大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法的建立及鉴定

目的:大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养、纯化和鉴定.方法:新生1-3d大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定星型胶质细胞.结果:培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态且生长旺盛,第3代星形胶质细胞纯度达95％.结论:本研究建立的星形胶质细胞体外培养方法操作简单、可靠.     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定

目的：纯化和鉴定体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞.方法：取1~3天新生大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元等,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）鉴定星形胶质细胞.结果：培养的细胞具有典型的星形胶质细胞形态且生长旺盛,第3代95%以上为星形胶质细胞,特异性抗原GFAP表达阳性.结论：该方法操作简单,可靠,是一种有效的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法.     

大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法:于无菌条件下取新生1~2 d的SD大鼠脊髓组织,采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液,通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞,进行培养。用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态,传至第3代细胞纯度达95%以上。结论:成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法,为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。     

小鼠脑内星形胶质细胞体外培养方法的优化

目的： 优化小鼠脑内星形胶质细胞的体外培养方法,为星形胶质细胞的功能研究奠定实验基础。 方法： 取新生0～1 d的C57BL/6乳鼠大脑皮质,胰酶消化结合机械吹打方法,分离皮质细胞,制成细胞悬液并差速贴壁处理,待细胞接种24 h轻柔换液,以后每隔2～3 d换液,且每次换液前手动振荡洗涤2次,传代3次后,行胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫细胞化学染色及免疫荧光染色鉴定。 结果： 经过原代及传代培养,获得形态典型、纯度在95%以上的星形胶质细胞。结论： 优化后的体外培养星形胶质细胞方法,稳定有效,操作简便易行,并可获得高纯度的星形胶质细胞。     

大鼠星形胶质细胞培养方法的改进

目的 改进星形胶质细胞的体外纯化培养方法,为研究星形胶质细胞的生物学功能提供实验模型.方法 采用新生 SD大鼠,无菌操作取其大脑皮质,用0.025%的胰酶吹打消化成单个细胞,替代传统的0.25%的胰酶水浴消化15 min,单个细胞悬液接种于预先包被好PDL的24孔板或25 cm2的细胞培养瓶中,体外培养9~14天至细胞完全融合并铺满瓶底后进行传代.第2代细胞应用抗GFAP的抗体进行免疫荧光染色来鉴定星形胶质细胞的纯度.结果 免疫荧光染色结果显示这种培养方法分离培养出的星形胶质细胞纯度达到90%以上.结论 采用本实验改进的方法,培养的大鼠星形胶质细胞纯度高、生长状态良好,符合体外研究要求.     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法改良

目的建立大鼠大脑皮层星形胶质细胞(As)的培养方法,以进一步对大脑皮层As进行体外实验研究。方法在M cCarthy方法基础上改用出生后5 d的SD大鼠的大脑皮层,制备单细胞悬液后,接种于培养瓶,培养箱中1 h后换瓶,3 d后换液,细胞融合成单层后传代,传3代后采用间接免疫荧光法监测As特异性标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。阳性细胞确认为As。结果体外培养的大脑皮层As经历了贴壁、去除成纤维细胞、纯化和传3代,GFAP阳性细胞达95%以上。结论大脑皮层As体外培养成功,并有较高的纯度,为进一步进行As的研究创造了条件。     

新生鼠脑皮层星形胶质细胞培养及鉴定

目的：旨在获得较纯的星型胶质细胞，为进一步研究奠定基础。方法：采用细胞分离培养一差速粘附法。胰酶消化及机械吹打，分离SD新生1周大鼠大脑皮层细胞，用含20％血清DMEM／F12培养基培养。并以GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果：经原代及传代培养，获得大量几乎为单一种类细胞，其特点为胞体较大，形状不规则，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，常偏于胞体一侧，细胞突起较多较长，符合星形胶质细胞形态。GFAP-FITC免疫荧光染色绝大多数细胞为强阳性。结论：细胞分离培养-差速粘附法可获得较纯的星形胶质细胞。     

成年大鼠侧脑室下区星形胶质细胞的培养与纯化

目的:探讨SD大鼠侧脑室下区星形胶质细胞(AST)的体外培养与纯化方法。方法:将差速贴壁后SD大鼠侧脑室下区AST置于含有B27添加剂的DMEM/F12中培养,采用低浓度血清(2.5～5ml/L)调整法对AST进行纯化。观察AST生长变化,采用形态学和GFAP免疫细胞化学染色进行细胞和纯度鉴定。结果:体外培养的大鼠侧脑室下区星形胶质细胞呈纤维状聚集或类圆形散在生长,GFAP染色呈阳性反应,细胞胞浆着色较深,高倍视野下细胞骨架形态清晰可见,细胞核不着色。在体外培养14～15d时可以获得91%的AST。结论:差速贴壁结合低浓度血清调整法是一种简单实用的AST体外培养纯化方法。     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞（OPCs）。方法新生1～2d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的 对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞(OPCs)。方法 新生1~2 d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8 d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2 d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果 光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论 通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

SD大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化

目的 改进实验步骤获取符合体外研究使用的富含星形胶质细胞的培养物.方法无菌条件下取新生1天内的SD乳鼠的脑皮质,先机械吹打,然后以差速贴壁、摇床振荡以及传代的方法去处其他细胞,SABC法和免疫荧光双标方法GFAP鉴定纯度.结果成功获取星形胶质细胞比例>95%的培养物.结论上述方法可靠地获取了符合体外研究要求的培养物,免疫荧光双标方法较直观.     

