绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的人脂联素（Adiponectin）真核表达质粒。方法：用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体pMD18—T／Adiponeetin为模板，结合已设计好的特异性引物。采用PCR方法克隆出Adiponectin目的片段，将该目的片段再连至真核表达载体pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO上，转化入TOP10感受态细胞中，通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO—Adiponectin。结果：PCR获得长度为736bp的目的片段，经pcDNA3．1／CT—GFP-TOPO真核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与genebank检索的人脂联素cDNA序列（Accession NM-004797）100％配。结论：绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。     

利用增强型绿色荧光蛋白基因作筛选标记克隆载体的构建及鉴定

目的构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记的新型pUC18筛选载体。方法将EGFP基因克隆至pUC18载体的PstI/HindⅢ位点,构建筛选载体pUC18-EGFP,并验证pUC18-EGFP能否利用EG-FP的荧光特性筛选出含基因重组体的阳性克隆。结果经酶切和基因测序鉴定pUC18-EGFP载体构建正确;在外源基因插入该载体后,对LB氨苄平板上的绿色菌落进行酶切和基因测序鉴定,结果证明LB平板上的绿色菌落即为含有重组质粒的克隆。结论成功构建pUC18-EGFP筛选载体,利用EGFP的绿色荧光可筛选出阳性克隆。     

含绿色荧光蛋白报告基因rhPDGF-BB非融合型表达载体的构建及其转染

目的：构建并转染含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的重组人血小板衍化生长因子-BB（rhPDGF-BB）非融合型表达载体，为采用转基因工程化细胞修复糖尿病溃疡创面奠定基础。方法：从人脐静脉内皮细胞human umbil ical vein endothelial cell，HUVEC）中分离总RNA，行RT—PCR获得rhPDGF—BB cDNA，构建克隆质粒pMD 19-T／rhPDGF—BB，经测序正确后，再将该目的片段与真核表达载体pSELECT—GFPzeo—mcs连接，转化E．coli DH 5α感受态菌落筛选得到含GFP报告基因的非融合型表达载体，然后将其转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）并用免疫组化染色法鉴定。结果：PCR获得长度为681bp的目的片段，经pSELECT-GFPzeo—mcs载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入目的片段与GenBank检索的rhPDGF-BB cDNA序列（NM-033016）完全匹配。结论：成功构建了非融合型表达载体pSELECT-GFPzeo—mes／rhPDGF-BB，并实现了rhPDGF-BB基因在CHO的表达。     

Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究

目的:表达具有双功能特性的Exendin-4-GFP融合蛋白。方法:构建融合表达载体pET21a( )/Exendin-4-GFP,转化大肠杆菌BL21后,以IPTG诱导融合蛋白的表达,并利用镍金属螯合层析树脂对其进行纯化。采用胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)转染的CHO细胞考察融合蛋白的结合特性,并检测其生物活性。结果:含有融合表达载体的重组菌株诱导表达后,经SDS-PAGE及免疫印迹分析显示,31.0ku的融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,且具有Exendin-4的抗原活性。受体结合实验表明,该融合蛋白能够与GLP-1R特异性结合,在488nm激发光下呈现绿色荧光。体内活性实验表明,融合蛋白具有明显的降血糖活性。结论:本研究表达的Exendin-4-GFP融合蛋白同时具有Exendin-4的活性和荧光特性,为研究GLP-1受体功能以及Exendin-4与细胞相互作用的机制奠定了基础。     

反义PCDNA3.1(+)/TIMP-1真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒。方法：用Trizol Reagent抽提肝组织中总RNA．采用两对套式引物，以逆转录巢式PCR方法扩增TIMP-1目的片段，双酶切纯化PCR产物及PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒。再将TIMP-1反向插入PCDNA3.1（＋）线性质粒，即构建成反义TIMP-1／PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定。结果：DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论：反义TIMP-1／PCDNA3．1（＋）真核细胞表达质粒构建成功。     

新型报导基因及绿色荧光蛋白发光特性的研究

绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）是一个极有潜力的新型报导基因。本文将突变型ｇｆｐ３′末端不同程度地截短，构建成表达载体，在大肠杆菌ＢＬ２１中表达孙同长度的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ），当其生色基因中６５位Ｓｅｒ点突变成Ｔｈｒ，则ＧＦＰ的激发波由３９６ｎｍ增至４７０ｎｍ，不用ＵＶ激发，仅在自然光源下就可看到强烈的绿色荧光，发光强度增加６倍，若从３′端截短１２个氨基酸密码，对发光无影响，但截短７５个氨基酸密码，则     

