缺氧条件下HIF-1α对舌鳞癌细胞VEGF-C及FAS表达的影响

目的探讨缺氧条件下人舌鳞癌Tca8113细胞株HIF-1α对VEGF-C及FAS基因表达的影响。方法采用RT-PCR技术半定量检测人Tca8113细胞常氧和缺氧培养0.5、1、3、6、12和24h HIF-1α、VEGF-C和FAS基因的表达。结果缺氧条件下HIF-1α与VEGF-C基因表达呈先升后降的趋势,二者表达呈显著正相关性（rs=0.979,P〈0.01）。FAS基因表达呈上升趋势,与HIF-1α表达无明显相关性（rs=0.556,P〉0.05）。结论缺氧条件下Tca8113细胞中HIF-1α可上调VEGF-C的表达,促进癌细胞的转移;HIF-1α参与促进肿瘤细胞FAS的表达,影响舌癌细胞的凋亡。     

靶向siRNA干扰hTERT联合顺铂抑制Tca8113增殖的实验研究

目的：应用hTERT特异性siRNA干扰舌癌Tca8113细胞hTERT基因的表达,探讨hTERT-siRNA联合顺铂对舌癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响。方法：体外化学合成针对hTERT的siRNA,通过阳离子脂质体将siRNA-hTERT1转染舌癌Tca8113细胞,RT-PCR检测hTERTmRNA表达水平,Western印迹检测其蛋白表达水平,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）及流式细胞分析法分别测定hTERT-siRNA联合顺铂处理后对舌癌Tca8113细胞增殖及凋亡的影响。数据采用SPSS13.0进行方差分析。结果：靶向hTERT的siRNA可以有效抑制舌癌Tca8113细胞株hTERT的表达,hTERT-siRNA和顺铂均可抑制Tca8113细胞增殖并诱导其一定程度的凋亡。当联合应用靶向hTERT的siRNA和顺铂时,上述作用显著加强（P〈0.05）。结论：体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效抑制舌癌Tca8113细胞hTERT的表达,hTERT表达受抑制后,可增强顺铂作用舌癌Tca8113细胞的敏感性。     

环氧化酶-2抑制剂对舌癌细胞侵袭及基质金属蛋白酶-2表达的影响

目的探讨环氧化酶-2（Cox-2）抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌细胞系Tca8113侵袭、黏附及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）分泌的影响。方法Tca8113细胞经塞来昔布作用24 h后,免疫组织化学方法检测细胞Cox-2蛋白表达,细胞外基质黏附实验检测细胞黏附力,Boyden侵袭小室测定细胞的侵袭力,酶联免疫吸附法检测培养液中MMP-2的水平。结果Tca8113细胞经塞来昔布作用24 h后,Cox-2蛋白表达明显受到抑制,Boyden侵袭小室细胞穿膜数和细胞外基质黏附率明显降低,同时,培养液中MMP-2水平也明显降低。结论Cox-2抑制剂塞来昔布可抑制Tca8113细胞Cox-2蛋白表达,其抑制细胞侵袭力和黏附率作用可能与抑制MMP-2分泌有关。     

诱导型一氧化氮合酶基因转染对人舌癌细胞体内致瘤力的影响

目的研究外源性基因诱导型一氧化氮合酶(iNOS)转染人舌癌细胞系Tca8113后,对肿瘤细胞生物学特性以及裸鼠体内致瘤力的影响。方法采用脂质体转染法将真核表达载体pCMV-iNOS/Tca转染入舌癌细胞系Tca8113,得到高表达iNOS的细胞系pCMV-iNOS/Tca,转染空白质粒的细胞系pCMV-Tca,并以Western blot方法鉴定转染效果。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色绘制生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期分布;通过裸鼠成瘤实验,比较转染前后体内成瘤能力的差别。结果与未转染组和转染空白载体组比较,pCMV-iNOS/Tca组的细胞生长速度比Tca组快(P>0.05),细胞周期中G2/M和S期比例增加(P<0.05)。体内成瘤能力试验结果显示,pCMV-Tca、pCMV-iNOS/Tca组和Tca组平均瘤重分别为(1.1±0.24)g、(2.5±0.48)g和(1.3±0.32)g,pCMV-iNOS/Tca组的成瘤力高于pCMV-Tca和Tca组(P<0.01)。结论转染iNOS基因后,Tca8113细胞具有更强的体外增殖能力和体内致瘤能力。     

