二氢杨梅素促进胶质瘤U251细胞凋亡的实验研究

目的 探讨二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DHM)对人胶质瘤U251细胞凋亡的促进作用及其机制。方法 将体外培养的胶质瘤U251细胞分为对照组和DHM组(根据DHM水平的不同分为3个亚组),MTT法观察细胞活性,Hoechst 33258核染色法观察细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡率,透射电镜观察细胞形态,Western blot检测Bax和bcl-2蛋白表达水平。结果 Hoechst 33258核染色和流式细胞仪检测显示,随着DHM水平的增高,U251细胞凋亡率呈剂量依赖性增高; 电镜观察显示,对照组胶质瘤U251细胞形态正常,DHM组胶质瘤U251细胞肿胀,细胞器呈碎片样分散,随着DHM水平升高,线粒体、内质网等细胞器结构破坏明显。此外, DHM处理后Bax蛋白表达水平增高,Bcl-2蛋白表达水平降低。结论 DHM可能通过改变Bax及Bcl-2蛋白表达水平来抑制胶质瘤U251细胞增殖并促进其凋亡。     

RNA干扰XBP1基因表达对人胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)对人脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法 设计并合成干扰XBP1表达的小干扰RNA(siXBP1),转染人脑胶质瘤U251细胞,MTT 法检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡,Western blot法检测Bax、Caspase-3及Bcl-2的表达水平。结果 siXBP1可有效抑制U251细胞增殖,促进细胞凋亡,Western blot显示,siXBP1上调了U251细胞中促凋亡信号分子Bax及Caspase-3的表达,抑制了U251细胞中抗凋亡信号分子Bcl-2的表达。结论 下调脑胶质瘤细胞XBP1基因表达有望为脑胶质瘤的治疗提供理想的分子靶点。     

华蟾素诱导人胶质瘤U87细胞凋亡的作用机制研究

目的 探讨华蟾素(Cinobufacini)对人胶质瘤U87细胞凋亡的促进作用及其机制。方法 将体外培养的胶质瘤U87细胞分为对照组、华蟾素组(依华蟾素水平不同分为3个亚组),MTT法测定细胞增殖率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,Hoechst 33258核染色法观察细胞核凋亡,透射电镜观察细胞形态学的变化,Western blot法检测胶质瘤U87细胞内Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的蛋白表达水平。结果 华蟾素对胶质瘤U87细胞增殖有抑制作用; 流式细胞仪及Hoechst 33258核染色法的检测显示,随着华蟾素作用浓度的递增,胶质瘤U87细胞凋亡率呈剂量依赖性递增; 华蟾素作用后可使Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平升高。结论 华蟾素通过改变Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平来抑制胶质瘤U87细胞增殖并促进其凋亡。     

吴茱萸碱对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡影响的研究

目的研究吴茱萸碱(evodiamine)对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法体外培养人胶质瘤U251细胞,并将其分为空白对照组及25、50、100μg/mL吴茱萸碱4组。应用MTT法检测吴茱萸碱对U251细胞的增殖抑制作用;Hoechst33258荧光染色法检测吴茱萸碱诱导胶质瘤U251细胞凋亡;采用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组早期凋亡率;Western blot法分析凋亡相关蛋白的变化。结果与空白对照组同期比较,25、50、100μg/mL吴茱萸碱组生长抑制率在24、48、72 h均增加,差异有统计学意义。Hoechst 33258荧光染色显示吴茱萸碱作用24 h后U251细胞出现典型的细胞凋亡特征,各处理组均可见凋亡小体。与空白对照组自发早期凋亡率3.12%比较,25、50、100μg/mL吴茱萸碱组早期凋亡率分别为8.65%、19.47%及28.97%,差异均有统计学意义。Western blot实验显示,与空白对照组同期比较,25、50、100μg/mL吴茱萸碱上调了FAS、FADD、Caspase-8及Caspase-3蛋白表达,Bcl-2蛋白表达明显下降,Bax蛋白表达明显上升,差异均有统计学意义。上述指标均呈时间和剂量依赖性。结论吴茱萸碱对U251细胞具有明显的抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,其机制可能与上调Fas途径和下调Bcl-2/Bax有关。     

