IRM-2小鼠全长cDNA编码蛋白质分析

目的 分离和鉴定IRM-2小鼠辐射抗性相关基因.方法 以IRM-2小鼠的21条表达序列标签为模板进行PCR扩增,从IRM-2小鼠全长cDNA文库中测定cDNA克隆的序列,通过与GenBank进行同源序列信息比对,对全长cDNA编码的蛋白质进行分析.结果 从IRM-2小鼠全长cDNA文库中获得5条全长cDNA序列,与小鼠已知基因不同源,得到了可能编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的理化性质等信息.结论 通过对全长cDNA编码的蛋白质进行分析,提示IRM-2小鼠体内可能存在目前尚未发现的辐射抗性相关基因.     

氡染毒小鼠骨髓细胞差异表达cDNA文库的构建和初步鉴定

目的 构建氡染毒小鼠骨髓细胞差异表达基因的cDNA文库。方法 采用HD-3型多功能氡室对雄性BALB/c小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型。按照实验动物吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(105 WLM)和对照组(室内本底浓度,1 WLM)。取骨髓细胞提取总RNA,采用SMART和抑制性消减杂交技术,构建正、反向消减cDNA文库,消减cDNA片段插入pMD18-T载体转化大肠杆菌,以含差异表达cDNA片段的菌液为模板进行巢式PCR扩增。结果 获得了完整无降解的总RNA,得到高效率的消减cDNA文库;克隆了244个有插入片段和长度在100～1100bp之间的单克隆。结论 成功构建了氡暴露小鼠骨髓细胞差异表达的正、反向cDNA消减文库。     

氡染毒小鼠肺及支气管组织的基因表达

目的 构建氡染毒小鼠肺及支气管组织差异表达基因的cDNA文库,并对其进行初步鉴定和同源性分析。方法采用SR-NIM02型氡室对小鼠进行吸入染毒后,常规饲养3个月,分别提取和纯化染毒组(30工作水平月,WLM)与对照组(0.02 WLM)小鼠的肺及支气管组织的总RNA,采用Super SMART技术和抑制性差减杂交技术(SSH),构建氡染毒后肺及支气管组织的正、反向差减杂交的cDNA文库;常规连接pGEM-T-easy载体,转化DH5α感受态细胞,巢式PCR鉴定;对阳性克隆测序,并与GeneBank数据库进行BLAST同源性比对,进行初步功能分类。结果共获得克隆460个,其中含有插入片段的克隆146个,经BLAST同源性比对后有48个正向差减cDNA片段与61个反向差减cDNA片段与GeneBank中的序列有不同程度的同源性。结论成功构建了氡染毒小鼠肺支气管差异表达cDNA文库,染毒后小鼠肺及支气管组织中某些基因会发生差异表达,其中部分基因可能参与细胞凋亡和周期调控、机体免疫调节及细胞间信号传导等过程。     

氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因的筛选与鉴定

目的 在建立氡染毒小鼠模型的基础上,筛选和鉴定氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因。方法 采用HD-3型多功能氡室对BALB/c小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型。按照小鼠吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(累积剂量105 WLM)和对照组(室内本底浓度,1 WLM)。采用RNA转录物5'末端启动机制技术(SMART)和抑制性消减杂交技术(SSH)构建正、反向消减cDNA文库,选取含有插入cDNA片段的克隆进行反向Northern杂交筛选上调或下调的阳性克隆。克隆的测序结果进行同源性检索和生物信息学分析。结果 在成功构建了消减cDNA文库基础上,挑取白斑390个,获得312个含有插入片段的单克隆,进行反向Northern杂交,分析基因的上调或下调水平。选取差异表达克隆41个进行测序及生物信息学分析,最终获得10条已知功能或有注释的差异基因片段和3条未知的表达序列标签(EST)。筛选出的差异表达基因涉及氧化损伤、细胞增殖和肿瘤发生等多方面的功能。结论 氡染毒可引起一系列基因表达的上调或下调,利用SSH技术可以筛选到氡染毒的差异表达基因,为探讨氡损伤机制提供参考。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1000bp插入片段。挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录。提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。     

