新生隐球菌28S rDNA的基因型特征与序列分析

目的 探讨新生隐球菌各变种、血清型与基因型的关系。方法 新生隐球菌标准株10株、新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10以及临床分离株19株,采用变性梯度胶电泳(DGGE)结合DNA序列分析,对以上菌株的28S rDNA片段进行研究。结果 经过DGGE和DNA序列分析,所有新生隐球菌新生变种(A、D型)具有一致的基因带型和序列,格特变种(B、C型)具有不同于新生变种的独特一致的带型和序列;AD型的基因型和序列与格特变种完全相同,新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10(D型)的基因型类同于新生变种;19株临床分离菌在DGGE上可分为2型,17株与A、D型完全相同,2株与B、C型相同。结论 DGGE结合DNA序列分析,对于探讨新生隐球菌各变种、血清型的基因型特征、关系具有重要价值;我国非艾滋病隐球菌病感染以新生变种为主,AD型在系统发育上更类同于格特变种,而不是新生变种;本研究不支持A血清型为新生变种以外的新变种即grubii变种的观点。     

用表达的序列标记制备染色体特异性探针以分离新生隐球菌

从临床和环境中分离出的新生隐球菌的核型表现出高度的异质性,这与感染人体过程中或在不同条件下出现的核型改变有关。而分析这些不同核型的分子基础需要一组染色体特异性探针。作者首先从新生隐球菌B-3501株     

鸽粪中新生隐球菌的分离和鉴定

采用ＧＡＥＣ培养了１４４份私人和公共养鸽场所的鸽粪标本,从中共分离得３２株新生隐球菌,阳性率达２２．２％。３７℃生长良好。尿素试验均为阳性。血清因子分型结果证实阳性标本均为新生隐球菌新生变种,全是Ａ血甭型,动物接种后能重新分离出该菌。病理证实具致病性。     

新生隐球菌生态学研究

目的:研究中国环境中新生隐球菌变种的生态学特点.方法:采集10个城市(3组)鸽粪标本620份和江西贵溪地区澳洲赤桉标本819份;采用咖啡酯玉米山梨醇琼脂(cAcA)培养基分离新生隐球菌,并对菌株进行CGB培养,酚氧化酶、尿素酶、血清型、交配型试验和形态学观察.结果:①不同纬度地区鸽群的新生隐球菌标本阳性率为G1[40°～50°北纬(N)]13%,G2(30°～40°N)50%,G3(20°～30°N)29%,G2显著高于G1(P＜0.01);3组鸽群阳性率基本相同(P＞0.05),平均为81%.②环境分离358株全部37℃生长、酚氧化酶阳性、CGB培养阴性;1株尿素酶阴性;其中101株均为α交配型和A血清型,提示全部为grubii变种;发现环境分离菌株荚膜变异并与其他真菌的自然黏附现象.③从江西贵溪生长的澳洲赤桉未分离到新生隐球菌格特变种.结论:中国环境中以grubii变种为主的新生隐球菌的生态学特点与其所在的地区纬度明显相关:由澳洲赤桉分离新生隐球菌格特变种的研究仍然需要继续进行.     

新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的DNA ,观察DNA指纹与血清型的关系 ,探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用 3种不同寡核苷酸重复序列 [CN1(GTG) 5、CN2(GACA) 4和CN3(GATA) 4]为引物 ,对从临床和鸽粪中分离到的 2 4株血清A型和 8株四种血清型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增 ,根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之间的关系。结果　 2 4株临床和鸽粪分离的血清A型株中 ,2 0株产生和标准株完全相似的DNA带型 ,1株与标准D型DNA带型相似。 3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型均不相同。 2株B型和 2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论　①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型 (gattii变种 )的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

真菌病

20 0 2 2 190　 PCR对新生隐球菌的基因分型研究 /温海(二军大长征医院皮肤科 )…∥第二军医大学学报 .-2 0 0 1,2 2 (11) .- 10 0 5～ 10 0 8用 AP- PCR方法检测新生隐球菌的临床和环境分离株 ,观察 PCR指纹与血清型的关系 ,探索 PCR指纹对于新生隐球菌的分型标准。采用 3种寡     

在CGB培养基上生长的A型和D型新生隐球菌

新生隐球菌是临床上重要的致病真菌,在免疫缺陷的患者如艾滋病患者中引起播散性脑膜炎。新生隐球菌有两个变种,并分为5个血清型。文献报道新生隐球菌新生变种的血清型为A、D和AD型,在CGB培养基上不生长;格特变种的血清型为B和C型,能够在CGB培养基上生长。作者报告了3株来自鸽排泄物,能在CGB培养基上生长,血清型为A或D型的新生隐球菌。     

墨西哥城鸟粪、水果和蔬菜中分离的新生隐球菌及其变种

新生隐球菌存在于各种自然来源,包括鸽粪、水果与蔬菜,如宠物的粪便及动物园饲养鸟的粪便、热带树木木屑、苹果、石榴、木瓜、胡萝卜和马铃薯等,而新生隐球菌gattii变种也曾从树木如某些热带橡树(Eucalypeus camaldulensis)及蝙蝠的粪便、马蜂的巢穴中分离出,其中在世界范围报导鸽粪还是其主要来源。但对     

