人端粒酶逆转录酶与热休克蛋白70融合表达载体的构建及原核表达

目的:构建热休克蛋白70(HSP70)与人端粒酶逆转录酶融合表达载体,在大肠杆菌进行表达.方法:利用PCR方法扩增hTERT基因片段(532aa～637aa),双酶切后插入原核表达载体pET32a的Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ位点之间,形成pET32a-hTERT质粒.通过PCR方法扩增人HSP70全长cDNA.双酶切后插入pET32a-hTERT的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点之间,构建hTERT与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pET32a-hTERT-HSP70.含有该质粒的大肠杆菌BL21经异丙醛-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果:成功的扩增了HSP70基因与hTERT基因片段;测序结果表明成功的构建了pET32a-hTERT-HSP70原核表达载体.含有该质粒的大肠杆菌BL21经诱导后表达约110 kD的蛋白.结论:HSP70与人端粒酶逆转录酶融合表达质粒构建成功,并成功获得了融合蛋白hTERT-HSP70.     

热休克蛋白70在肝细胞癌中的表达意义

肝细胞癌(HCC)起病隐匿,致死率高,提高HCC早期诊断率对延长患者生存期非常重要.热休克蛋白70(HSP70)是广泛存在于生物体内的一种多肽蛋白,具有多种重要的生物学功能,近年来,随着对HSP70的研究,发现HCC组织中存在不同程度的HSP70表达,且其表达水平与HCC的治疗和转归也有着密切关联,利用HSP70的生物学功能及在不同组织中差异性表达的特性,能否为HCC的早期诊断、鉴别诊断、治疗及转归等方面提供帮助已成为研究热点.     

NY-ESO-1和热休克蛋白70融合基因的构建和原核表达

目的 构建热休克蛋白(HSP)70和肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1融合基因,并在大肠杆菌中诱导表达. 方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株HepG2扩增HSP70基因,测序后插入pGEX-ESO1质粒中,构建NY-ESO-1与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-ESO1-HSP70,IPTG诱导含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)表达目的蛋白,Western blot 鉴定蛋白的特异性. 结果 扩增得到长度为1 917 bp的人HSP70全长基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致;获得pGEX-ESO1-HSP70融合基因原核表达质粒,经IPTG诱导,在BL21(DE3)中表达分子量约106 kD的融合蛋白(包括GST 26 kD,NY-ESO1 10 kD,HSP70 70 kD),Western blot检测该蛋白可与HSP70特异性结合. 结论 成功构建pGEX-ESO1-HSP70重组表达质粒,并获得高效表达的ESO1-HSP70融合蛋白,为HSP70-多肽疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础.     

人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.     

结核杆菌热休克蛋白70刺激表位在融合基因疫苗中的佐剂作用

目的：探讨结核杆菌热休克蛋白70（mtHSP70）的刺激表位在肝细胞癌相关抗原661（HCA661）融合基因疫苗pCI-HCA661-mtHSP70中的佐剂作用,为提高基因疫苗的免疫效果提供依据。方法：18只BALB/c小鼠随机分为pCI-neo组、pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组,每组6只,分别肌肉注射100μg空质粒pCI-neo、重组质粒pCI-HCA661-mtHSP70C和pCI-HCA661-mtHSP70E,流式细胞术分析小鼠脾T细胞亚群变化;ELISA法检测体外培养脾细胞上清中干扰素γ(IFNγ)的含量及免疫小鼠血清中HCA661特异性抗体的滴度;体外特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤试验观察融合基因疫苗对肿瘤细胞的抑制作用。 结果：pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+T淋巴细胞的百分比和CD4+/CD8+比值与pCI-neo组比较差异有统计学意义（P<0.05）;pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+百分比和CD4+/CD8+比值均高于pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组,差异有统计学意义（P<0.05）;在抗原肽刺激下,pCI-HCA661-HSP70E免疫组小鼠脾细胞培养上清中IFNγ含量较pCI-mtHCA661-HSP70C免疫组明显提高（P<0.05）;pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组IFNγ含量均高于pCI-neo组(P<0.05)。pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组诱导的HCA661特异性抗体水平较pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组显著增高（P<0.05）;pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组可以产生更强的CTL抗肿瘤效应。结论：mtHSP70刺激表位可以诱导机体对HCA661融合基因疫苗的特异性免疫应答,发挥更强的佐剂作用。     