乏氧对人牙周膜细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的:检测人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)在乏氧环境下乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelia1 growth factor,VEGF)的表达情况.方法:组织块法培养人牙周膜细胞,第3代细胞用于实验,分2组分别在20%O2,5%CO2,75%N2(对照组)和1%O2,5%CO2、94%N2(乏氧组)的37℃培养箱中培养24h和48h.采用RT-PCR技术和免疫组化技术检测HIF-1α和VEGF的表达情况.应用SPSS13.0软件包进行t检验、单因素方差分析及LSD检验.结果:乏氧组HIF-1αmRNA的表达与对照组相比,差别无统计学意义.乏氧24h与48h VEGF mRNA的表达显著高于对照组(P＜0.05).免疫细胞化学细胞爬片结果显示,乏氧组HIF-1α染色阳性,大量HIF-1α蛋白在胞核积聚,且表达量随乏氧时间增加而增加,而常氧组未观察到HIF-1α的表达;VEGF的表达呈时间依赖性增加,乏氧组VEGF的表达明显强于对照组.常氧48h后,VEGF呈微弱阳性表达.结论:乏氧可以改变人牙周膜细胞的代谢途径,上调HIF-1α及相关因子的表达.     

乏氧对人舌癌Tca8113细胞uPA 活性的影响

目的：研究乏氧对人舌癌Tca8113细胞尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA） 活性的影响.方法：根据人舌癌Tca8113细胞不同乏氧时间,分为0、6、12、24 h 4 组,分别给予乏氧.采用免疫组化检测Tca8113细胞uPA蛋白表达,原位杂交方法检测Tca8113细胞uPA mRNA表达,并用Spot及IPP图像采集分析系统处理原位杂交染色结果.结果：Tca8113细胞uPA阳性表达呈棕黄色,定位于细胞质和细胞膜.Tca8113细胞uPA mRNA阳性表达呈紫蓝色,定位于细胞质;随着乏氧时间逐渐延长,紫蓝色着色逐渐加深变浓;吸光度逐渐增大,且两两比较均有显著性差异（P〈0.05）.结论：乏氧可促进人舌癌Tca8113细胞uPA mRNA高表达.提示：乏氧可能通过激活肿瘤细胞高表达uPA而促进口腔癌侵袭和转移.     

神经钙黏素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学能力的影响

目的 研究神经钙黏素(N-cadherin)表达下调对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、细胞周期、凋亡以及迁移的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 利用LipofectamineTM2000将神经钙黏素siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,将细胞分为3组:①未处理组;②对照siRNA组;③神经钙黏素siRNA组.分别收集转染后48 h的细胞,采用新型的细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)8试剂分析转染神经钙黏素siRNA后对细胞增殖能力的影响;运用流式细胞术检测下调神经钙黏素表达对Tca8113细胞周期及细胞凋亡的影响;采用Boyden 小室实验分析下调神经钙黏素对舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞迁移能力的影响;进一步采用蛋白质印迹法检测神经钙黏素表达下调对细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移相关基因表达的影响.结果 神经钙黏素siRNA能明显下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中神经钙黏素蛋白的表达,并显著抑制Tca8113细胞的增殖(P<0.05).细胞周期结果显示,神经钙黏素siRNA组中在G0/G1的细胞比率[(65.41±0.92)%]明显高于未处理组[(41.59±1.43)%]和对照siRNA组[(43.70±2.08)%],差异有统计学意义(F=216.839,P＝0.000).神经钙黏素siRNA组中细胞凋亡的比率[(25.66±1.36)%]明显高于未处理组[(2.38±0.14)%]和对照siRNA组[(2.81±0.12)%],差异有统计学意义(F=850.364,P=0.000).Boyden 小室体外侵袭实验结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中Tca8113细胞的迁移能力显著下降,差异有统计学意义(F=140.858,P=0.000).蛋白质印迹法结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和MMP-9明显下调,而p21明显上调,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 神经钙黏素在舌鳞状细胞癌的发生发展中可能具有重要的作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of downregulation of N-cadherin expression on cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration in tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells. Methods N-cadherin siRNA was transfected into tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells and Tca8113 cells were divided into three groups: untreated group, control siRNA group and N-cadherin siRNA group. The cells were harvested 48 h after transfection with N-cadherin siRNA. Cell proliferation of Tca8113 cells was examined by cell counting kit(CCK)-8 after transfection with N-cadherin, and the effects of downregulation of N-cadherin on cell cycle and cell apoptosis of Tca8113 cells were investigated by flow cytometry.The effect of downregulation of N-cadherin expression on cell migration of Tca8113 cells was observed by Boyden chamber experiment, and further expression changes of gene-related cell proliferation, cell cycle and cell migration were detected by Western blotting. Results N-cadherin siRNA downregulated the N-cadherin expression and significantly inhibited cell proliferation of Tca8113 cells (P<0.05). The results of cell cycle revealed that the percentage of G0/G1 phase in N-cadherin group [(65.41±0.92) %] was significantly higher than that in untreated group [(41.59±1.43)%] or control siRNA group [(43.70±2.08)%], and there was significant difference among the three groups (F=216.839,P＝0.000).The percentage of cell apoptosis in N-cadherin group [(25.66±1.36)%] was significantly higher than that in untreated group [(2.38±0.14)%] or control siRNA group [(2.81±0.12)%], and there was significant difference among the three groups (F=850.364,P=0.000). The cell number migrated into memebrane in N-cadherin group was significantly lower than that in untreated group and control siRNA group, and there was significant difference among the three groups (F=140.858,P=0.000). Further, compared with untreated group and control siRNA group, the expressions of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 proteins were significantly downregulated and expression of p21 protein was significantly upregulated (P<0.05). Conclusions N-cadherin may play a role in occurrence and development of tongue squamous cell carcinoma.     

