IL-18的生物学活性及其制备

白细胞介素 18(IL 18)在体内分布广泛 ,具有多种生物学活性 ,可调节多种细胞的发育及细胞因子的分泌 ,对包括肿瘤在内的许多疾病的治疗和免疫病理反应的干预有重要意义。本文从细胞分子水平对此进行了综述 ,并对其制备进行了初步探讨。     

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL-10／pET32a,测序正确后转化E.coli BL21（DE3）,不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10,MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx,有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。     

重组IL-12对人乳腺癌细胞自噬的研究

目的 探讨重组人IL-12（rIL-12）对乳腺癌细胞自噬的影响。方法 两株乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MCF7）分别用rIL-12处理,经免疫蛋白印迹技术和细胞免疫荧光技术检测其自噬微管相关蛋白轻链3（LC3）的变化,以观察自噬情况;另外,用透射电镜观察rIL-12处理乳腺癌细胞前后自噬小体的变化。分别用胰岛素样生长因子1（IGF-1）激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路,再加入rIL-12处理后,蛋白免疫印迹法检测相关通路蛋白PI3K/Akt, 哺乳动物雷帕霉素靶点（TOR）磷酸化变化及LC3的表达。结果 与空白组相比,rIL-12组细胞的自噬标志蛋白LC3表达增高,差异有统计学意义（P＜0.05）,且增加程度呈时间和浓度依赖性;荧光显微镜观察自噬体形成的结果显示,与空白组相比,rIL-12处理组的细胞核周点状聚集的绿色荧光增多;使用电镜观察到rIL-12处理组明显有自噬小体形成。与rIL-12组相比,IGF-1+rIL-12组的LC3Ⅱ表达减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 rIL-12可以激活乳腺癌细胞自噬,并通过抑制PI3K/Akt信号通路的机制,促进自噬标志蛋白LC3,特别是LC3Ⅱ的表达。     

重组人干细胞因子治疗骨髓增生异常综合征的临床可能性

为明确骨髓增生异常综合征(MDS)患者造血祖细胞对重组人干细胞因于(rhSCF)的反应性,使用无血清培养体系体外培养,比较MDS与正常人红、粒系克隆性生长能力.结果表明,两例难治性贫血(RA)在rhSCF 重组人白介素3(rhlL-3) 重组人促红素(rhEPO)三因于联合刺激作用下,早期红系祖细胞(BFU-E)克隆生长接近正常水平.促粒系造血方面,rhSCF rhIL-3或重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)联合作用下,粒/巨噬祖细胞(CFU-GM)克隆生长虽未达正常水平,却较单一rhIL-3或rhGM-CSF高7～29倍或5.6～12倍.结论:至少部分MDS患者的红系祖细胞数量并未减少.rhSCF与其它造血生长因子联合治疗MDS有重要临床意义.     

重组人IL-12在CHO细胞中高效表达克隆的筛选及产物的生物学活性分析

目的:重组人白细胞介素-12(rhIL-12)真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-pT0)转染CHO细胞,筛选高效稳定表达克隆;并对表达产物进行生物学活性分析.方法:采用聚乙烯亚胺(PEI)将pcDNA6/v5-his-p70转入CHO细胞;用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选阳性表达克隆,并进行单克隆扩增;RT-PCR进行表达鉴定;ELISA检测各克隆rhIL-12的表达量;应用淋巴细胞增生实验及细胞内细胞因子染色方法分析rhIL-12的生物学活性.同时,对筛选出的阳性克隆进行表达稳定性观察.结果:RT-PCR结果显示,选取的20个阳性克隆均可扩增出1 800 bp的特异性片段;ELISA表明,其中6个克隆rhIL-12表达水平较高(312.69～719.10 ng/L),最高表达量达到719 ng/L(5×104个细胞,48 h);生物学活性分析表明,表达的rhIL-12可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV反应的C34/IFN-γ及CD8/IFN-γ双标记阳性细胞克隆的频数;并且,可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV刺激的增生反应效能.阳性克隆在维持量的筛选药物(2 ng/LBlasticidin)压力下传代6个月,其表达水平无明显变化.结论:rhIL-12真核表达载体(pcDNA6/v5-his-p70)能在CHO细胞中高效稳定表达;其表达产物具有良好的生物学活性.     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

IL-12对CIK细胞体外增殖及细胞毒活性影响的研究

目的观察IL-12对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）体外扩增和细胞毒活性的影响。方法采用3种不同的细胞因子组合扩增CIK细胞,即IL-2组：IFN-1、CD3单抗、IL-1和IL-2;IL-2加IL-12组：IFN-γ、CD3单抗、IL-1、IL-2和IL-12;IL：12组：IFN-γ、CD3单抗、IL-1和IL-12。细胞计数法测定细胞的增殖、流式细胞术分析细胞表型,MTT法测定细胞毒作用。结果3种方法均可使细胞增殖能力显著增加,对CD3^＋CD56^＋细胞的诱导作用也无明显差异,IL-12与IL-2联合作用组促增殖能力和细胞毒性作用明显强于其他两组,P〈0．05,差异有统计学意义。结论IL-12同样可以用于CIK细胞的诱导,而联合IL-12与IL-2可以显著增强CIK细胞的增殖能力和细胞毒性。     