热休克蛋白70和热休克蛋白27在宫颈鳞癌中的表达及其意义

目的探讨热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白27(HSP27)在宫颈鳞癌中的表达及其相关性。方法应用免疫组织化学方法检测HSP70、HSP27在60例宫颈鳞癌,18例宫颈上皮内瘤变(C IN),7例正常宫颈组织中的表达。结果宫颈鳞癌组织中HSP70,HSP27阳性表达率与正常宫颈组织相比差异有统计学意义(P<0.05);宫颈鳞癌中HSP70的阳性表达与病理分级、临床分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05),HSP27的阳性表达与病理分级密切相关(P<0.05);HSP70与HSP27在宫颈鳞癌中的表达无相关关系(P>0.05)。结论HSP70、HSP27均在宫颈鳞癌发生和发展中起重要作用,HSP70可能作为判断宫颈癌预后的重要指标。     

热休克蛋白70与肝细胞肝癌的研究进展

热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一组广泛存在于微生物和动、植物体内的生物进化中高度保守的多肽蛋白.它主要作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、积聚、装配、运输和降解,在细胞的生长发育、代谢分化、基因转录、维持组织细胞的自稳和环境适应性方面有很重要的作用.     

热休克蛋白70反义寡核苷酸对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨热休克蛋白70反义寡核苷酸(HSP70 ASODN)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能机制.方法 合成特异性靶向HSP70 ASODN,并将其转染SMMC-7721细胞;四甲基噻唑蓝(MTT)法检测HSP70 ASODN对SMMC-7721细胞增殖的影响,计算生长抑制率;荧光显微镜观察细胞凋亡形态;流式细胞仪分析细胞周期分布,计算细胞增殖指数;免疫细胞化学观察细胞内HSP70、Bcl-2、Bax的表达.结果 ASODN组细胞生长抑制率明显高于正义寡核苷酸(NSODN)组、转染试剂对照组及空白对照组(P＜0.05);形态学观察到典型瘤细胞凋亡特征;流式细胞仪分析证实HSP70 ASODN主要阻止瘤细胞进入S期,细胞增殖指数下降,出现明显的凋亡峰;免疫细胞化学显示可降低细胞内HSP70、Bcl-2水平(P＜0.05),提升Bax水平(P＜0.05).结论 HSP70 ASODN可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,可能机制为中和了HSP70和细胞周期调节蛋白间的相互作用,导致细胞周期阻滞,打破了肿瘤细胞逃逸凋亡平衡,促使细胞发生凋亡.     

热休克蛋白70与肿瘤免疫

近年热休克蛋白70(HSP70)在免疫中的作用日益受到重视。HSP70在肿瘤免疫中充当了多重角色,一方面作为“分子伴侣”参与肿瘤细胞的功能代谢,保护肿瘤细胞免受有害因素的损害;另一方面肿瘤细胞与机体正常细胞生长、代谢、分化的异质性,使HSP70成为与其相结合的肿瘤抗原多肽的靶载体,在参与肿瘤抗原的免疫反应中充当了举足轻重的角色。     

热休克蛋白70与脑缺血

随着分子生物学研究手段的应用 ,人们已逐渐认识到在脑中存在着完善的适应机制 ,通过迅速诱导基因表达和蛋白质合成来阻止导致脑细胞死亡的病理生理变化。众多的研究表明脑缺血可诱导许多基因的表达 ,其中大多数参与脑的自我修复 [1 ]。热休克蛋白 (HSP)是机体在遭受各种应激刺激后诱导产生的一种应激蛋白 ,对细胞具有保护作用 ,与缺血型脑损伤等多种神经系统疾患关系密切。其中热休克蛋白 70(heat shock protein70 ,HSP70 )作为脑缺血所诱导的一种神经元保护性物质可阻止蛋白质在压力下发生聚集或错误折叠而日益受到医学界的广泛关注 ,…     