RhoA小干扰RNA对舌癌细胞Tca8113增殖、侵袭影响的体外实验

目的 体外实验研究Ras基因家族同源物A(ras homolog gene family,member A,RhoA)小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在舌癌转移中的作用.方法 登录Genebank确定人RhoA基因序列,利用RNA干扰技术针对RhoA的基因序列设计4条短链RNA,构建干扰表达载体,利用LipofectamineTM2000介导法将RhoA siRNA转染至舌癌细胞系Tca8113.转染细胞后48 h检测瞬时表达效率,经杀稻瘟菌素筛选及克隆化培养获得稳定抗性克隆转染株后,蛋白质印迹法检测RhoAsiRNA转染后的抑制效应,细胞计数绘制细胞生长曲线以观察RhoA siRNA转染前后细胞株的生长速度;划痕实验和Millicell小室实验检测转染细胞株的迁移力与侵袭力.结果 舌癌细胞转染RhoA siRNA后:RhoA蛋白表达下降;细胞倍增时间从38.0 h延长至45.7 h;细胞克隆形成率由35.2%降低至15.8%;细胞迁移能力减弱;细胞侵袭能力由100%降至58.9%,显著减弱.结论 RhoA siRNA能有效抑制舌癌Tca8113细胞中RhoA的表达,从而降低细胞增殖水平以及细胞侵袭力和迁移力,表明RhoA siRNA具有抑制舌癌细胞生物学特性的能力,提示RhoA在舌癌转移中可能发挥重要作用.     

沙门菌介导骨桥蛋白siRNA对Tca 8113细胞体外生长的影响

目的:研究应用减毒沙门菌感染性转基因骨桥蛋白siRNA(OPNsiRNA)抑制Tca 8113细胞生长和转移的可行性和作用。方法:人工合成OPNsiRNA,同时,合成无义ControlsiRNA作为对照,进行以下平行试验;合成siRNA,分别构建表达载体pIRES2-EGFP,转染减毒沙门菌SL7207,获得的重组菌SL-OPNsiRNA和SL-ControlsiRNA分别体外感染Tca 8113细胞,观察细胞感染率及对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响,同时以Western印迹检测转基因OPNsiRNA对细胞内源性OPN、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)蛋白表达的影响。采用SPSS15.0软件包进行组间t检验。结果:重组减毒沙门菌感染Tca 8113的效率可达80.0%以上,两者之间无显著差异(P>0.05);OPNsiRNA可显著抑制Tca 8113细胞的生长和诱导凋亡;感染后24h,细胞OPNsiRNA和Control-siRNA的迁移指数分别为0.56±0.10和0.82±0.05,侵袭力指数分别为0.53±0.13和0.83±0.06,2组之间均存在显著差异(n=12,P<0.01);同时,OPNsiRNA感染可显著降低细胞内OPN、MMP-2和uPA蛋白的表达量。结论:携带OPN-siRNA的减毒沙门菌可有效通过细菌感染方式,转入舌癌细胞,发挥抗肿瘤生长和转移的作用。     

