MINT蛋白(1～365氨基酸)与Vav1相互作用及其位点的验证

目的：明确MINT(Msx2-interacting nuclear target protein)N-末端与Vav1之间的相互作用，进一步探讨MINT的转录抑制调控功能及其机制．方法：以克隆有MINT—F1片段(1—365氨基酸)的pGBKT7-F1质粒作为诱饵，分别与pACT2-V23#， pGADT7-V620，pACT2-V8900．pGADT7-SH2和pGADT7-SH3几个克隆有Vav1不同结构域的质粒，用酵母双杂交方法分析它们之间的相互作用．结果：pACT2-V23#与pGBKT7-F1之间、pACT2-V8900与pGBKT7-F1之间有比较明确的相互作用，而pACT2-V23#与pGBKT7-F2-F6、pGBKT7-F1与pGADT7-V620、pGADT7-SH2和pGADT7-SH3之间均无相互作用．结论：①MINTN-端的F1段与Vav1发生相互作用；②Vav1与MINT的F1段发生相互作用的区域位于其SH2-SH3-C端结构域，而且独立的Vav1 SH2或SH3-C端结构域均不能发挥与MINT的F1段产生相互作用的功能。     

核基质MINT N端片段(365～1084aa)相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的:确定核蛋白MINT(Msx2-interacting nuclear target Protein)的功能及作用机制. 方法:利用酵母双杂交的方法,以MINT N端第365～1084位氨基酸(MINT-F2)为诱饵用酵母双杂交法筛选小鼠胚胎9日的cDNA文库. 用诱饵质粒和文库先后转化酵母宿主后,对1.0×108个酵母克隆进行营养筛选和β-半乳糖苷酶筛选,获得128个阳性克隆. 并提取质粒进行酶切鉴定,将获得的4个非重复克隆并进行序列分析. 结果:筛选出4个与MINT-F2相互作用的蛋白,它们分别是:67 ku层黏连蛋白受体,,2个16 S核糖体RNA,精氨酰-tRNA合成酶. 结论:成功筛选出与MINT-F2相互作用的蛋白,为进一步研究MINT的功能及作用机制打下基础.     

核基质MINT C端片段(2226-2959)相互作用分子的筛选与鉴定

目的:为了研究MINT的功能及其转录抑制的机制,筛选与MINT相互作用的蛋白.方法:以MINT第2226-2959氨基酸(F5为诱饵,用酵母双杂交法筛选小鼠胚胎9 d的cDNA文库.用诱饵质粒和文库先后转化酵母宿主后,对4.5×106个酵母克隆进行了营养筛选和α-半乳糖苷酶筛选,获得51个阳性克隆.从中提取质粒进行酶切鉴定,获得10个非重复克隆,对此10个克隆进行序列分析.结果:筛选到的3个基因分别为MINT,α-晶状体蛋白结合蛋白1(A1phaA-CRYBP1)和核受体辅抑制因子1(N-CoR1).在酵母中分析了N-CoR1与MINT的作用区段,N-CoR1与MINT的2226-2959和2960-3576两个片段均有相互作用.结论:①MINT在细胞内可能形成二聚或多聚体;②除了RBP-J和MSX2外,MINT还可能调节AlphaA-CRYBP1的活性;③MINT可能通过N-CoR1募集组蛋白去乙酰化酶(HDAC)进行转录抑制.     

利用酵母双杂交系统筛选与FXR1P相互作用的蛋白

目的筛选FXR1P相互作用蛋白,探讨FXR1P生物学功能。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体pGBKT7/FXR1,转化酵母菌AH109,与转化了人胎脑cDNA文库的酵母菌Y187交配筛选阳性克隆并测序。结果重组表达载体pGBKT7/FXR1构建成功;从人胎脑cDNA文库中筛选出5个与FXR1P结合的蛋白基因,分别与5种已知的编码蛋白基因序列同源：胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶（CMAS）、铁蛋白重链多肽1（FTH1）、高尔基体自身抗原golgina亚类4（GOLGA4）、17-β羟类固醇脱氢酶1（HSD17B1）、绒毛膜生长催乳激素1（CSH1）。结论为进一步研究FXR1P的功能及脆性X综合征发病机制提供新的线索。     

酵母双杂交筛选与分化抑制因子Id1′相互作用的蛋白

目的 筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子Id1′相互作用的蛋白。方法 构建重组诱饵质粒pHybLex／Zeo-Id1′，转化入酵母细胞EGY48／pSH18．34，检测重组质粒有无非特异激活报告基因；通过筛选成人肺组织文库，获取真阳性文库质粒，进行测序和同源性比较，获得真阳性克隆。结果 经测序证实，重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1′构建成功；将重组质粒转化入酵母细胞：EGY48／pSH18-34，经检测无非特异激活功能。进一步通过对文库进行筛选，获得一个真阳性克隆，通过测序和同源性比较证实该阳性克隆是酪氨酸蛋白激酶Fyn。结论 分化抑制因子Id1′与Fyn在酵母细胞中存在相互作用。     