重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定

以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。     

重组人IL-12和SCF促进新生儿脐带血中CD34~+细胞的分裂增殖

目的分析IL-12及SCF对CD34+细胞分裂增殖及IL-12Rβ的表达。方法分离正常足月产新生儿脐带血与健康成年人外周血中的单个核细胞,采用流式细胞术(FACS)比较2组中CD34+细胞的频率,分析IL-12及SCF对CD34+细胞的作用。结果健康成年人外周血中CD34+细胞平均频率为0.13%,显著低于新生儿脐带血中CD34+细胞的平均频率1.53%(P<0.001)。进一步研究表明,SCF可以促进CD34+细胞表达CD25;IL-12及SCF可以显著促进CD34+细胞的分裂增殖以及IL-12Rβ1的表达。结论新生儿脐带血中CD34+细胞的频率明显高于成年人外周血中CD34+细胞的频率。IL-12及SCF可以促进CD34+细胞的分裂增殖以及IL-12Rβ1的表达。     

重组人可溶性gp130的纯化及生物学活性鉴定

采用转瓶培养可溶性gp130基因转染细胞。运用免疫亲和层析法,将抗人可溶性gp130的单克隆抗体偶联于CNBr活化的Sepharose 4B。收获基因转染细胞的培养上清,经抗gp130单抗/Sepharose 4B亲和层析柱吸附,用pH 2.8、0.1 mol/L甘氨酸溶液洗脱,获取可溶性gp130重组蛋白纯品。基因转染细胞培养上清中可溶性gp130的表达量为100~120μg/ml,纯化后的回收率为70%~75%,SDS-PAGE电泳后出现一条蛋白曲带。经Western blot分析,纯化的可溶性gp130能与特异性抗体结合。将可溶性gp130(终浓度为5μg/ml)与IL-6依赖性生长细胞株XG2共同培养,细胞的生长与增殖出现抑制。提示经免疫亲和层析法纯化的可溶性gp130具有良好的生物学活性。     

人白细胞介素4的原核表达、复性、纯化及生物学活性鉴定

用PCR方法从pORF-hIL4质粒中扩增重组人白细胞介素4(hIL-4)的基因,构建PQE60原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达。对表达的目的蛋白的可溶性进行鉴定,发现hIL-4基因表达产物在大肠杆菌中主要以不溶性包涵体形式存在,经过超声波破细菌、包涵体提取、洗涤处理后,用5mol/L盐酸胍变性溶解包涵体沉淀,上清稀释复性后透析,再经镍亲和层析进行纯化。纯化后的hIL-4进行TF-1细胞体外增生实验检测其生物学活性后,可用于人外周血树突状细胞的体外诱导培养。     

人白介素24腺病毒载体构建及其生物学活性分析

目的：克隆人白介素24基因，构建其腺病毒载体，获取病毒重组子，并研究其生物学括性。方法：用密执毒素（Mezerein）诱导HeLa细胞表达IL-24，通过RT-PCR获取IL-24 cDNA，将其亚克隆至pAdTrack-CMV载体，经PmeⅠ线性化后，与腺病毒的骨架载体pAdEasy-Ⅰ在BJ5183菌中同源重组，HEK293细胞包装扩增，PCR、Western blot鉴定。AdIL-24处理宫颈癌CaSki细胞，通过MTT细胞存活实验检测其活性；Hoeehst33342染色、流式细胞仪检测凋亡；WesternNot检测Bax、Bd。2、p53蛋白的表达。结果：获取人IL-24的cDNA，序列与GeneBank公布序列完全一致，成功构建腺病毒载体，AdIL-24对CaSki细胞具有抑制生长、促进凋亡的作用，并上调Bax、p53蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达。结论：成功构建人IL-24的重组腺病毒载体，其病毒重组子具有生物活性。     

人IL-12/慢病毒重组体对结肠癌干细胞“干性”的影响

目的:构建并鉴定人白介素12(Interleukin-12,IL-12)-慢病毒过表达重组体,观察其在结肠癌干细胞(Cancer stem cell,CSCs)中的表达及其作用,为后续动物试验做准备.方法:PCR扩增pORF-hIL-12质粒获得IL-12基因,通过双酶切及连接后构建IL-12/慢病毒过表达重组体;分离鉴定结肠CSCs,将IL-12/慢病毒过表达重组体转染结肠CSCs建立IL-12过表达模型,检测IL-12在结肠CSCs的表达及对结肠CSCs“干性”的影响.结果:PCR、酶切鉴定及测序证实IL-12/慢病毒过表达重组体构建正确,流式细胞仪成功分选出CD133+CD44+ SW480结肠CSCs,IL-12/慢病毒转染结肠CSCs后,RT-PCR及Western blot证实结肠CSCs培养上清均有IL-12表达,IL-12抑制结肠CSCs自我更新,促进其分化.结论:IL-12/慢病毒过表达重组体能在结肠CSCs中稳定表达并能抑制结肠CSCs自我更新及分化.     