缺氧条件下缺氧诱导因子-1α对人舌鳞癌细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨缺氧条件下缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法采用RT—PCR技术半定量检测人Tca8113细胞常氧和缺氧培养0．5、1、3、6、12和24h HIF-1α、VEGF基因的表达。结果缺氧条件下HIF—1α基因的表达呈先升后降的趋势，在缺氧6、12h表达显著高于常氧组（P〈0．05）；VEGF的表达在缺氧培养0．5、1、3、12及24h均高于常氧组（P〈0．05）；VEGF基因的表达在缺氧初始阶段随HIF—1α基因表达的增强而升高，但Spearman相关分析显示两者在缺氧24h内相关性不明显（rs=0．5750，P〉0．05）。结论缺氧条件下Tca8113细胞中VEGF的高表达受HIF—1α的调控和影响，是多种因素作用的结果。     

肿瘤相关成纤维细胞通过分泌SDF-1α促进舌鳞癌细胞迁移及侵袭

目的：检测舌鳞癌组织中肿瘤相关成纤维细胞在舌癌迁移及侵袭过程中的作用。方法：体外原代培养舌鳞癌组织肿瘤相关成纤维细胞,收集其培养上清作用于舌鳞癌细胞系Tca8113,检测肿瘤细胞迁移及侵袭。利用实时定量PCR检测其的SDF—1αmRNA表达水平。利用SDF-1α受体CXCR4特异性阻断剂探SDF-1α在此过程的作用。结果：肿瘤相关成纤维细胞可明显促进Tca8113的迁移及侵袭。同时,利用实时定量PCR检测发现肿瘤相关成纤维细胞较正常人皮肤来源成纤维细胞SDF-1α表达水平明显升高。AMD3100,SDF-1α受体CXCR4特异性阻断剂,可显著抑制肿瘤相关成纤维细胞条件培养基对Tca8113迁移能力的促进作用。结论：舌鳞癌组织中的肿瘤成纤维细胞可通过分泌SDF-1α促进舌鳞癌细胞的迁移及侵袭,可能在肿瘤发展过程发挥重要作用。     

粘着斑激酶对Tca8113舌鳞癌细胞生物学特性的影响

目的研究粘着斑激酶（FAK）在Tca8113舌鳞癌细胞中的表达及对其生长、粘附、侵袭转移能力的影响。方法采用FAK寡核苷酸转染的方法处理Tca8113舌鳞癌细胞,采用逆转录- 聚合酶链反应（RT- PCR）测定FAKmRNA水平的变化,间接免疫荧光方法检测胞浆FAK蛋白的表达,以Transwell小室和冲刷实验的方法计数细胞,测定细胞的粘附和侵袭能力的变化,MTT法检测细胞的生长抑制情况。结果反义FAK寡核苷酸转染后,Tca8113细胞侵袭、粘附、趋化运动能力均显著降低。转染48 h后,FAKmRNA和蛋白水平明显下降（P<0.05）。结论FAK对Tca8113细胞的增殖、存活、粘附及侵袭具有重要作用。     

