应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的pSIHBV／C与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞,转染后24、48、72h,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌,转染后第2天抑制率达高峰,分别为92％、85％,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染24b后,随pSIHBV／C比例的升高,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加,当pSIRNA／C与pHBV1．3比例为1：20时,pSIHBV／C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。     

脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的：探讨乙型肝炎病毒(HBV)s基因和c基因特异性的脱氧核酶(DNAzyme)对HBV表面抗原(HB—sAg)和e抗原(HBeAg)表达的抑制效应。方法：设计合成针对HBVs基因ORF A^157UG、e基因ORF A^1816UG的DNAzyme DrzBS、DrzBC,在2.2．15细胞上观察其对HBVs基因、c基因的表达抑制效应。结果：DrzBS、DrzBC作用于2．2．15细胞后,可显著抑制HBVs基因、c基因的表达,有效浓度为0．1—2．5μmol／L并呈剂量依赖性,最高抑制率分别为94．2％和91．8％;有效抑制持续时间可达72h,DrzBS、DrzBC在细胞内对HbeAg、HbeAg表达的抑制效率,明显高于作为对照的反义寡核苷酸AsBS、AsBC,有效浓度较后者低至少l0倍。其对2．2．15细胞的HBVDNA复制无明显影响,亦未见明显的细胞毒性作用。结论：在2．2．15HBV细胞模型系统,DrzBS、DrzBC能高效阻断HBVs基因、e基因的表达,是一种特异性的、高效的抗HBV基因治疗剂。     

乙型肝炎病毒全基因在肝癌细胞中的转染与表达

目的 建立乙型肝炎病毒（HBV）复制状态模型。方法 体外连接HBV DNA获得6．4kb的双拷贝DNA片段,然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点,通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒,再通过脂质体介导法转染肝癌细胞。结果 通过G418筛选,对阳性克隆细胞进行十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析,证明已将HBV全基因重组真核表达质粒转染至肝癌细胞并获得稳定表达。结论 通过脂质体介导法将HBV全基因转染至肝癌细胞,成功建立了HBV复制状态的细胞模型。     

低水平血清乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原测定及其临床意义

目的 :了解低水平乙型肝炎 (乙肝 )病毒表面抗原 (HBsAg)、e抗原 (HBeAg)在乙肝患者中的分布和相关乙肝病毒血清标志物的模式特征。方法 :应用微粒子酶免疫技术 (MEIA)对 790 0例门诊和住院病人血清标本进行乙肝病毒 5项标志物的检测 ,根据临界值质控血清的值来确定质量浓度在 5 μg·L-1或 1μg·L-1以下HBsAg阳性数 ,以及浓度在 2nCu·ml-1以下HBeAg阳性数 ,并分析相关乙肝病毒标志物 (HBV M )的模式。结果 :共检出HBsAg阳性 6162例 ,其中质量浓度在 5 μg·L-1以下者占13 .5 3 % ,1μg·L-1以下者 8.4% ;HBeAg阳性者 44 0 1例 ,其中浓度在 2nCu·ml-1以下者为 2 1.9%。 5项血清标志物检测发现不少特殊模式 ,HBsAg与抗 HBs同时阳性者主要出现在HBsAg质量浓度低于 1μg·L-1的标本中 ;血清HBeAg浓度在 2nCu·ml-1以下者 ,HBeAg和抗 HBe同时阳性的占 5 2 .4%。结论 :提高HBsAg、HBeAg检测的灵敏度有助于乙肝的诊断、治疗以及流行病学调查 ,MEIA法可对一些不明原因的转氨酶升高患者作出明确的诊断     

乙型肝炎病毒重组e抗原在大肠杆菌中的高效表达及初步应用

为了获得重组表达乙型肝炎病毒ｅ抗原。利用聚合酶反应扩增和重组技术。在大肠杆 菌中的高表达非融合型重组ＨＢｅＡｇ。结果：为模拟天然ＨＢｅＡｇ的结构。除第一个氨基酸为起始密码子ＡＴＧ所编码的甲硫氨酸外，共包括Ｐｒｅ－Ｃ区羧基端的９个氨基酸和ＨＢｃＡｇＮ－末端的１４９个氨基酸残基。     

乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立HBV复制状态模型。方法 体外连接HBV（ayw亚型）DNA获得6.4kb的双拷贝DNA片段。然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点。结果 通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒。结论 成功构建了HBV全基因重组真核表达质粒。     

乙型肝炎病毒核心抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞作用的靶细胞的建立

目的 建立HBcAg特异性CTL作用的靶细胞系统，为进一步研究HBV基因变异对CTL细胞毒效应的影响奠定基础。方法 采用两种质粒pXT1和EBO-plpp构建HBVC基因真核细胞表达载体并转染永生化B细胞，DNA分析和流式细胞仪检测HBVC基因在宿主细胞中的复制、表达。结果 在转染重组质粒pXT1-HBVc和EBO-plpp0-HBVc的B细胞中，均能检测到目的基因；分别有89.81%和88.51%的宿主细胞能检测到HBcAg；连续培养3周后，分别有88.30%和72.19%的宿主细胞表达HBcAg。结论 重组逆转录病毒表达载体pXT1-HBVc和EB病毒表达载体EBO-plpp-HBVc转染的永生化人外周血B细胞能有效地表达靶抗原（HBcAg),可作为较为理想的HBV特异性CTL作用的靶细胞。     

双靶区反义RNA抑制乙型肝炎病毒

目的:研究双靶区反义RNA的逆转录病毒载体的转染、表达及其抗乙肝病毒(HBV) 的作用.方法:合成互补于HBV X区(1400-1430)的X片段、互补于HBV P区(2375-2405) 的P片段,分别构建表达单靶区反义X或P的重组逆转录病毒载体质粒和表达双靶区正义、反义 X 和 P 重组逆转录病毒载体质粒 ,转染PA317细胞,NIH3T3 细胞扩增法测假病毒颗粒的滴度.用假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测2.2.15细胞上清 HBsAg和HBeAg含量.结果:对HBsAg的抑制率在感染后第3、5、7、9天时分别为 pLXSN:5%, 4%, 6%, 4%; pLXSN+Xpos/Ppos:1%, 5%, 5%, 11%; pLXSN+X:16%, 45%, 44%, 38%; pLXSN+P :34%, 59%, 55%,51%; pLXSN+X/P:73%, 83%, 81%, 79%.对HBeAg的抑制率在感染后第3 、5、7、9天时分别为pLXSN:2%, 6%, 4%, 3%; pLXSN+Xpos/Ppos:6%, 0, 0, 0; pLXSN+ X: 13%, 53%, 52%, 45%; pLXSN+P: 21%, 57%, 56%, 49%; pLXSN+X/P :62%, 87%, 84%,79%.结论:细胞内表达HBV反义RNA有明显抗乙肝病毒复制和表达的作用 ,而且双靶区反义RNA抗乙肝病毒的作用较单靶区反义RNA更明显.     

乙肝表面抗原和e抗原阴性父亲乙型肝炎病毒父-婴传播关系的研究

目的 了解乙型肝炎表面抗原与e抗原阴性,探讨表面抗体、e抗体和核心抗体均为阳性的父亲能否引起乙肝病毒的父-婴垂直传播.方法 采用ELISA法检测父亲及新生儿脐带血的乙肝病毒标志物(HBsAg,HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb).结果 母亲乙肝标志物5项均阴性,父亲乙型肝炎血清标志物(HBVM)中表面抗原(...     