RNA干扰PDGF-B基因对胶质瘤U251细胞凋亡和增殖的影响

目的利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板源生长因子-B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法利用脂质体将针对PDGF-B基因的siRNA转染进入U251细胞,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RTPCR)检测PDGF-B基因表达;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达,采用MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖,应用流式细胞计数观察抑制PDGF-B基因后胶质瘤U251细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR检测PDGF-B基因表达明显下降;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%),MTT结果显示siRNA转染组U251细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达能抑制胶质瘤细胞的有丝分裂,促进细胞的凋亡。结论构建针对胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长抑制和促进凋亡作用。     

土贝母苷甲通过上调FADD/caspase-8/caspase-3的表达促进人胶质瘤U251细胞凋亡

目的研究土贝母苷甲(TBMSⅠ)诱导人胶质瘤U251细胞凋亡及其可能的内在机制。方法四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测不同浓度的土贝母苷甲对U251细胞增殖的影响。Hoechst 33258荧光染色观察不同浓度土贝母苷甲处理U251细胞后细胞核形态的变化。流式细胞仪检测细胞的凋亡率。Western blot分析土贝母苷甲对FADD、caspase-8和caspase-3蛋白表达水平的影响。结果土贝母苷甲以剂量依赖方式抑制U251细胞的增殖。土贝母苷甲处理后,U251细胞的细胞核表现出固缩浓染等凋亡特征,且随着药物浓度的增加,细胞数目逐渐减少。与对照组相比较,土贝母处理组(10、20、25μg/ml)的早期和晚期凋亡率均显著增加,差异有统计学意义(P﹤0.05)。10、20、25μg/ml土贝母苷甲处理组上调了FADD、caspase-8和caspase-3蛋白的表达水平,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论土贝母苷甲在体外能够明显的抑制U251细胞的增殖,其机制可能与上调FADD、caspase-8和caspase-3蛋白表达从而诱导细胞凋亡有关。     

利用RNA干扰技术抑制Cyr61表达对人脑胶质瘤细胞药物敏感性和凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制Cyr61基因表达增强人脑胶质瘤U251细胞对化疗药物敏感性及凋亡能力的研究.方法 针对Cyr61 Mrna序列设计合成小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建Prnat-Cyr61重组表达载体,转染人脑胶质瘤U251细胞:通过RT-PCR和Western blot分析其对U251细胞内源性Cyr61表达的影响;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察U251细胞对化疗药物顺铂和替莫唑胺敏感性的改变;用流式细胞仪检测U251细胞体外凋亡的变化.结果 成功构建Prnat-Cyr61重组质粒,并成功转染U251细胞;RT-PCR和Western blot结果证实重组质粒在Mrna及蛋白水平分别显著抑制Cyr61基因表达(P<0.01);MTT及流式细胞仪结果证明在和顺铂或替莫唑胺联合作用下,Prnat-Cyr61组U251细胞的生长抑制率和凋亡率都明显增高(P<0.01).结论 Prnat-Cyr61可抑制Cyr61在人脑胶质瘤U251细胞中的表达,并增强U251细胞对化疗药物敏感性及其体外凋亡率.     

miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响

目的 探讨miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响及可能机制.方法 体外培养胶质瘤U251细胞,实验组将miR-29c mimics转染至细胞,miR mimcs转染作为对照组.应用实时荧光定量PCR检测转染后miR-29c表达量的改变,MTT实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外侵袭实验分析miR-29c转染后细胞的体外侵袭能力,Western blot检测转染后转录因子YY1蛋白的表达.结果 荧光定量PCR结果显示:实验组miR-29c表达量为(106.65±15.51),较对照组显著上调(P＜0.01).与对照组比较,实验组U251细胞的增殖能力明显降低(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.05),体外侵袭能力明显减弱(P＜0.01),YY1蛋白表达下调(P＜0.01).结论 miR-29c可能通过调控YY1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的生物活性.     