人卵巢cDNA文库中与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子的筛选及其调控作用

目的：利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的新候选分子,并用生物信息学方法分析其与Wee1B相互作用是否能调控小鼠受精卵早期发育。方法：以pcDNA3.1/V5 His TOPO Wee1B WT质粒为模板构建pGBKT7 Wee1B诱饵质粒;制备酵母感受态细胞,将诱饵质粒pGBKT7 Wee1B转化酵母感受态细胞后分别接种SD/Trp（SDO）、SD/Trp/X α Gal（SDO/X）和SD/Trp/X α Gal/AbA plates（SDO/X/A）培养板检测其对酵母的毒性和自身激活能力,利用Western blotting法检测pGBKT7 Wee1B在酵母中的表达情况;将含有pGBKT7 Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定,最终再经酵母重新转化验证。在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在小鼠受精卵发育过程中可能发挥的作用。结果：双酶切鉴定和测序分析,pGBKT7 Wee1B诱饵质粒构建成功。将该质粒转入酵母感受态细胞后在SDO/X/A平皿上无克隆。将pGBKT7 Wee1B和pGBKT7空载体转入酵母感受态细胞中,菌液接种于SDO平皿,2个SDO平皿上克隆都均匀生长。从工作板SDO和阳性对照板上挑取阳性克隆扩大培养,裂解细胞提取蛋白,Western blotting法检测示pGBKT7 Wee1B对应位置出现条带。含诱饵质粒的酵母菌与人卵巢cDNA文库融合,PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。将质粒测序并经BLAST分析筛选出9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白,生物信息学分析可能与小鼠卵母细胞发育和受精卵发育密切相关的蛋白。结论：利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出9个与Wee1B蛋白激酶相互作用的蛋白,这些筛选蛋白可能通过与Wee1B相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。     

野生型ADAR1蛋白与其R916W突变体在哺乳动物细胞中相互作用的研究

目的：应用酵母双杂交和哺乳动物双杂交系统研究野生型双链RNA腺苷酸脱氨基酶ADAR1蛋白（ADAR1^WT）与其突变体R916W（ADAR1^R916W）之间的相互作用,从而探讨ADAR1基因错义突变在遗传性对称性色素异常症中的分子致病机制。方法：通过RT-PCR方法从患者外周血白细胞中获得含ADAR1基因R916W突变的全长cDNA,将野生型和突变cDNA分别克隆到相关质粒载体上,利用Matchmaker^TM GAL4酵母双杂交系统3和CheckMate^TM哺乳动物双杂交系统检测蛋白单体间的相互作用。结果：在酵母细胞中未检测到野生型-野生型ADAR1蛋白及野生型-突变体ADAR1蛋白间的相互作用;与对照细胞相比,pBIND-ADAR1^WT和pACT-ADAR1^WT共转染的HeLa细胞中荧光素相对活性显著升高（P＜0.05）;与共转染pBIND-ADAR1^WT和pACT-ADAR1^WT的HeLa细胞比较,pBIND-ADAR1^R916W和pACT-ADAR1^WT共转染的细胞中荧光素相对活性明显降低（P＜0.05）,为前者的66%。结论：在哺乳动物细胞中ADAR1^WT自身相互作用,ADAR1^WT和ADAR1^R916W突变体蛋白相互作用依然存在但作用明显减弱。     

应用酵母双杂交技术筛选与前S1蛋白反式激活蛋白3结合的肝细胞蛋白基因

目的用酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白反式激活蛋白3(PS1TP3)的结合蛋白。方法通过聚合酶链反应扩增获得的PS1TP3基因,构建诱饵质粒pGBKT7-PS1TP3,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-Gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经BglII酶切后测序,进行生物信息学分析。结果筛选出30个与PS1TP3相互作用的蛋白,其中包括泛素蛋白酶E2、丝裂原活化蛋白激酶、β2-微球蛋白、磷酸酯酶张力蛋白等已知功能基因及4个未知功能序列,以及拼接新基因1个。结论成功克隆出PS1TP3蛋白的结合蛋白,为研究PS1TP3的分子生物学功能及HBV的致病机制提供了新的思路和线索。     

从人卵巢cDNA文库中筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用蛋白及在小鼠1-细胞期受精卵中的功能验证