大鼠CB1基因真核表达载体的构建及初步鉴定

目的:构建大鼠Ⅰ型大麻素受体(CB1)真核基因表达载体,并检测其在细胞中的表达情况。方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出CB1基因片段,产物连接到p MD18-T载体上。阳性实验筛选出阳性克隆,经Eco RⅠ、Bam HⅠ双酶切及测序鉴定后,将其连接到载体pc DNA 3.1(+)中,构建质粒载体pc DNA3.1(+)-CB1,脂质体转染原代人胚肾293细胞(HEK293细胞)。用Western blot实验鉴定细胞中CB1蛋白的表达,用免疫荧光细胞染色联合激光扫描共聚焦法检测其在细胞中表达的部位。结果:采用RT-PCR成功获得大鼠CB1基因,PCR扩增得到1 500 bp左右的CB1基因片段,双酶切鉴定及DNA测序证实质粒载体pc DNA3.1(+)-CB1构建成功。Western blot实验、免疫荧光细胞染色联合激光扫描共聚焦法证实载体pc DNA3.1(+)-CB1能在HEK293细胞中表达,且表达产物主要分布在细胞膜表面和细胞质中。结论:构建的pc DNA3.1(+)-CB1表达载体能成功转入真核HEK293细胞,并在细胞膜表面和细胞质中表达CB1蛋白。     

hTPO膜外区基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的:探索克隆人甲状腺过氧化物酶(hTPO)膜外区基因并构建其杆状病毒表达载体。方法:PCR扩增hTPO膜外区基因,并将其先后重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBac1质粒,以hTPO-pFastBAC1质粒转染E.coliDH10Bac大肠杆菌,获得重组hTPO杆状病毒表达载体(hTPO-Bacmid),每一步均以PCR及酶切、基因测序等方法鉴定其正确性。结果:与预期一致,PCR扩增hTPO膜外区基因的产物为一约2.5kb的条带;hTPO-pGEM3zf(+)经EcoRⅠ+HindⅢ、EcoRⅠ+SalⅠ双酶切后均获得2.5和3.2kb条带;hTPO-pFastBAC1以EcoRⅠ+HindⅢ双酶切得到2.5和4.8kb的带,均符合预期。分别以重组hTPO-pGEM3zf(+)质粒、hTPO-pFastBAC1质粒为模板进行PCR扩增鉴定,均得到约2.5kb的目的条带;对hTPO-Bacmid进行PCR鉴定,得到约4.8kb的片段。对hTPO-pFastBAC1上下游接口测序正确无误。结论:本研究成功克隆了hTPO膜外区基因,并完成了其杆状病毒表达载体hTPO-Bacmid的构建。     

人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人脂联素重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行鉴定。方法:将构建好的人脂联素克隆载体PUC57/ADPN与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中。通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体PQE30/ADPN,并用IPTG在大肠杆菌M15中诱导表达。结果:PCR获得长度为753bp目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入的目的片段与GenBank检索的人脂联素cDNA序列(Accession NM-004797)100%匹配;含重组Adiponectin质粒的大肠杆菌经0.4mmol/L的IPTG诱导6h后有表达。结论:应用并成功构建了人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN,且在大肠杆菌中获得有效表达。     

TRAF6基因RNA干涉表达载体的构建及鉴定

目的构建针对小鼠肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的mRNA的siRNA真核表达载体,并鉴定其正确性。方法利用基因重组技术,化学合成用于产生针对TRAF6的发卡状RNA的寡核苷酸,各64个碱基,退火后插入线性化的pSUPER载体的H1启动子下游。重组载体分别用限制性酶切和测序鉴定其正确性。结果限制性酶切和序列测定表明成功构建了可以表达针对TRAF6的发卡状RNA表达载体。结论成功构建了针对TRAF6的发卡状RNA表达载体,为研究TRAF6的功能和进一步的基因治疗提供了实验基础。     

小鼠核结合因子a1基因启动子报告载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠核结合因子a1(Cbfa1)基因启动子萤光素酶报告载体,并检测其驱动报告基因的转录活性。方法:以小鼠基因组DNA为模板,巢式PCR扩增含有Cbfa1基因启动子(-1000～+200bp)的序列。限制性内切酶MluI和XhoI酶切这段序列后定向克隆到不含启动子的PGL3-Basic报告基因载体上,重组质粒命名为pGL3-Cbfa1。pGL3-Cbfa1瞬时转染成骨细胞系MC3T3-E1,检测其能否在Cbfa1基因启动子的调控下表达报告基因并提高萤光素酶活性。结果:pGL3-Cbfa1经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明Cbfa1启动子具有转录活性,pGL3-Cbfa1的萤光素酶水平约是pGL3-Basic的35倍。结论:小鼠Cbfa1启动子报告基因载体的成功构建,为进一步将其用于抗骨质疏松药物的筛选与评价奠定了实验基础。     