野生鸽作为劳伦梯隐球菌、单咽隐球菌及汉逊德巴利酵母菌的携带者

Ｅｍｍｏｎｓ等认为鸟类是病原真菌携带者 ,曾从Ｃｏｌｕｍｂａｌｉｖｉａ野生鸽的排泄物中培养得到了新生隐球菌新生变种。许多研究表明人类被感染通常是在暴露于鸟类粪便 ,尤其是栖息于人类住所周围的野生鸽粪便之后发生。为更好地了解携带新生隐球菌新生变种的野生鸽对人类健康的潜在威胁 ,该研究主要调查了瑞典的Ｍａｌｍｏ市的野生鸽对隐球菌的携带率。令人惊奇的是 ,未发现该城市的野生鸽携带有新生隐球菌新生变种 ,但分离到劳伦梯隐球菌、汉逊德巴利酵母菌及单咽隐球菌 ,其中前两种为人类条件致病菌。方法 :作者在 1 998年 3月 1 2日…     

CAP64荚膜相关基因在新生隐球菌分型中的意义

新生隐球菌的多聚糖荚膜成分是新生隐球菌血清型分型的物质基础^[1],而CAP64荚膜相关基因是新生隐球菌荚膜合成的必需基因之一^[2],我们根据新生隐球菌血清型DCAP64荚膜基因的序列设计引物,将设计的引物扩增5个标准血清型新生隐球菌,已分型和未分型新生隐球菌临床分离株,以及其他的致病真菌,以寻找引物的型特异性。     

首次从非AIDS患者中分离出尿素酶阴性新生隐球菌

最近，作者等从一非ＡＩＤＳ又无免疫缺陷的新生隐球菌脑膜炎患者脑脊液中有首次分离出一株尿素酶阴性新生隐球菌，经与尿素酶阳性的新生隐球菌和尿素酶阳性的白念珠菌反复对照，并经动物实验证明，经南京医科大学附属和线医院情报室联机检索，国际上未见类似报告。     

新生隐球菌生物膜体外抗真菌药物敏感性研究

目的了解新生隐球菌生物膜对氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑和卡泊芬净的体外敏感性。方法采用标准微量稀释法测定上述4种抗真菌药物对20株新生隐球菌悬浮状态与生物膜状态的最低抑菌浓度(MIC),MIC结果判定采用四甲基偶氮唑盐[XTT,2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt]-降解法。结果悬浮新生隐球菌20株均对两性霉素B敏感(<1μg/mL),3株对氟康唑耐药(>64μg/mL);1株对伊曲康唑耐药;20株均对卡泊芬净耐药。而生物膜新生隐球菌显示:在20株中,除4株对两性霉素B敏感外,其余各株均对两性霉素B耐药。20株菌均对氟康唑和伊曲康唑耐药,远远高于耐药浓度。对卡泊芬净,均高于其耐药浓度。结论标准微量稀释法结合四甲基偶氮唑盐(XTT)-降解法测定新生隐球菌生物膜对抗真菌药物的敏感性其结果具有可重复性和一致性的特点;新生隐球菌生物膜的明显降低抗真菌药物的敏感性。     

新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定

目的 建立一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR）,用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌。方法 选取新生隐球菌和格特隐球菌IGS中变异度最高的Ⅰ区（IGS1）为靶点,经ClustalW2多重比对,并结合Oligo6软件在不同序列位点设计针对新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌的引物用于多重PCR分析。通过51株新生隐球菌（VNⅠ-VNⅣ和VNB基因型）和41株格特隐球菌（VGⅠ-VGⅣ基因型）对该方法进行验证,并将该方法与已报道的CGB显色培养和采用特异性引物GPA1A、CLA4D和SOD1gattii扩增格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的单一引物PCR方法进行比较。结果 基于IGS的多重PCR分析成功鉴定所有92株新生隐球菌和格特隐球菌,对其他常见致病酵母的扩增均阴性,显示所设计引物较高的特异性;已报道的基于GPA1A和CLA4D引物PCR分别在鉴定2株和1株格特隐球菌时出现假阳性结果;CGB培养基在鉴定1株格鲁比变种和1株新生变种时出现假阳性结果。上述方法在鉴定时均未出现假阴性结果。结论 建立的多重PCR可快速准确地鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种、AD杂合子和格特隐球菌,且优于已报道的单一引物PCR 或CGB显色培养法。     

新型隐球菌核型的脉冲电泳分析

用脉冲电泳技术分离了包括３个变种、５种血清型在内的２０株新型隐球菌染色体ＤＮＡ，发现其基因组由１０～１２条染色体组成，大小在０．４～２．１Ｍｂ之间，总长度约１５Ｍｂ。特别是注意到电泳核型与血清型之间有相关性，并观察到菌株间的带型也存在不同程度的差异，提示电泳核型分析可作为变种鉴别和种内分型的新的基因型方法。     

