幽门螺杆菌Mr 26 000外膜蛋白编码基因的克隆及表达

目的　构建含幽门螺杆菌 (Hp)Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因的重组载体 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法　用PCR从Hp染色体中 ,扩增Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经BamHI、HindⅢ双酶切、纯化、连接后 ,构建含有目的基因的重组载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL2 1(DE30 )并表达。表达产物经纯化后 ,用ELISA法检测其抗原性。结果　经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为HpMr 2 6 0 0 0的外膜蛋白编码基因 ,与Tomb等的报道相比较 ,有 1.1%的bp发生变异 ,1.5 1%的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr为 4 6× 10 3 ,可溶性表达产物占细菌总蛋白的 38.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。ELISA法检测显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别 ,具有良好的抗原性。结论成功地克隆并表达Mr为 2 6 0 0 0的Hp外膜蛋白编码基因 ,为Hp蛋白疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究打下了基础     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a( )中,构建重组质粒pET28a( )-CIDE-3。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长为516bp的人CIDE-3基因片段。以构建的重组质粒pET28a( )-CIDE-3转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为23000的重组CIDE-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,表达量约占全菌蛋白的32%。结论:成功地构建了原核表达载体pET28a( )-CIDE-3,并表达出重组CIDE-3蛋白,为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础。     

HIV-1 nef基因的克隆及原核表达研究

目的:构建HIV-1 Nef基因的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达,初步优化其表达条件。方法:利用特异性引物PCR扩增获得HIV-1 Nef基因片段,PCR产物经限制性内切酶双酶切后连接载体pET24a(+),构建重组质粒pET24a(+)-Nef。经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coliBL21,IPTG诱导表达目的蛋白,优化表达条件,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达产物。结果:PCR扩增获得618bpDNA片段,酶切鉴定结果表明HIV Nef基因已克隆入原核表达载体pET24a(+)中,测序证明序列正确。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组菌诱导后可表达相对分子质量(Mr)符合预期的融合蛋白。0.1mmol/LIPTG在37℃诱导6h为最佳表达条件,重组蛋白表达量可由15.8%增加到43.9%。结论:在大肠杆菌中成功地表达了HIV Nef蛋白,并初步获得了最优化的表达条件。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

可溶性DC-SIGN的表达、纯化及其生物学活性分析

目的　在大肠杆菌中表达并纯化DC SIGN融合蛋白并对该融合蛋白的抗原特异性和生物学活性进行分析。方法　以重组质粒pcDNA3 .1 DC SIGN为模板 ,进行PCR扩增出带KpnⅠ和SacⅠ酶切位点的人DC SIGN凝集素cDNA ,经相应酶切后插入原核表达载体pET 3 2a( ) ,转化大肠杆菌AD494(DE3 ) ,经IPTG诱导表达DC SIGN融合蛋白 ,用Ni2 NTA树脂对融合蛋白进行纯化 ,以Westernblot试验进行鉴定 ,通过HIV与DC SIGN的亲和实验研究融合蛋白的生物学活性。结果　酶切鉴定证实DC SIGN凝集素基因已插入原核表达载体pET 3 2a( )。重组表达质粒pET 3 2a( ) DL在大肠杆菌AD494(DE3 )中成功表达了DC SIGN融合蛋白 ,其相对分子质量 (Mr)约为 3 5× 10 3。Ni2 NTA树脂纯化后 ,融合蛋白的纯度可达 90 %以上。Westernblot试验显示DC SIGN融合蛋白与鼠抗人DC SIGN抗体有特异性免疫反应。结论　在大肠杆菌中表达DC SIGN融合蛋白 ,用亲和层析的方法对其进行初步纯化 ;HIV与DC SIGN的亲和实验表明 ,可溶性DC SIGN融合蛋白能抑制R5和X4HIV与DC SIGN受体结合     

幽门螺杆菌Mr 26 000外膜蛋白编码基因在DH5α中的表达

目的构建含幽门螺杆菌(H.pylori)Mr 26 000外膜蛋白编码基因的重组载体并在E. coli DH5α(PREP4)中表达.方法用PCR从H.pylori染色体中,扩增Mr 26 000外膜蛋白编码基因片段.将目的基因与pQE30同时经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切、纯化、连接后,转化含有目的基因的重组载体.以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌DH5α并表达.表达产物经纯化后,用ELISA法检测其抗原性.结果插入的基因片段为H.pylori Mr 26 000的外膜蛋白编码基因与Tomb等报道相比较,有1.1%的碱基发生变异, 1.5 1%的氨基酸残基改变;目的基因经表达其蛋白Mr为26×103 ,可溶性表达产物占全菌总蛋白的20%以上;目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,且该目的蛋白可被H.pylori阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并表达了H.pylo ri Mr 26 000的外膜蛋白编码基因,为H.pylori蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究打下了基础.     