人HSC70基因真核表达载体的构建和表达

目的构建HSC70（HSC）真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法采用RT—RCR方法从正常人肝细胞系QZE中得到HSC70的cDNA序列，然后克隆入pcDNA^TM3．1／V5-His^A载体，构建重组质粒pcDNA-HSC70；经酶切和测序鉴定后，将pcDNA-HSC70体外转染HepG2细胞系，瞬时表达带有His标签的HSC70融合蛋白；并通过免疫细胞化学方法检测蛋白表达情况。结果RT—PCR扩增到1960bp的HSC70 cDNA片断，经测序分析与GenBank中已知序列一致；重组质粒pcDNA—HSC70转染后的HepG2细胞中，可检测到瞬时表达的HSC70-His融合蛋白。结论成功构建重组质粒pcDNA—HSC70，并可以在真核细胞HepG2中瞬时表达。     

人结核分支杆菌HSP70的原核表达质粒的构建及诱导表达

目的　构建编码人结核分支杆菌 (TB)热休克蛋白 70 (HSP70 )的Dnak基因的重组原核表达质粒 ,并研究其表达动力学。方法　质粒pMT70用限制性内切酶消化、核酸体外扩增 (PCR)及末端修饰后可获得Dnak基因全长 ,与大肠杆菌质粒 pRSET连接重组 ,阳性克隆经酶切分析鉴定后即为质粒 pMT70 3,转入受体菌BL2 1DE3中 ,经诱导剂异丙基硫代 - β -D-半乳糖 (IPTG)诱导 ,由SDS -PAGE、Western -blot鉴定 ,并以薄层扫描分析。结果　重组表达质粒 pMT70 3构建成功 ,可在大肠杆菌中高效表达 ,诱导后 1h即开始表达 ,16h达高峰期。表达量占菌体总蛋白的 6 5 % ,可溶性产物占总表达量的 90 %。结论　pMT70 3质粒不仅构建成功且更有利于对分支杆菌HSP70蛋白的纯化 ,方便对其抗结核、抗肿瘤的研究     

分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定

目的 用结核分枝杆菌热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)启动子改建分枝杆菌穿梭质粒pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70,并对其功能进行鉴定.方法 以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSP70启动子,克隆至pMD18-T载体,经鉴定后,再定向克隆入pJEM11的Apa Ⅰ位点与SnaB Ⅰ位点之间,构建pJHSP70载体,并对载体进行PCR及酶切鉴定,然后再将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)尿素酶B亚单位(urease B subunit,UreB)基因克隆入pJHSP70载体,评价其在耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M. smegmatis)mc2 155中的表达情况.结果 从BCG基因组中扩增出160 bp的基因片段,所构建的穿梭质粒经酶切和PCR鉴定与预期结果一致.测序结果证实插入片段正确,UreB基因在M. smegmatis中成功表达.结论 成功改建穿梭质粒pJEM11为穿梭表达质粒pJHSP70.     

汉坦病毒诱导非洲绿猴肾上皮细胞热休克蛋白70的表达规律及意义

目的 :旨在研究汉坦病毒 (Hantavirus,HTV)感染非洲绿猴肾上皮 (Vero E6 )细胞后应激反应的规律及意义。　方法 :采用免疫细胞化学染色法、免疫荧光激光共聚焦及RT PCR方法观察热体克蛋白 (HSP) 70的表达规律。　结果 :HTV感染Vero E6细胞后 ,免疫细胞化学染色法可检出HSP 70阳性信号。感染后不同时间点 ,免疫荧光激光共聚焦显微镜及RT PCR观察结果表明 ,HSP 70及HSP 70mRNA的水平在感染后迅速升高 ,并持续高表达 (P <0 .0 5 )。　结论 :HTV可诱导Vero E6细胞HSP 70高表达 ;HSP 70可能具有抑制病毒复制和保护细胞的作用     

重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk的构建及在细胞内的热诱导表达

目的:构建用于靶向基因治疗的重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk(pHT),体外转染SMMC-7721肝癌细胞,观察热诱导基因表达情况. 方法:设计1对引物,以pHSV-106质粒为模板进行PCR扩增,将扩增产物纯化所得目的基因片段与pD3SX载体连接,转化大肠杆菌E.coli DH5α,克隆PCR法筛选菌落,测序鉴定后大量抽提质粒.磁性转染法将pHT导入SMMC-7721,加热处理后,用RT-PCR法检测tk基因的整合. 结果:获得重组的hsv-tk基因条带. 结论:成功构建了pHT质粒,可用于进行靶向性基因治疗研究.     