以S区为靶位的小干扰RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的以乙型肝炎病毒（HBV）S基因区为靶位,构建表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro,体外观察siRNA抗HBV的效果。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞,利用脂质体Metafectene转染表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro于细胞中,用时间分辨免疫荧光分析法（IFMA法）检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,用定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测细胞上清DNA,用逆转录（RT）-PCR检测HBV mRNA。结果成功构建了表达siRNA的转录质粒载体,siRNA可抑制HBV的抗原表达和病毒复制,1、2、4μgsiRNA对HBsAg的抑制率分别为75％、82％、89％;对HBeAg的抑制率分别为32％、38％、43％;对HBVDNA的抑制率分别为30％、43％、49％;对HBVRNA的抑制率分别为30％、70％、90％。结论靶向HBVS区的siRNA能抑制HBV的抗原表达和复制;siRNA抑制作用呈剂量依赖性和序列特异性。     

RNA干扰技术抗乙型肝炎病毒的实验研究进展

目前对乙型肝炎病毒(HBV)引起的病毒性肝炎尚无令人满意的治疗效果。RNA干扰技术的出现，为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。作者主要从RNA干扰技术的研究背景、实验中存在的问题和应用前景等方面对其抗HBV的研究进展进行综述。     

应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对HBV复制和表达的影响。方法通过尾静脉注射1.3倍的HBV真核表达质粒pHBV1.3建立小鼠急性乙型肝炎感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(pSI C)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg(ELISA),做肝组织HBcAg免疫组化,通过RT PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组、无关干扰组与突变干扰组。结果转染后第6天血清HBSAg在pHBV1.3感染组中高表达(A值为4.08～9.04,平均值为5.07±1.07,A值≥2.1为阳性),肝内HBcAg阳性率为5%～10%;pSI C干扰组HBSAg,HBcAg的表达均受到抑制,血清HBsAg阴性,A值为0.04～1.5,平均值为0.62±0.59,与感染组相比有显著性差异(P<0.01),肝内HBcAg几乎无表达,RT PCR示肝内HBVCmRNA水平明显降低。而无关干扰pGFP及突变的干扰序列pSI Cmut则无此作用。结论RNAi技术能特异,高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达,提示siRNA作为一种新型抗病毒药物的巨大潜能,而通过水动力法建立的小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,一定程度上解决了长期以来缺乏合适的HBV感染动物模型的问题,为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究拓展了新的思路。     

克隆乙型肝炎病毒DNA在肝与肾细胞中复制与表达的研究

对比研究在外细胞培养系统中乙型肝炎病毒在肝,紧名的复制与表达。方法髟克隆ＨＢＶＤＮＡ分别转染ＨｅｐＧ２与２９３细胞系;ｐ１７７ｔｎ与ｐ３．８Ⅱ还转染了原代人胚肾细胞。培养后收集转染细胞培养上清液,用ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ;提取转染细胞的ＤＮＡ与ＲＮＡ,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ与Ｎｏｒｈｅｒｎ印迹杂交检测细胞内ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢＶＲＮＡ。结果转染ＨｅｐＧ２细胞,ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ均有     

基因芯片技术检测乙型肝炎病毒基因型

目的建立乙型肝炎病毒（HBV）基因分型检测芯片方法,并检测其特异性、敏感性和稳定性。方法收集HBV各基因型序列,并对比分析后,设计7支探针,制成HBV基因型检测芯片;对芯片检测的实验条件进行探索,分析其检测特性。结果实验条件优化为杂交温度39℃,试验统计结果判定为荧光信号软件输出值在30以上为阳性,30以下为阴性。正常对照组的健康人和非HBV的常见病毒芯片检测结果均为阴性,实际应用检测30份HBV DNA阳性临床留取的样本,结果 19份为C型,11份为B型,抽查2份标本测序观察,结果与芯片检测结果完全一致。用HBV基因B型、C型标准品考察,检测符合率为100%,芯片检测的最低病毒拷贝数为104拷贝/ml,芯片检测的总变异度为9%、芯片内变异度为2%,芯片能同时检测不同基因型的重叠感染。用加速试验评价芯片的稳定性,结果检测荧光信号值有所下降,但下降后的信号值未低于检测临界值30,试剂盒性能较为稳定。结论使用HBV基因型检测芯片进行HBV基因分型操作简便、敏感性高、特异性好、方法可靠。     