IRM-2小鼠全长cDNA文库的构建及鉴定

Objective To screen and isolate the radioresistance related genes of IRM-2 mice.Methods cDNA library of IRM-2 mice was constructed by SMART technique.Total RNA was isolated from spleens of IRM-2 male mice.The first-strand cDNA was synthesized by using PowerScript reverse transeriptase,and double-strand cDNA was synthesized and amplified by long PCR.The PCR products were purified,digested with restriction enzyme Sfi I.The ds-cDNA fragment lessthan 500 bp was fractionated and ligated to the Sfi I-digested pDNR-LIB vector.The ligation mixture was transformed into E.coil DH5α by electroporution transformation to generate the unamplified cDNA library.The quality of cDNA library was identified by PCR technique.130 clones from cDNA library were sequenced and compared with GenBank database.Results The cDNA library contained 2.25 x 106 independent clones with an average insert size of 1.2 kb.The ratio of recombination and full-length was 95% and 55%,respectively.21 pieces of EST sequences from cDNA library were not the same as the known mice genes and registered into GenBank EST database,with registered number DW474856-DW474876.Conclusions cDNA library of IRM-2 mice has been constructed successfully.21 pieces of EST implies that radioresistance correlative genes may be in IRM-2 mice,which will lay a foundation for isolating and identifying radioresistance related genes in further study.     

IRM-2小鼠全长cDNA文库的构建及鉴定

Objective To screen and isolate the radioresistance related genes of IRM-2 mice.Methods cDNA library of IRM-2 mice was constructed by SMART technique.Total RNA was isolated from spleens of IRM-2 male mice.The first-strand cDNA was synthesized by using PowerScript reverse transeriptase,and double-strand cDNA was synthesized and amplified by long PCR.The PCR products were purified,digested with restriction enzyme Sfi I.The ds-cDNA fragment lessthan 500 bp was fractionated and ligated to the Sfi I-digested pDNR-LIB vector.The ligation mixture was transformed into E.coil DH5α by electroporution transformation to generate the unamplified cDNA library.The quality of cDNA library was identified by PCR technique.130 clones from cDNA library were sequenced and compared with GenBank database.Results The cDNA library contained 2.25 x 106 independent clones with an average insert size of 1.2 kb.The ratio of recombination and full-length was 95% and 55%,respectively.21 pieces of EST sequences from cDNA library were not the same as the known mice genes and registered into GenBank EST database,with registered number DW474856-DW474876.Conclusions cDNA library of IRM-2 mice has been constructed successfully.21 pieces of EST implies that radioresistance correlative genes may be in IRM-2 mice,which will lay a foundation for isolating and identifying radioresistance related genes in further study.     

抑制差减杂交筛选辐射致癌差异表达基因

目的筛选研究辐射诱发小鼠肿瘤相关差异表达基因。方法以^60Coγ射线照射诱发的小鼠白血病动物模型为研究对象，采用抑制差减杂交技术构建辐射致癌差异表达基因cDNA文库，鉴定后挑取阳性克隆测序，并与GeneBank数据库进行同源性比对分析。结果抑制差减杂交筛选得到102个阳性克隆，随机挑选30个克隆进行菌液PCR，扩增得到28个特异性插入片段，DNA测序结果经与GeneBank数据库比对发现代表了24个已知基因，其中3个为重复检出基因，暂未发现有未知序列基因。结论成功建立辐射致癌差异表达基因cDNA文库，初步筛选获得24条表达上调的差异片段，该结果将有助于充实完善辐射致癌的分子机制。     

