肺腺癌中表皮生长因子受体基因突变与拷贝数的检测分析

目的检测肺腺癌组织中表皮生长因子受体（EGFR）19、21外显子基因突变和拷贝数,分析EGFR基因突变和拷贝数变化的相关性。方法应用荧光定量PCR技术和荧光原位杂交（FISH）技术分别检测58例肺腺癌患者肿瘤组织中的EGFR基因突变和基因扩增,用X^2检验进行数据分析。结果58例肺腺癌患者组织中,EGFR19、21外显子突变率为43．1％（25／58）,其中2例存在两种类型的突变。EGFR基因拷贝数增加阳性率为51．7％（30／58）,包括8例扩增,22例高多体扩增。不同分化程度的肺腺癌组织间,扩增阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）,低分化癌的突变率低于高、中分化癌（P〈O．05）。EGFR基因突变与EGFR基因拷贝数之间显著相关（P〈0．01）。结论肺腺癌组织具有较高的EGFR基因突变率和扩增阳性率;联合检测EGFR基因拷贝数和基因突变,更有利于靶向药物的筛选。     

变性高效液相色谱技术检测非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变的研究

 目的　探讨采用变性高效液相色谱（DHPLC）技术检测表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的优势。方法　应用DHPLC技术检测49例非小细胞肺癌（NSCLC）患者EGFR基因第19与21外显子突变情况,并应用DNA直接测序法验证DHPLC检测基因突变的准确性。结果　49例NSCLC患者中,应用DHPLC检测出13例EGFR基因突变;其中第19外显子缺失突变10例（76.92 %）;第21外显子替代突变3例（23.08 %）。DNA直接测序法突变检测结果与DHPLC一致,DHPLC检测EGFR基因突变灵敏度为100 %。结论　DHPLC技术可以快速、准确、大规模筛选EGFR基因突变。     

PCR-SSCP检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的敏感性分析

目的 探讨分析PCR-SSCP检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的敏感性.方法 应用PCR-SSCP检测36例非小细胞肺癌标本的突变情况,阳性结果再进行DNA测序.结果 通过PCR-SSCP分析,11例存在突变,突变率为30.6%(11/36);PCR-SSCP分析阳性的结果通过DNA测序全为序列异常.结论 PCR-SSCP检测肺癌EGFR基因突变具有较高的敏感性.     

上皮生长因子受体外显子21基因突变L858R的实时定量PCR检测

目的应用实时定量PCR技术建立上皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)外显子21基因突变L858R的检测新方法。方法根据Taqman-MGB原理设计野生型外显子21和L858R特异性探针,经过优化制备成试剂盒检测171例肺癌组织中的L858R基因突变,并将结果与基因测序进行对比分析。结果171例肺癌组织经基因测序共检出L858R突变15例,突变率为8.8%。突变多见于女性、肺腺癌及腺鳞癌。定量PCR检测显示,15例突变型组织的R值平均为0.840±0.223,而156例野生型组织的R值平均为1.552±0.278,两组间差异具有统计学显著意义(P<0.001)。此外,以突变型为主的肺癌组织其R值(0.613±0.137)显著低于野生型占优势组织(0.992±0.103),两组间差异极为显著(P<0.001)。实验证明,定量PCR检测方法对L858R基因突变具有高度特异性,其最低检测限度为突变型DNA占野生型DNA含量的12.5%。结论本方法检测EGFR基因L858R突变具有敏感性高、特异性好、简便快速等优点,应用本方法不仅可以对野生型EGFR外显子21或突变型L858R进行诊断,而且还可以根据R值判断样本中突变型基因的比例。     

