病毒(Ad)介导mIFN-β基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性.方法用Ad为载体将mIFN-β基因导入B16细胞,观察mIFN-β基因转染的B16细胞的体外增殖能力及免疫原性的改变.结果当MOI为50～100,即可获得较高的转染效率,达90%±1%,转染细胞能表达分泌mIFN-β并具有生物学活性;AdmIFN-β感染对B16细胞的增殖能力无影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达.结论 Ad载体具有较高的转移效率,并能使其携带的mIFN-β基因有效表达;AdmIFN-β转染的B16细胞的免疫原性显著增强.提示利用Ad载体携带有效的目的基因来治疗肿瘤甚至开发瘤苗是可行的.     

人类白细胞Ⅰ、Ⅱ类抗原的中分辨度基因芯片分型技术研究

目的 应用基因芯片技术进行北方汉族人群人类白细胞抗原（HLA）Ⅰ、Ⅱ类中分辨度分型研究.方法 根据中国北方汉族人群HLA-Ⅰ、Ⅱ类常见的基因位点以及临床应用中对分型分辨度的实际需要,设计特异性寡核苷酸中分辨度分型探针,制成基因分型芯片.采用带荧光标记的引物,用合适的PCR方法扩增HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原上的多态性区域,产物与芯片上探针杂交.杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断阳性探针,以此确定样品基因型.共检测30份临床样本.结果 所有样本的HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原基因分型均获成功.此中分辨度探针可分辨出598个Ⅰ类抗原等位基因,511个Ⅱ类抗原等位基因,可捡出Ⅰ抗原特异性57个,Ⅱ抗原特异性30个.结论 基因芯片用于HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原分型可行.     

转人HT基因在抗异种移植免疫排斥的研究

用脂质体转染方法将人类α1，2岩藻糖苷转移酶(HT基因)转入猪的血管内皮细胞中(PIEC)，经G418筛选两周获得具有抗性的克隆，增殖传代，当细胞达到一定数量时消化收集，流式细胞仪检测转染细胞的表达情况。结果显示HT基因的转染是有效的，明显地提高了H抗原的表达，同时降低了α—Gal的表达，在异种移植研究中抑制超急性排斥反应(HAR)和延迟性排斥反应(DXR)均起到一定的作用。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染人表皮细胞的免疫细胞化学研究

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体(pEGFP-C3-bFGF)转染体外培养的人表皮细胞后细胞表型的变化. 方法:通过脂质体(Lipofectamine TM2000)转染法,将pEGFP-C3-bFGF转染至人表皮细胞系(HEKa细胞)中,36h后采用免疫细胞化学染色法检测分析β1整联蛋白、CK19、CK14及CK10在表皮细胞中表达的变化,同时以pEGFP-C3质粒转染的表皮细胞作为对照. 结果:实验组细胞中CK19、CK14的表达增强, 而CK10作为终末分化细胞的标志表达减弱. 结论:pEGFP-C3-bFGF转染后,分化成熟的表皮细胞向幼稚型细胞方向发生去分化,为探讨 bFGF调控表皮细胞去分化的分子机制提供实验参考.     

腺病毒载体影响大鼠催乳素细胞增殖功能的机制初探

目的 探讨转染腺病毒载体对大鼠催乳素细胞增殖功能的影响及作用机制.方法 应用BrdU标记法检测转染腺病毒载体后大鼠垂体催乳素细胞的增殖功能,免疫荧光方法和荧光素酶报告基因分别检测转染腺病毒载体的催乳素细胞中磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(pCREB)和cAMP反应元件(CRE)的表达.Western blot方法检测腺病毒载体对垂体前叶细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响.结果 转染腺病毒载体的催乳素细胞组较未转染组增殖功能明显增强(P＜0.01),pCREB蛋白和CRE元件的表达均明显增加(P＜0.01),PCNA蛋白的表达亦明显增强(P＜0.01).结论 应用腺病毒载体转移基因将增加大鼠催乳素细胞的增殖功能,其细胞内信号转导机制可能与腺病毒载体诱导pCREB、PCNA蛋白的表达增强有关.