SSH方法分离大剂量照射后小鼠骨髓差异表达EST序列

目的 为探讨骨髓辐射损伤的分子机理，研究了整体照射条件下，辐射前后骨髓基因表达的变化。方法 小鼠7Gyγ射线照射后4h提取骨髓总RNA为实验方(tester)，对照组动物骨髓总RNA为驱动方(driver)；实验方、驱动方总RNA由SMART cDNA合成方法合成双链cDNA，进而由抑制消减杂交(SSH)方法获得消减杂交产物．消减杂交产物克隆到T载体建立消减文库；对部分克隆进行杂交筛选及序列比对。结果 消减杂交文库挑取800个克隆进行PCR扩增，阳性率约为86％；部分克隆经两轮杂交筛选获得14个差异片段；7个差异片段与鼠EST库已有序列高度相似，其余7个差异片段可能是新的EST序列。结论 大剂量照射后小鼠骨髓cDNA消减文库的建立以及部分差异表达EST的验证为进一步研究辐射相关差异表达基因奠定基础。     

应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白

目的 通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位（DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证。方法 通过酵母双杂交技术,以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵,在人肝组织酵母文库中筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析;构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体,分别转染至人胚肾293T细胞中,检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达;最后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中,通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用。结果 经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆,通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆,对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1。成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体,且均能够在293T细胞中正确表达。免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA-PKcs磷酸化簇区域发生相互作用。结论 成功筛选到与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证。     

应用抑制性消减杂交技术筛选膦甲酸钠免疫调节基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建膦甲酸钠(PFA)处理的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆PFA免疫调节相关基因,阐明PFA免疫调节的分子生物学机制。方法 以PFA处理Jurkat细胞,同时以生理盐水处理的相同细胞作为对照;24h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa1酶切后,将实验组cDNA分成两组．分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性多聚酶链反应(PCR)扩增,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了PFA处理淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到46个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的14个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得11种已知基因序列和3个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了PFA处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明PFA的免疫调节机制及深入了解PFA防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

运用抑制消减杂交构建辐射诱导EST库

目的 克隆并鉴定低剂量辐射射诱导基因,为探讨低剂量辐射生物学效应分子机理提供有益信息。方法 0．5Gyγ射线照射人胚肺细胞后,用抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridizaation,SSH)构建低剂量辐射诱导EST库。用反向Northern杂交法对库中SEST片段进行筛选,挑取阳性克隆测序,并在GenBank序列数据中进行同源性比较。结果 得到受照后表达升高90个EST序列,代表21个基因的转录产物,部分基因的功能已明确。从功能上分析,这些基因产物的生物学作用涵盖了细胞周期、信号转导、细胞骨架、代谢、蛋白合成等几个重要的细胞生物学代谢反应过程,显示出细胞对低剂量辐射反应过程的多样性。另外,实验还获得4个新cDNA序列。结论 利用抑制消减杂交技术,从辐射前后HEL细胞中,得到低剂量辐射诱导EST片段,它们与细胞周期、增殖、代谢、信号转导、应激反应等相关,这些基因可能在细胞的低剂量辐射效应中起到重要作用。     

+10 Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因cDNA文库的构建

目的构建＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因的消减cDNA文库。方法本实验用SD大鼠，分别提取暴露组与对照组的总RNA，并分离纯化mRNA，应用抑制性消减杂交技术分离＋10GI重复暴露大鼠脑差异表达基因eDNA片段并建立消减eDNA文库；利用PCR对随机挑选的75个白色菌落进行插入片段的验证，对其中70个克隆进行eDNA斑点杂交验证。结果所构建的eDNA文库扩增后包含约400个白色克隆和100个兰色克隆，随机挑选75个白色克隆入质粒载体后共获得70个阳性克隆。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因消减eDNA文库，为进一步筛选和克隆脑损伤相关基因奠定了基础。     

抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因

目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg）反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体peDNA3．1(-)-XTP4,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒peDNA3.1(-)-XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T／A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到21个阳性克隆,PCR分析显示其中16个克隆含有200～1000bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析,结果共获得9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。     

人胃癌抑制消减cDNA文库的构建及文库质量分析

目的 :构建人胃癌抑制消减cDNA文库 ,为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定基础。方法 :从胃癌和癌旁正常组织分离poly(A) +RNA ,经反转录后 ,利用抑制消减杂交(SSH)方法 ,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果与结论 :挑取 80 0个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段 ,结果显示其中 750个克隆有插入片段 ,片段大小范围为 2 50～ 70 0bp。为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定了基础。