扩增阻滞突变系统法检测非小细胞肺癌微小标本表皮生长因子受体突变

目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)微小标本代替大体标本用于扩增阻滞突变系统(ampli cation refractory mutation system,ARMS)法检测表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor,EGFR)基因突变的可行性。方法:181例NSCLC标本纳入本研究,包括157例微小标本(分别为CT引导下经皮肺穿刺活检标本、支气管内超声引导下针吸活检标本、淋巴结活检标本、支气管镜活检标本和胸腔积液)和24例大体标本。采用QIAGEN DNA提取试剂盒提取标本组织DNA,然后使用AmoyDx人类EGFR基因4种突变荧光PCR检测试剂盒检测EGFR基因的突变情况,最后采用χ2检验或Fisher精确检验比较微小标本与大体标本的EGFR突变检出率。结果:181例标本中,EGFR的总突变率为39.8%(72/181);其中微小标本的EGFR突变检出率为38.9%,大体标本的EGFR突变检出率为45.8%,2者间差异无统计学意义(P=0.515)。EGFR突变率在不吸烟患者(P=0.033)和腺癌患者(P<0.001)中显著增高。结论:ARMS法检测NSCLC微小标本也能获得较高的EGFR突变检出率。对于晚期难以获得大体标本的NSCLC患者,微小标本可代替大体标本应用于临床EGFR突变检测。     

TaqMan-MGB探针实时荧光聚合酶链反应快速检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)瘤组织表皮生长因子受体(EGFR)基因突变及TaqMan MGB探针实时荧光PCR快速检测EGFR突变的诊断价值。方法应用聚合酶链(PCR)反应,对80例手术切除NSCLC瘤组织EGFR基因的第18、19和21外显子片段进行扩增和测序, Chromas软件分析基因突变。设计EGFR突变位点的TaqMan MGB探针,采用实时PCR检测瘤组织EGFR突变,并与测序结果比较。实时PCR的敏感性与特异性评价,用不同混合数量的PC-9细胞(19外显子缺失)为阳性参照。结果21例NSCLC瘤组织存在EGFR基因突变,总体突变率为26.3%。其中13例为EGFR第19外显子阅读框内多核苷酸的缺失,8例为第21外显子2573位核苷酸点突变。诊断的特异性与敏感性均为100%。当PC-9突变型细胞仅占10%时或PC-9细胞数低达50只时,PCR仍然检测到EGFR基因突变的存在。女性、不吸烟和肺腺癌患者EGFR基因突变率显著高于男性、吸烟和非腺癌患者(P<0.05)。EGFR基因突变与患者年龄、TNM分期等因素无关。结论NSCLC存在EGFR基因的突变或缺失,其中以女性、腺癌和不吸烟患者突变率较高。TaqMan MGB探针联合实时PCR可有效地检测出EGFR基因突变,操作简便,易于临床推广。     

淋巴瘤组织中疱疹病毒6型特异DNA序列的PCR检测

目的探讨人疱疹病毒６型（ＨＨＶ６）与我国淋巴瘤的相关性。方法采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）的方法,检测石蜡包埋的淋巴瘤组织、白血病细胞株及健康献血员外周血淋巴细胞中ＨＨＶ６特异ＤＮＡ序列。结果５２例淋巴瘤组织中,２１例ＰＣＲ扩增出ＨＨＶ６特异ＤＮＡ序列,阳性率４０．４％;４３例献血员外周血淋巴细胞中,８例检测出ＨＨＶ６ＤＮＡ序列,阳性率１８．６％。两者相比,差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。两株白血病细胞株也扩增出ＨＨＶ６ＤＮＡ序列。结论ＨＨＶ６与我国淋巴瘤有一定关系。     

早期非小细胞肺癌组织中表皮生长因子受体Kras和BRAF基因突变及其临床意义

目的探讨Kras基因、BRAF基因与表皮生长因子受体(EGFR)之间的关系,为进一步研究Ras-Raf-MEK-ERK通路导致EGFR-TKI耐药的具体机制奠定基础。方法获取74例经手术治疗,术后未行放化疗和(或)靶向药物治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肿瘤组织标本,检测EGFR各位点,Kras及BRAF基因的突变,并做相关性分析。结果 EGFR exon 19、exon 21与Kras突变存在负相关,(相关系数r分别为-0.345和-0.309,P<0.01)。EGFR与BRAF,Kras与BRAF之间不存在相关性(P>0.01)。结论 EGFR突变与Kras突变呈负相关,与BRAF突变不存在相关性,Kras与Braf突变不相关,提示EGFR、Kras和Braf突变为相互独立的过程。     

非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变的异质性

表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在EGFR基因活化突变阳性晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中疗效显著,然而,同样是EGFR活化突变阳性的NSCLC患者接受EGFR-TKI治疗后,疗效仍有明显差异;同一个患者的不同瘤灶也会对EGFR-TKI表现出不同的反应,这些现象可能与EGFR基因突变异质性有关,同一瘤灶的不同部分、同一患者的不同瘤灶、同一瘤灶治疗前后,EGFR突变状态都有可能不一致.文章从三个方面对EGFR突变异质性研究进展作一介绍.     