肿瘤—睾丸基因SSX1的原核表达载体的构建

目的：构建肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体,为进一步表达、纯化SSX1蛋白,制备肝癌疫苗奠定基础。方法：行RT-PCR从肝细胞癌组织中扩增CT基因SSX1,将SSX1和pMAL-C2质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,然后连接并转化大肠杆菌DH5α,最后对重组质粒进行蓝白斑筛选,酶切和测序鉴定。结果：重组表达质粒经鉴定准确无误。结论：成功构建了肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体。     

TAT-BDNF载体构建及融合蛋白表达

目的构建重组表达载体TAT-BDNF,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白,为研究TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。方法经RT-PCR获得编码人BDNF的全基因序列,连接到原核表达载体pTAT上,得到重组表达载体pTAT-BDNF,转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-BDNF融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白。结果成功构建了TAT-BDNF融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白。结论为进一步研究TAT蛋白转导作用奠定了基础。     

r-PA真核表达载体的构建与鉴定

用SV40和CaMV 35S两种启动子分别启动瑞替普酶(reteplase，r-PA)和标记基因bar基因，构建能在海带中表达外源基因的重组表达载体。通过PCR方法扩增CaMV35S启动子、bar基因和r-PA基因，将扩增的3个片段分别克隆到pGEM-T Easy Vector上。将CaMV片段亚克隆到pCAT3-control载体上得到重组质粒pCAT／CaMV；再将bar基因切下插入到CAT／CaMV上得到重组质粒pCAT／C-B，最后将rPA基因片段切下后插入到pCAT／C-B上获得重组质粒pSVrPA／C-B。PCR、酶切及测序结果均表明已成功扩增出CaMV 35S、r-PA和bar基因片段，并已顺次正确插入到真核表达载体PCAT3-control上，最终成功构建了能在海带中表达r-PA的真核表达载体，用基因枪法转入海带中表达，FAPA法测定得到有体外纤溶活性的阳性海带，为后续研究工作打下坚实的基础。     

真核表达载体pEGFP-C3-MASH-1的构建

目的构建含小鼠MASH1基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MASH1，为进一步研究MASH1在间充质干细胞神经分化中的作用打下基础。方法应用RT-PCR方法从小鼠13．5d胚胎组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoRI酶切位点的MASH1cDNA编码片段，经回收、纯化、酶切后，依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果酶切及测序结果表明：重组质粒PEGFP-C3含有MASH-Ⅰ片段，方向及大小正确。结论成功构建了小鼠真核表达载体PEGFP-C3-MASH-Ⅰ。     

MIBP1基因敲除载体的构建

目的:构建MIBP1基因敲除载体。方法:以小鼠129胚胎干细胞基因组DNA为模板,根据GenBank注册序列,扩增小鼠MBP-2基因启动子区5′端片段(5′arm)和内含子区3′端片段(3′arm),然后分别克隆进敲除载体pKOScramblerNTKV-1906,酶切鉴定后即得到MIBP1基因敲除载体pNTKV-3′,5′arm。用SalⅠ对pNTKV-3′,5′arm线性化,用于胚胎干细胞电转染。结果:成功扩增并克隆到小鼠129胚胎干细胞MBP-2基因的5′arm和3′arm片段,构建了MIBP1基因敲除载体。结论:成功构建了MIBP1基因敲除载体。     

含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒,并在肺腺癌细胞A549中验证其复制能力和溶瘤特性。方法:建立重叠延伸PCR方法,用该方法制备的E1A-IRES片段插入AdEasy载体构建含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒rAdE1A-CDglyTK。并用该病毒与复制缺陷型重组腺病毒rAd-CDglyTK分别感染肿瘤细胞A549,从荧光蛋白表达、细胞病变及病毒增殖等方面进行比较,以确定其复制能力及溶瘤特性。结果:成功构建了含融合自杀基因CDglyTK的复制型重组腺病毒rAdE1A-CDglyTK,该病毒感染肿瘤细胞A549后报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达,能大量增殖并出现明显的细胞病变效应(CPE)。结论:构建的复制型重组腺病毒在肿瘤细胞内的复制能力、溶瘤特性和外源基因的表达明显优于目前广泛应用的复制缺陷型重组腺病毒。     

人IL—15cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建人白细胞介素－１５（ＩＬ－１５）ｃＤＮＡ真核表达载体,以期在哺乳类细胞中获得高效、稳定表达。方法 从外周血粘附性单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ,并与ｐｃＤＮＡ３．１质粒的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ位点定向连接,构建受控于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３１－ＩＬ－１５。结果 经ＰＣＲ扩增鉴定和ＤＮＡ序列分析,证明ＩＬ－１５已经正确插入克隆载体且序列正确。