【目的】 筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子,证实该蛋白与Wee1B的相互作用及作用机制,并进一步探讨其对小鼠受精卵早期发育的影响,本研究对揭示小鼠受精卵早期发育的分子机制和生殖机理具有十分重要的意义,为优化人类辅助生殖提供理论和实验依据。 【方法】 构建pGBKT7-Wee1B诱饵质粒并转入酵母感受态细胞中检测其对酵母的毒性、自激活能力以及表达情况,再将含有pGBKT7-Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定。经酵母重新转化验证后,在哺乳动物细胞中使用免疫共沉淀和免疫荧光共定位的方法确定候选分子与Wee1B蛋白激酶的相互作用。过表达或降低筛选分子,并显微注射入小鼠1-细胞期受精卵中观察Wee1B的蛋白激酶活性和定位的变化及候选分子是否通过Wee1B调控小鼠受精卵的早期发育。 【结果】 以小鼠Wee1B编码基因的pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT野生型质粒为模板,设计特异性引物构建出pGBKT7-Wee1B诱饵质粒;诱饵质粒pGBKT7-Wee1B对酵母感受态细胞无毒性,无自激活能力,通过蛋白质印迹法验证其在酵母感受态细胞中表达;酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出了9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白;免疫共沉淀证实蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在HEK293细胞中存在相互作用;免疫荧光共定位确定蛋白激酶Wee1B与KHDRBS3蛋白在小鼠受精卵中共定位;干预KHDRBS3影响Wee1B的蛋白激酶活性和定位,并影响小鼠受精卵的早期发育。 【结论】 成功构建pGBKT7-Wee1B质粒,并以此为诱饵,利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库筛选出KHDRBS3蛋白;免疫共沉淀证实KHDRBS3与Wee1B存在相互作用,且二者在小鼠1-细胞期受精卵中共定位。以上提示KHDRBS3蛋白可能通过调控Wee1B的蛋白激酶活性和定位进而参与小鼠受精卵的早期发育。     

人早幼粒细胞cDNA文库中与GINS2发生相互作用靶蛋白的筛选和鉴定

目的:采用酵母双杂交系统筛选与人GINS2编码蛋白发生相互作用的靶蛋白,阐明其在急性早幼粒细胞白血病(APL)中的致病信号及相关机制.方法:采用热激法将诱饵质粒pGBKT7-GINS2与人早幼粒细胞cDNA文库质粒共同转化至酵母AH109感受态细胞中,筛选与GINS2编码蛋白相互作用的文库蛋白.利用多重报告基因检测和D...     

酵母双杂交方法筛选与NGF受体TrkA相互作用的新蛋白质

目的：寻找新的ArkA可能底物或调控蛋白，以深入认识TrkA下游信号转导机制，方法：将TrkA胞内域与LexA蛋白融合作为诱饵蛋白，应用酵母双杂交方法筛选人脑LexA cDNA文库，经β－半乳糖苷酶活性鉴定和测序分析进一步鉴别，获得阳性克隆。结果：明确阳性克隆中的TrkA^IC-BP1为一种新的TrkA结合蛋白，免疫共沉淀实验证实了TrkA^IC-BP1和TrkA在酵母中的相互作用，结论：首次筛选到TrkA结合蛋白－TrkA^IC-BP1，它可能在TrkA引起神经元分化的功能调控中起重要作用。     

分化抑制因子1相互作用蛋白AGGF1的筛选

目的 利用酵母双杂交方法,筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子1(Id1)相互作用的蛋白.方法 PCR方法扩增Id1的编码序列并定向克隆入诱饵质粒pHybLex/Zeo,构建重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1,酶切鉴定后转化人酵母株EGY48/pSH18-34,检测重组诱饵质粒有无非特异激活报告基因Leu2、LacZ作用;扩增并提取成人肺组织文库质粒,将文库质粒及重组诱饵质粒转化入酵母细胞,依次筛选Leu2 ,Leu2 LacZ 克隆;设置阴性及阳性对照,重复筛选Leu2 LacZ 克隆并排除假阳性克隆,获取真阳性文库质粒,进行测序和同源性比对.结果 酶切证实,重组诱饵质粒构建成功.重组诱饵质粒转化入酵母细胞后.经检测无非特异激活报告基因作用.扩增并筛选成人肺组织文库.获得198个Leu2 及19个Leu2 LacZ 克隆.经排除假阳性克隆,最终获得1个Leu2 LacZ 真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆与蛋白AGGF1高度同源(556/559,99.5%),Westem blotting证实其在酵母细胞中有表达.结论 利用酵母双杂交方法,通过筛选成人肺组织文库,发现Id1与AGGF1存在相互作用.     

MST1的酵母双杂交及与Salvador体外结合的研究

利用酵母双杂交系统,以鼠M ST 1(M amm alian STE 20-1 ike 1)为诱饵蛋白,在鼠胚胎库中筛选到22个Salvador的片段。通过E.coli表达系统纯化了6个组氨酸(6H is)融合的M ST 1和谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合的Salvador,并做体外蛋白质结合实验,进一步证实了两蛋白质相互结合。通过体外激酶活性分析,发现M ST 1并不直接磷酸化Salvador,但是Salvador能够较强地抑制M ST 1对M BP(磷酸丁酯)的磷酸化,提示有可能Salvador通过影响M ST 1的激酶活性来参与了M ST 1介导的细胞凋亡途径。