实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌患者外周血和肿瘤组织表皮生长因子受体突变的研究

目的应用实时荧光定量一PCR(FQ-PCR)对非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血和肿瘤组织表皮生长因子受体(EGFR)突变进行检测,并分析该方法对肿瘤组织和外周血EGFR突变的一致性.方法采用FQ-PCR检测112例NSCLC外周血和87例NSCLC组织EGFR突变,对其中45例外周血和肿瘤组织进行配对检测,并研究分...     

肺组织标本荧光定量PCR内参基因精确性鉴定

 目的　分析比较广泛应用的内参基因β-葡萄糖苷酸酶（GUSB）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和β2-微球蛋白（β2-M）在中国人的肺癌组织及正常肺组织中的表达稳定性。方法　采用实时定量PCR技术（qRT-PCR）检测这3个看家基因在20例肺癌组织及相应癌旁正常肺组织中的表达情况,并用两款国际通用的内参基因筛选软件GeNorm和NormFinder分析其稳定性。结果　GAPDH在组内及组间的表达差异均最大[肿瘤与正常组内标准差（s）分别为1.07和0.93;|△C t|＝2.01±1.06;P＝0.000]。用两个软件分析均以3个基因的平均值做内参最为稳定,但t检验结果显示以GUSB和β2-M二者平均值作为内参的组内及组间表达差异最小,并且是唯一一个组合在肿瘤和正常组间差异无统计学意义（肿瘤与正常组内s分别为0.53和0.79;|△C t|= 0.73±0.53;P＝0.053）。结论　3个看家基因均不适于单独作为肺组织荧光定量PCR检测的内参;GUSB和β2-M的均值是这3个基因不同组合中作为肺组织标本内参的最好选择。     

RT-PCR法检测肺癌患者区域性淋巴结微转移的临床病理相关性分析

目的：分析RT－PCR法检测区域性淋巴结中肺癌微转移的临床病理相关性。方法：区域性淋巴结共261枚，取自40例接受手术治疗的原发性肺癌患者，将每枚淋巴结均分为两等份，分别进行病理学检测和细胞骨架角蛋白19（CK19）基因的表达分析。结果：18例患者同时被病理检查和RT－PCR法证实存在淋巴结转移，另22例病理学检查未检淋巴结转移，但RT－CR法检测到其中6例存在淋巴结肺癌微转移。40例患者中，RT－PCR法显示淋巴结转移与肿瘤大小，癌肿侵犯血管，肿瘤分化等级和肿瘤的P－TNM分期有密切关系（P＜0．05）。22例病理检查未发现淋巴结转移的患者中，淋巴结微转移与肿瘤大小和肿瘤的P－TNM分期有密切关系（P＜0．05）。普通病理检查则显示淋巴结转移与否与患者的各临床病理指标之间无明显关系。结论：RT－PCR法在检测淋巴结转移方面较普通病理检查优越，它能准确地检测到存在于淋巴结中的肿瘤微小转移灶，有利于筛筛选早期亚临床转移的人群和揭示肿瘤转移的内在规律。     

RT—PCR法检测淋巴结肺癌微转移的临床可行性探讨

目的　探讨RT PCR法检测淋巴结肺癌微转移的临床可行性。方法　以CK19mRNA作为标志物 ,建立RT PCR法。运用该法测定 2 0例肺癌患者区域性淋巴结混合物中CK19mRNA的表达 ,将其与单个淋巴结检测结果和病理结果分别进行比较。结果　CK19RT PCR法的检测灵敏度为 1× 10 -6～ 1× 10 -4 μg肺癌组织RNA/1μg正常淋巴结RNA。 2 0例患者中 8例被本法和病检法同时证实存在淋巴结转移 ,在余下的 12例病检阴性的患者中 ,有 3例被本法证实存在肺癌微转移。RT PCR法检测单个淋巴结和混合淋巴结微转移结果无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论　与检测单个淋巴结相比 ,RT PCR检测混合淋巴结同样可以提高传统病检法淋巴结转移检出率 ,而且大大减少了工作量 ,降低了检测费用 ,具有临床应用价值。     