甘草查尔酮A对胶质瘤的增殖抑制及促凋亡作用机制研究

目的探讨甘草查尔酮A(LCA)对人胶质瘤U87、U251细胞的增殖抑制和促凋亡作用及其机制研究。方法通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制作用,并计算出半数抑制浓度(IC50),按IC50和100μM不同浓度进行分组。采用倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡以及Western Blot从蛋白水平检测凋亡相关分子的改变情况。结果 MTT显示LCA对人胶质瘤U87、U251细胞具有明显的增殖抑制作用,呈浓度及时间依赖性,LCA对U87、U251细胞48 h的IC50值分别为61.54μM和53.02μM,倒置显微镜下观察细胞密度减少,形态发生明显改变。流式细胞术结果显示,LCA可促进胶质瘤U87、U251的细胞凋亡(P0.01)。Western Blot结果显示,LCA干预后可显著降低胶质瘤U87、U251细胞内Bcl-2的表达(P0.01),相反,增加Bax的表达(P0.05),呈浓度依赖性。结论 LCA对胶质瘤U87、U251细胞具有明显的增殖抑制作用,可能通过内源性凋亡途径诱导其凋亡。     

共抑制miR-221/222表达上调PUMA促进胶质瘤U251细胞凋亡的体外研究

目的 探讨反义miR-221/222上调PUMA表达促进人脑胶质母细胞瘤U251细胞凋亡及其机制.方法 脂质体共转染反义miR-221/222下调U251人脑胶质瘤细胞株miR-221、miR-222的表达.流式细胞术检测转染后U251细胞凋亡变化;Caspase 3/7活性检测转染后U251细胞中Caspase 3的活性;JC-1检测转染后U251细胞线粒体膜电位变化;免疫荧光检测Bax蛋白定位;Western blot分析凋亡相关蛋白的表达变化.结果 流式细胞术显示反义miR-221/222可增加U251细胞凋亡;Caspase 3/7活性检测显示反义miR-221/222可增加U251细胞Caspase 3活性;JC-1检测显示反义miR-221/222可增加U251细胞线粒体膜电位衰减;免疫荧光检测反义miR-221/222可促进Bax蛋白从胞质中向线粒体膜上转移;Western blot显示反义miR-221/222共转染组的PUMA、Caspase 3、Bax蛋白表达明显上调,bc1-2蛋白表达明显下调.结论 反义miR-221/222通过上调PUMA蛋白表达来增加胶质瘤细胞U251的凋亡.     

脑胶质瘤耐放射细胞亚株的建立方法

目的探索诱导并建立脑胶质瘤耐放射细胞亚株的体外实验方法,为进一步研究胶质瘤放疗抵抗发生的分子生物学机制提供基础。方法以脑胶质瘤U251细胞株为实验对象,通过体外细胞培养,应用60Co射线对脑胶质瘤U251细胞株进行小剂量重复的诱导照射,得到U251耐放射细胞亚株RR-U251。观察RRU251细胞形态的变化;MTT检测其细胞活力,流式细胞仪(FCM)检测其细胞凋亡;集落形成实验检测细胞克隆团形成。结果放射治疗后,RR-U251与U251细胞的相比:细胞增殖活力增强11.5%,迁移能力增强50%,侵袭能力增强87.5%,凋亡率下降69.6%,细胞集落形成率升高88.5%;RR-U251放射敏感性明显下降。结论小剂量重复照射诱导法能较好地建立胶质瘤耐放射细胞亚株RR-U251。     