微小RNA对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖的影响

目的 探讨微小RNA(microRNA,miRNA)对体外培养的人舌鳞状细胞癌TeaS113细胞增殖的影响.方法 用脂质体把miRNA-31和miRNA-139的类似物或抑制物分别导人人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,分别为实验组,脂质体试剂为对照组,然后用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖情况.结果 对照组吸光度值(A值)在24、48和72 h时分别为(0.125±0.002)、(0.169±0.002)和(0.216 4±0.004);miRNA-31类似物可促进Tca8113细胞增殖,使其A值分别增至(0.136±0.001)(P<0.001)、(0.186±0.004)(P<0.001)和(0.249±0.012)(P<0.01);miRNA-139抑制物也使A值分别增加到(0.148±0.002)(P<0.001)、(0.214±0.002)(P<0.001)和(0.250±0.009)(P<0.01).与此相反,miRNA-31抑制物在48、72 h时抑制Tea8113细胞增殖,其A值分别降至(0.145±0.001)和(0.155±0.011)(P<0.001);mjRNA-139类似物在24、48 h也分别使A值降至(0.135±0.001)和(0.170±0.009)(P<0.001).结论 miRNA-31和miRNA-139在人舌鳞状细胞癌发生过程中起着重要作用,调整其活性有可能成为一种有效治疗口腔癌的新方法.     

加热联合黄体酮对人舌癌耐药细胞株Tca8113/BLM耐药性的影响

目的:研究加热(hyperthermia, HT)联合黄体酮(progresterone, Prog)对人舌癌细胞Tca8113和耐药细胞Tca8113/BLM耐药性的影响.方法:采用MTT法检测加热41 ℃ 1 h后联合Prog对人舌癌亲本细胞Tca8113和耐药细胞Tca8113/BLM化疗药物的敏感性;流式细胞仪(FCM)检测细胞内阿霉素(ADM)浓度聚积以及细胞膜上P-gp和MRP的表达.结果:与黄体酮作用细胞相比,加热41 ℃ 1 h联合2 μmol/L Prog作用细胞后,Tca8113和Tca8113/BLM细胞的IC_50显著下降(P<0.01),且各组之间均有显著差异(P<0.01),ADM浓度聚积在2 种细胞中明显增加(P<0.01),细胞膜上的P-gp 和MPR荧光强度显著下降(P<0.01).结论:加热联合Prog能协同增加细胞内药物浓度的聚积,显著提高细胞对化疗药物BLM的敏感性,其二者协同作用与降低细胞膜上的P-gp和MRP的表达有关.     

核因子-κB/p65 siRNA介导的舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡及相关分子机制

目的：研究下调核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）/p65基因的表达对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡的影响,并探讨Tca8113细胞凋亡可能的分子机制。方法：利用脂质体2000将终浓度为100nmol/L的p65 siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,通过RT-PCR检测0、24、48和72hp65 mRNA的表达,并通过流式细胞术检测转染前后细胞凋亡变化,通过Caspase-Glo○R-3/7,-8和-9检测试剂盒分析caspase-3/9活性,用Western blotting技术检测p65、bcl-2和bax蛋白表达。结果：Tca8113细胞转染p65siRNA后,在48hp65 mRNA的相对表达量为0.181±0.028,显著低于未处理组0.595±0.038和对照siRNA组0.613±0.067（P〈0.05）。流式细胞术结果显示,p65 siRNA能促使Tca8113细胞凋亡,其早期凋亡比率为（23.16±1.72）%,显著高于未处理组和对照siRNA组（P〈0.01）。转染48h后,p65和bcl-2蛋白的相对表达水平明显下调,而促凋亡蛋白bax的表达显著上升,并伴随着caspase-3/9活性的显著上升。结论：NF-κB信号途径中的p65亚基可能在舌鳞状细胞癌凋亡中发挥重要作用,该研究有望为舌鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供理论依据。     

体外RNA干扰RhoA基因对舌癌细胞侵袭的影响

目的 应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113和SCC-4中RhoA基因的表达,探讨RhoA基因表达下调对舌癌细胞侵袭的影响。方法登录Genbank数据库确定人RhoA基因序列,针对RhoA的基因序列设计短链RNA,利用Lipofectamine2000介导法将RhoA-siRNA转染至舌癌Tca8113和SCC-4细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测转染后的舌癌细胞中RhoA mRNA的表达,蛋白质印迹法检测RhoA、半乳糖凝集素-3（galectin-3）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力。结果舌癌细胞转染RhoA-siRNA后,RhoA的基因和蛋白表达下降,galectin-3和MMP-9蛋白表达下降,细胞体外侵袭能力降低。结论RhoA-siRNA可以有效地抑制舌癌Tca8113和SCC-4细胞中RhoA的表达,通过降低galectin-3和MMP-9的表达从而降低细胞的侵袭能力。RhoA在舌癌的侵袭和转移中可能发挥重要的作用。