粉尘螨Ⅰ类抗原cDNA的克隆表达和初步鉴定

目的　构建粉尘螨Ⅰ类抗原 (Derf1)cDNA基因的重组表达质粒 ,并于E .coli表达。方法　用BamHⅠ和SacⅠ从重组质粒pMD 18T Derf 1上切下Derf1基因 ,插入表达载体pET32a( )质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1,在氨苄青霉素阳性的LB平板上筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET32a( ) Derf 1转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS PAGE电泳和薄层凝胶扫描定量分析。结果　对重组质粒进行酶切和PCR鉴定 ,与预期结果相符 ,证明已成功构建携带Derf1基因的重组原核表达质粒pET32a( ) Derf 1。核酸序列测定及同源性分析证实所构建的原核表达质粒pET32a( ) Derf1中所含的Derf1基因与GenBank中的Derf1序列同源性达到 99.5 %。Derf 1基因在大肠杆菌诱导表达后获得Mr 约4 5 0 0 0的蛋白 ,蛋白含量占全菌体蛋白含量的 15 %。结论　成功构建了粉尘螨Ⅰ类抗原cDNA基因的重组表达质粒pET32a( ) Derf 1,并在大肠杆菌中获得高效表达 ,为获得重组纯化Derf 1变应原并用于尘螨变应性疾病的诊治奠定基础     

人幽门螺杆菌外膜蛋白18000 DNA疫苗的构建及表达

目的：构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H-pylori)18000外膜蛋白编码基因的真核重组载体，并在COS-7细胞中表达，为核酸疫苗的开发奠定基础。方法：从原核表达质粒pET32a( )／528中，酶切H-pylori 18000外膜蛋白编码基因片段，将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pcDNA3．1进行连接，而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，以RT-PCR，Western法检测其表达产物。结果：经单、双酶切证实插入的基因片段为H-pylori 18000外膜蛋白编码基因；采用RT-PCR方法，能够从转染的COS-7细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段，Western法等检测显示，该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白，而且具有生物活性。结论：成功地构建了核酸疫苗pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，为H-pylori核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。     

核心链霉亲和素基因的克隆及表达

文章采用PCR方法 ,以链霉亲和素菌 (Streptmycesavidinii)基因组DNA为模板 ,克隆出 384bp的DNA片段并以BamHI及XhoI位点装入PSK载体 ,经测序确证为核心链霉亲和素基因 (core strepavidin )。将该基因重组到质粒pET 2 4a ( + ) ,构建重组表达质粒pET 2 4a CS。转化大肠杆菌BL2 1,经IPTG诱导后得到高效表达。SDS PAGE图谱显示表达产物相对分子质量为15 0 0 0 ,与其基因编码蛋白的理论值相符。HRP标记的生物素作为抗体进行Westernblot,结果在 15 0 0 0处可见特异性条带 ,因此表明核心链霉亲和素能与生物素特异性结合     

人类核糖核酸酶9基因的克隆及表达载体的构建

目的: 构建人类核糖核酸酶9 (human ribonuclease 9,hRNase 9) 的重组表达载体方法: 从成年人附睾组织提取了总RNA,通过RT-PCR扩增了hRNase 9编码成熟肽的基因片段,将其克隆入载体pET25b(+)的Nde I和EcoR I位点之间,构建了重组表达载体pET25b (+)-hRNase 9,并通过PCR法、限制性内切酶消化法和DNA序列测定加以证实,以IPTG 诱导重组载体转化宿主菌E.coli BL21(DE3)表达重组hRNase 9蛋白结果: 重组载体pET25b (+)-hRNase 9构建成功,SDS-PAGE显示重组载体转化宿主菌E.coli BL21(DE3)表达了Mr约为21 000的重组hRNase 9 蛋白结论: 成功的扩增了hRNase 9编码成熟肽的基因片段,构建了重组表达载体pET25b (+)-hRNase 9,为下一步研究奠定了基础     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32,分析该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达情况。方法超声粉碎日本血吸虫成虫提取总RNA,通过RT—PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法（geneSOEing）剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST—Sj32融合基因,克隆至原核表达载体pET32α（＋）,构建重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,转化人大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β—D．半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS—PAGE和Westem—blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1991bp的Sj26GST—Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST—Sj32融合基因成功插入pET32α（＋）中,SDS—PAGE分析显示表达产物为分子质量约82000Mr的重组蛋白．与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的22％：Western—blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原一件     

幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建

目的 构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）和尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的重组蛋的白质的侯选菌株。方法 用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌的染色休ＤＮＡ上分别扩增出ＨｓｐＡ和ＵｒｅＢ基因片段,将它们融合插入原核表达载体ｐＥＴ－２３ｂ（＋）中,并在ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌表达。结果 经测序,ＨｓｐＡ－ＵｒｅＢ（ＨＵ）事例基因片段由２０６１ｂｐ组成,为编码６８７个氨基酸残基的多肽。ＳＤＳ－     

尿激酶型纤溶酶原激活因子cDNA的克隆与原核表达

目的构建尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21中表达,为进一步研究uPA奠定基础。方法应用逆转录RT—PCR,从人肝细胞cDNA中扩增人尿激酶型纤溶酶原激活因子基因序列,与原核表达质粒pET32a重组,获得表达质粒uPA—pET32a。用氨苄青霉素平板筛选转化子。双酶切与DNA测序进行鉴定,用IPTG诱导表达,并用Westernblotting进行鉴定。结果从肝细胞cDNA中扩增的uPA基因片段长1296bp,酶切及DNA测序证实uPA-pET32a重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为68900Mr,经Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒uPA—pET32a。并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期的相一致．为进一步的研究奠定了基础。     

尘螨变应原Der f 6 / pET32a( +) 重组质粒构建、表达、纯化及其产物血清 IgE 结合率

目的:获得尘螨变应原第6 组分Der f 6 原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE 结合率。方法:酶切质粒pET28a(+)-Der f 6 获得目的基因Der f 6,将其与pET32a(+)载体连接成质粒pET32a (+)-Der f 6,转化BL21细菌后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni+离子亲和层析柱纯化表达产物,用十二烷基磺酸钠鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹实验(Western blot)和蛋白质串联质谱(MALDI-TOF/ TOF)鉴定纯化产物。以纯化获得的产物为包被抗原建立间接ELISA 法检测尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体反应情况。结果:成功构建了原核表达质粒pET32a (+)-Der f6,将该质粒转化E.coli BL21 诱导表达,亲和层析纯化后,SDS-PAGE 显示获得目的蛋白,Western blot 验证其能够与载体的组氨酸标签结合,质谱鉴定其Der f 6 结构一致。以此产物为包被抗原建立间接ELISA 检测尘螨过敏性哮喘患儿血清,阳性率为41.3% (19/46)。结论:成功构建了原核表达质粒pET32a (+)-Der f 6,亲和纯化获得的目的蛋白具有良好的反应原性。     

人Ⅱ型免疫缺陷病毒gag基因在大肠杆菌中的表达

目的：表达ＨＩＶ－２基因工程ｇａｇ抗原。方法：将编码ＨＩＶ－２型ｇａｇ的部分和全部ｐ５５ｇａｇ１／２基因,克隆到载体ｐＥＴ－１７ｂ后,分别在Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＩ２１中表达。结果;表达产物为５１和６１ｋＤ融合蛋白,并可与ＨＩＶ－２病人血清发生特异性反应。     

HIV-1 Tat基因的融合构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：在E．coli BL21(DE3)中高效表达Tat蛋白。方法：用PCR方法构建HIV-1 Tat基因全序列，同时将Tat基因进行定点突变(AAG28替换为CAG，AAG50替换为CAG)，以消除天然．Tat蛋白的转录活性。将突变的Tat基因与伴侣10(chap10)基因连接后，共同亚克隆人表达载体pET28a中，并在Ecoli中表达，表达产物用Western blot进行鉴定。结果：分别通过3轮PCR，成功地构建了Tat基因全序列。构建的重组质粒pET28a-chap10-Tat在Ecoli BL21(DE3)中得到高效表达。Western blot分析表明，在相对分子质量(Mr)为24000处有1条特异性的带。结论：chap10基因与HIV-1 Tat全基因的融合构建，使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，为其在爱滋病发病中作用研究奠定了基础。     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。     

小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达

目的: 构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达.方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA, 经RT-PCR扩增B7-DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a( )中, 构建重组表达质粒pET32a( )-B7-DCECD.重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的B7-DC胞外段蛋白.结论: 成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础.     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1的可溶性表达、纯化及活性鉴定

目的克隆、表达和鉴定肠道病毒71型（EV71）VP1基因,得到可溶性的蛋白VP1,为制备EV71的抗体和诊断试剂的开发打下基础。方法优化EV71VP1蛋白基因,克隆并构建重组表达质粒pET15b/VP1,转化大肠杆菌BL21。使用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Westernblotting检测目的蛋白。以重组蛋白VP1为抗原,ELISA检测抗原活性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量为36000,与预计大小一致。ELISA实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了EV71VP1蛋白,并得到可溶性的蛋白,对肠道病毒71型诊断试剂的开发有进一步潜在的应用价值。