蒿甲醚对人胶质瘤细胞系U251细胞凋亡的影响

目的研究蒿甲醚对体外培养的人胶质瘤细胞系U251细胞凋亡的影响并初步探讨其机制。方法不同浓度蒿甲醚（25、50、100、200、400、800μmol／L）作用U251胶质瘤细胞,四甲基偶氮唑盐法测定药物抑制率和半抑制浓度（IC50）;流式细胞术检测细胞周期的变化和细胞凋亡情况;Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡情况。结果蒿甲醚对U251细胞生长抑制率随药物浓度增加而显著增加（P〈O．05）,同时随药物作用时间延长而显著增加（P〈O．05）。药物作用24、48和72h,其IC50分别为849．28±25．89、518．93±32．83和172．99±6．06μmol／L,三者之间均差异显著（P〈0．05）。经400μmol／L蒿甲醚作用48h,Hochest33258荧光染色可观察到凋亡小体。经400μmol／L蒿甲醚作用24、48、72h,细胞凋亡率分别为（4．55±0．24）％、（12．82±1．88）％和（24．22±2．17）％,三者之间均差异显著（P〈0．05）;细胞周期分析显示,随着蒿甲醚作用时间的延长,G0/G1期细胞比例显著增加（P〈0．05）,S期和G2/M期细胞比例显著减少（P〈O．05）。结论蒿甲醚能抑制U251细胞生长,呈剂量和时间依赖性;其机制可能为将细胞阻滞在G0/G1期并诱导其凋亡。     

硼中子俘获疗法诱导U251胶质瘤细胞凋亡

目的研究硼中子俘获疗法（BNCT）能否诱导体外培养的U251细胞发生凋亡，并探讨其诱导细胞凋亡的机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线，应用光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜观察BNCT后细胞形态改变；使用流式细胞仪检测细胞凋亡率；利用细胞克隆形成实验分析细胞存活分数；用免疫组织化学方法检测相关蛋白表达的变化。结果在体外试验中BNCT对U251细胞的杀伤力强，并观察到了典型的细胞凋亡改变，4、8Gy照射后48h流式细胞仪检测，细胞凋亡率分别为60．2％、80．6％。在凋亡过程中，p53蛋白表达明显增高，而bcl-2蛋白表达下调。结论BNCT可诱导U251细胞发生凋亡，其机制可能与p53基因表达上调及bcl-2基因表达下调有关。     

miR-106a抑制胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡

目的胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有较高的病死率。现有的研究表明miR-106a在多种肿瘤中表达上调,并发挥着致癌性作用,但miR-106a在胶质瘤中的表达和作用却并不清楚。方法不同级别胶质瘤组织和胶质瘤细胞系(T98G,SHG44,U87,U251,U373)内的miR-106a水平通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定。转染miRNA寡聚核苷酸后的U87和U251细胞的增殖能力和细胞周期分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和流式细胞仪测定,并且通过膜联蛋白/碘化丙啶(annexin V/PI)双染法测定了miR-106a对胶质瘤细胞的凋亡影响。结果miR-106a在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系内表达水平相对正常脑组织显著下降,并且miR-106a表达水平与胶质瘤病理级别负相关。胶质瘤细胞转染miR-106a后,可检测到过表达的miR-106a可显著抑制胶质瘤细胞的增殖能力,阻滞细胞周期于G0/G1期,同时诱导胶质瘤细胞凋亡增加。结论 miR-106a可阻滞胶质瘤细胞细胞周期、抑制增殖和诱导凋亡。     

丙酮酸乙酯对人脑胶质母细胞瘤U251细胞和HMGB1的抑制作用

目的探讨丙酮酸乙酯(EP)对人脑胶质母细胞瘤U251细胞的作用及可能的机制。方法不同浓度EP处理U251细胞后,分别用细胞计数试剂盒(CCK-8)和平板克隆的方法检测EP对U251增殖及克隆形成能力的影响,并采用Hoechst 33258染色和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)染色流式细胞术观察细胞凋亡的变化,蛋白印迹法分析高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达水平的变化。结果 EP(10、15、20 mmol/L)分别作用8 h、16 h、24 h后均能抑制U251细胞的增殖,且存在显著的剂量-时间效应关系。与对照组相比,EP处理后U251细胞克隆形成能力减弱、细胞凋亡率升高。不同浓度组EP作用U251细胞24 h后HMGB1的蛋白表达水平随药物浓度的增加而降低。结论 EP能明显抑制人脑胶质母细胞瘤U251增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与下调HMGB1的表达水平有关。