CK19 RT-PCR法检测淋巴结中肺癌微小转移灶

目的　探索检测淋巴结中肺癌微小转移灶的新途径。方法　区域性淋巴结共 15 9枚 ,取自 2 0例可手术的原发性肺癌患者 ,将每枚淋巴结均分为两等份 ,分别进行癌转移的病理学检测和细胞骨架角蛋白 19(CK19)基因的表达分析。结果　本实验建立的CK19RT PCR法可检测到 1× 10 7个正常淋巴细胞中存在的 10个肺癌细胞。在被测的 15 9枚淋巴结中 ,42枚被病理切片和分子学方法同时证实存在转移 ,在余下的 117枚病检阴性淋巴结中 ,CK19RT PCR还发现 2 5枚存在微小转移。结论　与传统病理学检查相比 ,CK19RT PCR法可提高淋巴结癌转移检出率 ,从而准确地评价其转移状况     

荧光定量聚合酶链反应检测B细胞淋巴瘤IgH基因重排的进展

实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)是近年出现的一种新的核酸定量技术,为检测血液系统肿瘤微小残留病(MRD)提供了快速、简便、精确、敏感、可靠的定量检测方法.对判断疗效、预防复发,指导治疗有一定的临床意义.就目前国内外用RQ-PCR在B细胞淋巴瘤患者中检测IgH基因重排的应用研究进展进行综述.     

应用RNA干扰技术抑制人膀胱癌细胞EGFR基因表达的研究

目的:应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人膀胱癌细胞(BIU-87)EGFR基因的表达,探索采用该技术干预膀胱癌的可行性.方法:制备3个针对人EGFR基因的shRNA表达质粒,转染BIU-87细胞48 h后,RT-PCR及蛋白质印迹法检测EGFR基因的表达.结果:酶切及测序鉴定证实,3个shRNA表达质粒构建成功,将其...     

人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1与肺癌

人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（hOGG1）功能异常与肺癌等癌症发生发展密切相关,hOGG1基因多态性可能会改变酶的活性,从而影响个体损伤DNA的修复能力,促进癌变.hOGG1等DNA修复基因单核苷酸多态性联合效应提高人群肺癌的易感性.hOGG1参与调节肿瘤细胞的线粒体呼吸功能并影响肿瘤细胞生长.     

肺腺癌患者驱动基因表达及生存分析

目的 检测晚期肺腺癌患者肿瘤组织中驱动基因表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变和棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplasiticlymphoma kinase,EML4-ALK)融合状态,并分析其与生存的相关性.方法 通过过扩增受阻突变系统(amplificationrefractory mutation system,ARMS) PCR方法检测74例晚期肺腺癌患者中EGFR基因突变状态,荧光原位杂交(fluo-rescence in situ hybridization,FISH)方法检测ALK基因融合状态,分析EGFR基因突变率与性别、吸烟史的相关性,EGFR基因突变和ALK基因融合对生存的影响.结果 肺腺癌患者中EGFR基因突变率分别为40.5％ (30/74),ALK基因融合6.8％ (5/74).EGFR基因外显子18、19、20、21的突变率分别为1.4％ (1/74)、20.3％ (15/74)、1.4％ (1/74)、17.6％ (13/74),肺腺癌患者中女性EGFR基因突变高于男性(P=0.007),但未见与吸烟史有明显相关(P =0.099).EGFR基因突变和ALK基因融合的患者接受靶向治疗后有明显的生存优势(P=0.007).结论 肺腺癌患者中EGFR基因19和21外显子存在较高的突变率,女性患者中尤为明显,针对驱动基因靶向治疗的患者有明显的生存优势.