乙肝病毒截短型中蛋白表达载体的构建及反式激活作用的研究

目的:构建含有不同长度的乙肝病毒(HBV)截短型中蛋白的表达载体,并研究其反式激活作用。方法:设计引物扩增两条不同长度的HBV截短型中蛋白基因片段,分别定向克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组表达质粒pcS2与pcTS。重组子经HindⅢ单酶切、PCR及测序鉴定。将测序正确的重组子与报告质粒pGL3-control共转染肝癌细胞系HepG2,检测荧光素酶表达强度。结果:构建了两种HBV截短型中蛋白基因的表达质粒pcS2与pcTS,通过共转染证明均具有反式激活作用,且pcS2反式激活作用强于pcTS(P<0.01)。结论:成功构建了具有反式激活作用的重组表达载体,并证明HBV截短型中蛋白发挥反式激活作用的关键区段在前S2区。     

乙型肝炎病毒多聚酶基因YMDD变异与临床治疗反应

目的：了解深圳地区慢性乙型肝炎患者在长期拉米夫定治疗中HBV多聚酶基因YMDD变异的情况及其对治疗反应的影响。方法：对100例拉米夫定治疗中28例出现血清病毒核酸（HBV DNA）阳性的患者,采用限制性片段长度多态性分析法（PCR－RFLP）检测YMDD变异,并观察其血清HBV DNA及丙氨酸转氨酶（ALT）水平。结果：100例中有17例YMDD变异阳性，其中以YVDD（M550V）变异为主,占64．7％（11／17），YIDD（M550I）变异为35．3％（6／17）。发生YMDD变异的患者均伴有HBV DNA及ALT水平反跳，1例住院患者停用拉米夫定后出现病情加重。结论：深圳地区慢性乙型肝炎患者在长期拉米夫定治疗中（疗程1年，100md/d）HBV多聚酶基因YMDD变异率为17．0％（17／100）。发生变异者较无变异者疗效降低，检测YMDD变异有助于监测疗效。     

乙型肝炎病毒DNA转染与鸭乙型肝炎病毒DNA感染原代鸭肝细胞对比研究

目的探讨HBVDNA复制和表达的跨种属特异性,为HBVDNA转染跨种属原代肝细胞模型的建立提供实践基础和理论依据.方法分离培养原代鸭肝细胞(PDH),电转线性HBVDNA(转染组,1.19×1012拷贝/1×107PDH)或急性感染DHBV(感染组,4×108病毒颗粒/1×107PDH),分别于转染/感染后ld、3d、5d等时点检测PDH培养上清或裂解液中HBsAg、HBeAg与DHBsAg(采用IMX系统或ELISA检测);并采用DotBlotting检测PDH裂解液中总HBVDNA.于转染/感染后2d提取PDH总DNA采用SouthemBlotting分析HBVDNA与DHBV复制型式.以单纯电击或未感染的PDH为对照组.结果转染后1d、3d和5d各时点转染组PDH裂解液中HBsAg分别为15.24、14.55和5.13(P/N值,阳性≥2.1),HBeAg均为阴性;PDH培养上清中HBsAg与HBeAg均阴性;感染组各时点PDH上清中DHBsAg分别为14.6、31.53、34.73(S/N值,阳性≥2.1);上述各项指标于对照组均为阴性.DotBlotting显示转染组与感染组PDH各时点的裂解液中HBVDNA与DHBVDNA均为阳性,对照组为阴性;SouthernBlot分析显示转染组HBVDNA与感染组DHBV均为游离复制型,可见4.0kb以下分子涂抹带,包括rcDNA、cccDNA(scDNA)和ssDNA等复制中间体;未见整合型HBVDNA-高分子区(4～24kg)涂抹带.结论HBVDNA在PDH中的复制和表达与DHBV感染组相似,可能为肝细胞内环境依赖性,无严格种属特异性限制.