人颊癌BCaCD885细胞加热后细胞膜HSP70的动力学变化与热耐受性的关系

目的探讨肿瘤细胞热耐受性与细胞膜热休克蛋白表达的关系。方法采用流式细胞仪检测了人颊癌BCaCD885细胞经43．5℃加热40min后2，4，6，8，12，24，48及72h细胞膜热休克蛋白70的表达动力学，并与相隔不同时间接受2次43．5℃，40min加热的BCaCD885细胞产生的热耐受性情况进行比较。结果加热后直至6h时细胞膜热休克蛋白70的表达才有较明显的升高，约在12h时达到高峰，尔后开始下降，到72h时基本恢复到对照组的水平。细胞膜热休克蛋白70表达水平和细胞热耐受性的消长有一定的相关性，相关系数为0．840。结论热休克蛋白70在细胞热耐受性形成过程中具有较重要的作用，结果可为肿瘤临床热疗和免疫治疗提供参考。     

热休克蛋白70-Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D DNA疫苗的构建及表达

目的：针对Ⅱ型单纯疱疹病毒（HSV-2）包膜糖蛋白D（gD）,以热休克蛋白70（Hsp70）为载体,构建pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗。方法：将Hsp70和HSV-2gD蛋白的基因分别克隆至真核表达载体pVAX,构建成重组质粒pVAX-Hsp70-gD并测序鉴定。重组质粒pVAX-Hsp70-gD转染COS-7细胞,用免疫组化、SDS-PAGE和West-ern blotting方法鉴定重组质粒的表达情况。结果：测序证实重组质粒序列正确,表达产物的SDS-PAGE分析发现,在相对分子量为92 000处有外源蛋白表达,与预期蛋白带一致。免疫组化方法和Western blotting也证明,构建的重组质粒能在COS-7细胞内表达。pVAX-Hsp70-HSV2gD组核酸疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞培养上清中γ-干扰素的水平高于其他组（P〈0.05）。结论：成功构建了pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗,为其进一步的研究打下了基础。     

不同切肝量对大鼠肝脏HSP 70表达的影响

目的探讨大鼠肝脏HSP70在评价手术创伤程度中的意义。方法建立不同肝切量的大鼠创伤模型,160只健康雄性SD大鼠随机分成正常对照组及轻度、中度、重度创伤组,采用western blotting方法,动态观察各创伤组术后2、8、12、24、48 h肝组织中HSP70的表达情况。结果各创伤组伤后HSP70的表达迅速增加,8 h达到峰值后逐渐下降,48 h降至正常水平,随着肝切量的增多这种变化更加明显。结论手术创伤后肝组织HSP70表达升高,于8 h达到峰值,提示HSP70可能是创伤后早期参与肝细胞损伤机制启动的一个重要因素。随着肝切量的增加,HSP70的表达增高,提示HSP70的表达可作为判断肝脏手术创伤程度的一个指标。     

热休克蛋白70在合并C型人格特征抑郁的乙肝相关性肝癌患者中的表达及临床意义

目的 探讨热休克蛋白70(HSP70)在合并C型人格特征抑郁HBV相关性肝癌患者中的表达情况及其临床意义.方法 选择60例行肝切除术的HBV相关性肝癌患者分为A组(C型人格特征抑郁)及B组(无C型人格特征抑郁),每组各30例.检测HSP70在患者肿瘤组织及血液中的表达,并比较两组患者肿瘤的复发情况及无病生存率,同时分析影响C型人格特征抑郁HBV相关性HCC患者预后的因素.结果 A组患者肿瘤组织HSP70 mRNA及蛋白的表达均高于B组(P<0.05);A组患者6个月、12个月及18个月无病生存率低于B组(P<0.05);HSP70 mRNA>3.726是C型人格特征抑郁HBV相关性肝癌患者无病生存期的影响因素(P<0.05).结论 具有C型人格特征抑郁的HBV相关性肝癌患者肝切除术后的预后较差,可能与HSP70高表达有关;HSP70可能可作为预测肝癌患者术后早期复发的生物学标志物.