大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化培养

目的获取纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞，用于进一步实验。方法取新生大鼠大脑，用酶消化结合机械吹打方法分离皮质细胞制成细胞悬液，差速贴壁法去除成纤维细胞，培养融合时，恒温摇床振荡法去除少突胶质细胞、小胶质细胞等，纯化后，观察星形胶质细胞生长变化规律，并通过GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。结果大鼠脑皮质细胞接种后24h全部贴壁，部分细胞已伸出突起；3～5d时细胞增殖最明显，细胞数目增加，体积增大，突起相互交织成网状；原代培养7～10d时细胞基本融合并开始分层生长。振荡纯化处理后，GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可达98％。结论用差速贴壁和恒温振荡方法可获得高纯度皮质源性星形胶席细胸．     

大鼠海马神经元及星形胶质细胞的体外培养

目的：改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞。方法：选取孕期18~20 d 的SD 大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块。随后使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,将海马组织碎块移入酶消化液中。本方法选择Accutase 和0.1% DNase 作为酶消化液,37 ℃消化 15 min,期间轻柔振动。使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,终止消化。0.1% DNase 加入Neurobasal 和B-27 的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液。将悬液过200 目筛,进行细胞计数。将过筛的单细胞悬液移入DMEM 培养基（DMEM+10%胎牛血清）中,按照每平方厘米2.5×104 的细胞密度进行接种。经PDL 孵育的塑料片置于培养基底部。细胞于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。4 h 后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基。海马神经细胞于培养后7~10 d 可用于实验。结果：通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态。培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98%。结论：该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效。     

神经细胞的原代培养及缺血再灌注模型的建立

目的:建立良好的SD乳鼠神经细胞原代培养及缺血再灌注模型。方法:选用SD乳鼠大脑皮质进行细胞培养,采用机械研磨、过滤、胰酶消化、percoll(硅石胶态悬浮液)、密度梯度离心法分离纯化大脑皮质细胞后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养。利用分离纯化的幼鼠大脑皮质,制作细胞爬片,利用免疫组化进行鉴定。结果:大脑皮质细胞贴壁生长,4～7d基本达到融合,结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代细胞培养97%为神经细胞。而后采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。结论:采用机械研磨、过滤、胰酶消化结合percoll:密度梯度离心法分离培养的大脑皮层神经细胞数量多,均一性生长佳,采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。为以后实验打下基础。     

体外培养大鼠皮层神经元和星形胶质细胞氧糖剥夺后DDR1的表达情况

目的:探讨DDR1蛋白在氧糖剥夺后的神经元细胞及星形胶质细胞中的表达情况,推测可能机制。方法:采用SD孕鼠的胚鼠皮层培养神经元,采用新生SD大鼠皮层培养星形胶质细胞。建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型并随机分为神经元正常对照组、神经元OGD组、星形胶质细胞正常对照组和星形胶质细胞OGD组。噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性;免疫荧光染色及Western blot方法检测各组DDR1的表达情况。结果:与正常对照组相比,OGD组细胞形态发生明显改变,MTT法测得细胞活性值降低;与神经元正常对照组相比,神经元OGD组的DDR1蛋白表达水平增加(P<0.05);与星形胶质细胞正常对照组相比,星形胶质细胞OGD组的DDR1蛋白表达水平无明显增加(P>0.05)。结论:OGD处理可诱导DDR1蛋白在大鼠皮层神经元中的表达,提示DDR1蛋白可能参与OGD后细胞凋亡等病理生理过程。     

改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对成骨细胞增殖效果的比较研究

目的 比较改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对SD大鼠颞下颌关节髁突软骨下骨成骨细胞的增殖效果.方法 取10只出生1 -3dSD乳鼠颞下颌关节髁突软骨下骨,将骨片平分成2份,分别采用改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消法培养颞下颌关节髁突成骨细胞,并标记为Ⅰ组和Ⅱ组,通过细胞形态学观察、HE染色、ALP染色鉴定成骨细胞.取第4代成骨细胞进行细胞计数、MTT生长曲线及流式细胞仪周期分析,比较2种原代培养方法对成骨细胞增殖能力的异同.结果 （1）Ⅰ组和Ⅱ组培养的细胞经鉴定均为成骨细胞; （2） Ⅱ组成骨细胞总量约为Ⅰ组细胞总量的1.5倍; （3） Ⅱ组成骨细胞MTT生长曲线较Ⅰ组细胞提前2d进入对数生长期及达到生长高峰; （4）2组细胞在达到第4代时,细胞周期含量差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消化法均适用于颞下颌关节软骨下骨成骨细胞的培养,但改良Ⅰ型胶原酶消化法可以更快速有效地获得大量成骨细胞.     

心肌细胞二维培养的纯化和鉴定

目的探讨新生大鼠心肌细胞二维培养过程中心肌细胞的纯化及心肌细胞与成纤维细胞的鉴别,为改进心肌细胞二维培养及心肌细胞三维培养提供依据。方法用不同差速贴壁次数、含Brdu培养心肌细胞,免疫荧光标记后用激光共聚焦显微镜分别对24h的细胞进行分析鉴定。结果不同培养方法对心肌细胞的纯化有影响。结论差速贴壁次数的不同得到的心肌细胞纯度不一样,加入适当浓度的Brdu可抑制成纤维细胞的生长,获得纯度更高的心肌细胞。