三色流式细胞术在检测人外周血CD4+CD25+CD62L+调节性T细胞的应用

随着流式细胞术(FCM)在淋巴细胞亚群分析及免疫状态分型技术领域的应用日益成熟,多参数FCM分析,已能区分不同的细胞亚群,由间接免疫荧光标记法,过渡到采用直接免疫荧光标记且从单色荧光发展到双色及多色荧光标记.     

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性

目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.     

重组人Era蛋白的可溶性表达、纯化及生物学活性测定

目的:为了得到可溶性表达的人Era(hEra)蛋白,并检测其生物学活性.方法:把人era的cDNA基因从pUC19质粒亚克隆人表达质粒pMAL-p2x中.pMAL-hEra转化大肠杆菌TB1,用异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果:pMAL-hEra载体表达的融合蛋白是以可溶状态存在,表达量占菌体总蛋白的23.9%.再利用直链淀粉亲和色谱柱对表达的融合蛋白进行纯化,接着用因子X将融合部分切除,但切除后的hEra蛋白不稳定,随着时间的延长而被降解.活性测定结果表明人Era蛋白能与GTP结合,并具有GTP酶的活性.结论:可溶性表达了人Era蛋白,并用体外实验证实人Era蛋白是一种G蛋白,这对人era基因的功能研究具有重要意义.     

一种新型重组人源性白细胞介素-8活性检测方法的建立

目的通过蛋白质片段互补检测（proteinfragmentcomplementationassay,PCA）技术检测重组人源性IL-8的生物学活性。方法利用PCA方法构建了Split—TEVGPCR激活检测系统,为了验证其有效性,在不同的宿主系统中表达和纯化了各种亚型的人源性IL-8重组蛋白用于进行活性检测。蛋白样品包括：①IL-8亚型I（残基21-99）,通过在哺乳动物细胞HEK293中分泌表达前体IL-8基因获得,其N端信号肽（残基1—20）被切除;②IL-8亚型Ⅱ（残基23—99）和亚型Ⅲ（残基28—99）,通过在大肠杆菌BL21（DE3）中表达获得。结果Split—TEVGPCR激活检测系统证明纯化后的重组人源性IL．8样品对天然受体IL8RB都具有明显的激活活性,其EC50值分别为：12．32±0．89ng／mL（亚型I）、15．14±1．84ng／mL（亚型Ⅱ）和2．854-0．50ng／mL（亚型Ⅲ）。结论成功建立了-种新型的重组人IL-8活性检测方法,为进一步的理论研究和IL-8中和抗体的高通量筛选奠定了基础。     

抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选、鉴定和免疫活性检测

近年来 ,随着噬菌体抗体表面展示技术的不断发展 ,人们正广泛应用该技术研制各种人源噬菌体单链抗体。单链抗体仅为完整抗体的六分之一〔1,2〕,因其具有分子小、容易进入病灶周围的微循环及在肾脏内清除异物快等优点 ,在疾病的治疗方面引起广泛重视。本研究利用该技术 ,成功地筛选到了抗细粒棘球蚴重组Ｂ抗原的人源单链可变区抗体 ,并对其特异性进行了鉴定。材料和方法材料 :人源噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头 (Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ) 3 连接的抗体文库 ,由北京 30 2医院基因治疗中心提供 ;重组细粒棘球蚴Ｂ抗原为本所自制 …     

重组人IL-18对辐射损伤后小鼠免疫功能的调节作用

目的:探讨重组人IL-18(IL-18)对辐射损伤后小鼠免疫功能的影响.方法:对32只小鼠分4组进行辐射损伤,然后分别用淋巴细胞转化实验、NK细胞细胞毒实验、T淋巴细胞亚群测定和血清中IgG测定方法观察IL-18对其免疫功能的调节作用.结果:重组人IL-18能够提高辐射损伤后小鼠的T、B淋巴细胞转化能力,增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力,上调CD4 T细胞的数量,但对IgG产生能力没有调节作用.结论:重组人IL-18对辐射后小鼠免疫功能损伤有促进恢复的作用.     

苦杏仁甙与人淋巴细胞产生细胞因子效应的初步观察

苦杏仁甙免疫活性的研究已见较多报道,但未见有对人免疫功能影响的相关研究。本文观察了苦杏仁甙对人淋巴细胞增殖及其分泌细胞因子的影响,以期为临床应用提供实验基础。