PCR-RFLP和PCR指纹法在新生隐球菌基因分型中的应用与比较

目的 探讨针对结构基因g6341的PCR－RFLP方法在新生隐球菌基因分型中的应用价值, 并与PCR指纹分型法进行比较。方法 以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物，对受试的新生隐球菌进行PCR指纹分型。选择结构基因g6341进行PCR－RFLP分析，在序列保守区设计通用引物，筛选合适的限制性内切酶进行RFLP分析，并与PCR指纹法进行比较。g6341基因扩增片段测序，进行系统发育分析，研究各主要基因型间的亲缘关系。结果 多位点基因序列分析表明，结构基因g6341可作为RFLP分析的合适靶点。对76株新生隐球菌的基因分型结果显示，针对g6341的PCR-RFLP方法与PCR指纹法结果一致。分析g6341基因部分序列得出，8种主要基因型菌株相互间的同源性在84％ ～ 97％之间，同一主要基因型菌株的同源性在99％ ～ 100％之间。分子发育树中，VNⅠ－VNⅣ基因型、VGⅠ－VGⅣ基因型分别聚在一类。结论 针对结构基因g6341的PCR-RFLP方法可作为新生隐球菌分子分型的有效工具，对g6341基因的序列分析可揭示不同菌株间的遗传进化关系。     

不同氧浓度对新生隐球菌荚膜的影响

【摘要】 目的 探讨不同氧浓度对新生隐球菌荚膜的影响。方法 以厌氧、微需氧和CO2产气袋建立不同氧浓度（分别为0、8%、15%）培养条件,以大气氧浓度（21%）为正常氧浓度培养条件,以新生隐球菌标准株5株（BLS71、BLS63、ATCC32609、ATCC34874、YD53,分别为血清型A、B、C、D、AD）、临床株1株为研究对象,以常规沙氏液体培养基和含3-（N-吗啡啉）丙磺酸（MOPS）的10%沙氏液体培养基（pH 7.3）为非诱导和诱导培养基,在37 ℃下培养3 d,观察不同氧浓度培养条件下新生隐球菌的荚膜形成及大小。结果 除菌株YD53（血清型AD）外,其余受试菌株均可形成明显的荚膜。在非诱导培养条件下,菌株BLS71、BLS63、ATCC32609和临床株在4种氧浓度培养条件下荚膜大小差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。在诱导培养条件下,菌株BLS71、BLS63和临床株在厌氧培养条件下的荚膜厚度比其余氧浓度条件下的荚膜明显变小（P ＜ 0.05）。结论 缺氧可能抑制新生隐球菌荚膜的形成。 【关键词】 隐球菌,新型; 氧; 荚膜     

几种快速提取新生隐球菌DNA的方法

目的　探讨几种快速提取新生隐球菌DNA方法的效果。方法　分别用玻璃珠机械破裂法、酶消化法、高渗剂破裂法及三法联合法提取有荚膜的新生隐球菌B 3 50 1野生株DNA ,用联合法提取 5种血清型新生隐球菌标准株的DNA ,用紫外分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度。结果　 4种方法抽提 2ml新生隐球菌培养液 (菌体数约为 1×10 8个 /ml) ,可获得DNA的量约是 64～ 2 0 3 μg。酶消化法、高渗剂破裂法及三法联合法抽提的DNA ,其OD2 60 /OD2 80比值均小于 1.8。结论　除玻璃珠机械破裂法外 ,酶消化法、高渗剂破裂法 ,以及三法联合法均可用于快速抽提新生隐球菌的DNA。以三法联合法效果最好     

隐球菌与体外培养角质形成细胞的相互作用

目的：研究隐球菌与体外培养的角质形成细胞的相互作用。方法：检测新生隐球菌对体外培养的角质形成细胞HaCaT株（简称HaCaT细胞）的时间-浓度黏附率、通透率；检测新生隐球菌对细胞的损伤；透射电镜观察二者相互作用的超微结构。结果：新生隐球菌标准野生株B3501（简称B3501）可以对HaCaT细胞产生黏附与侵袭，黏附率与侵袭率呈现时间依赖性；同时，B3501还可以使HacaT细胞凋亡率升高，对其造成损伤，这与菌体的活力相关。超微结构可见新生隐球菌与角质形成细胞的黏附与侵袭过程。结论：活的隐球菌黏附与侵袭角质形成细胞是其感染皮肤的重要条件。进一步明确二者的相互作用对隐球菌发病机制的研究具有重要意义。     

PCR检测深部致病真菌感染的研究

目的探讨PCR在可疑深部真菌感染临床标本检测中的应用。方法对60份临床标本分别进行传统真菌培养以及真菌通用引物PCR和三重PCR检测。结果真菌培养阳性共19份，其中白念珠菌10份、烟曲霉2份、新生隐球菌2份、其他菌株5份（包括光滑念珠菌2份、热带念珠菌2份、克柔念珠菌1份）；真菌通用PCR检测共有21份阳性，经三重PCR检测共有15份阳性，分别为白念珠菌10份、烟曲霉3份、新生隐球菌2份。PCR方法与传统培养方法相比，检出率差异无统计学意义。结论PCR检测可疑深部真菌感染临床标本快速简便，稳定性好，敏感性和特异性均较理想，适合临床实验室常规使用。