硫唑嘌呤治疗系统性红斑狼疮的不良反应与硫嘌呤甲基转移酶活性的关系

 【目的】探讨硫唑嘌呤(AZA)在系统性红斑狼疮（SLE）维持治疗中的不良反应（ARD）以及与硫嘌呤甲基转移酶（TPMT）活性的关系。【方法】分析AZA在250例SLE患者维持治疗中的ARD发生特点,并应用高效液相色谱法（HPLC) 测定这部分患者红细胞TPMT 活性,分析TPMT活性与AZA所致不良反应的关系。【结果】最常见的ARD是血液系统损害（21例,8.4%）,其次为胃肠道反应（19例,7.6%）,肝功能异常（8例,3.2%）、脱发(5例,2.0%),急性胰腺炎1例。血液系统损害主要表现为白细胞减少（20例,8.0%）,血小板减少（9例,3.6%）。所有患者的TPMT活性（按RBC,U/mL）均值为12.4±7.1（1.7-30.0）,呈正偏态连续分布。出现血液系统损害、脱发的患者TPMT活性明显低于未发生的患者（P<0.001）。而有无肝功能异常和胃肠道反应的2组患者之间的TPMT活性无差异(P>0.05)。在使用小剂量AZA（50 mg/d）时出现血液系统损害的患者TPMT活性均值低于使用常规剂量（100-150 mg/d）者（分别为3.4±1.5和7.3±2.6,P<0.001）。【结论】AZA在SLE的维持治疗中最主要的ARD是血液系统损害。血液系统损害主要与TPMT活性低有关,且酶活性低的患者在使用小剂量AZA时即可能出现血液系统损害。通过用药前检测TPMT活性,可以指导临床医生用药,提高治疗的安全性。     

汉族炎症性肠病患者硫嘌呤甲基转移酶多态性与硫唑嘌呤药物毒副作用及疗效的相关性研究

研究目的：探讨汉族炎症性肠病（IBD）患者硫嘌呤甲基转移酶（TPMT）基因多态性及活性与硫唑嘌呤药物毒副作用及疗效的关系,从而提高用药安全性,建立个体化治疗方案。研究方法：对52例接受硫唑嘌呤(AZA)维持治疗的IBD患者监测骨髓抑制及肝脏毒性的发生情况,并运用引物特异性PCR及PCR-RFLP方法进行TPMT*2,*3A,*3B,*3C四种突变等位基因检测。进一步采用反相高效液相色谱法（HPLC）,对其中13例患者进行红细胞内TPMT活性检测,初步探讨汉族IBD患者TPMT基因多态性及活性与AZA药物毒副作用及疗效的关系。研究结果：在对52例接受AZA治疗的IBD患者的随访中,观察到有5例患者发生了骨髓抑制,1例发生了肝脏毒性。而基因多态性检测发现该6例患者均不存在TPMT*2,*3A,*3B,*3C这4种常见的TPMT突变等位基因。在TPMT 活性的研究中发现,发生早期骨髓抑制的3例患者TPMT平均活性低于没有发生骨髓抑制的患者（9.3±2.1 U/ml pRBC vs 18.0±6.2 U/ml pRBC;p=0.046）,并且低于早期未发生骨髓抑制的患者组（9.3±2.1 U/ml pRBC vs 17.7±5.5 U/ml pRBC;p=0.029）。发生肝脏毒性的患者1例,TPMT活性为28.8 U/ml pRBC,明显高于没有发生肝脏毒性的患者（14.7±4.8U/ml pRBC）。AZA治疗中维持缓解的IBD患者TPMT活性显著低于没有诱导缓解的患者（13.7±3.5 U/ml pRBC vs 22.0±5.5 U/ml pRBC;p=0.009）。结论： TPMT基因多态性检测并不能很好地解释AZA药物毒副作用;而初步研究发现TPMT活性能较好的预测早期药物毒副作用的发生及治疗疗效。     

HPLC法测定人血红细胞巯基嘌呤甲基转移酶的活性

目的建立测定人血红细胞中巯基嘌呤甲基转移酶(thiopurine methyltransferase,TPMT)活性的HPLC方法.方法以6-硫鸟嘌呤(6-TG)为底物,S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体,TPMT催化6-TG生成甲基化产物6-甲基硫鸟嘌呤,100 ℃加热终止反应并沉淀蛋白后,加60%高氯酸再次沉淀蛋白,离心后进样20 μL检测.色谱柱Shim-pack CLC-ODS (6 mm×150 mm,5 μm);流动相甲醇-水-三乙胺(24760.4),磷酸调pH至4.8;流速1.0 mL/min;检测波长313 nm.结果该方法在100～1 700 μg/mL浓度范围内线性良好,r=0.999 7;高、中、低浓度样本的日内、日间RSD为2.28%～6.48%;回收率为100.56%～118.71%(n=5).结论所建立的方法稳定可靠、精密度好,适合临床大规模推广应用.     

FMU100抗体的超高效液相色谱法定量检测方法的建立

目的 建立UPLC-protein A定量检测FMU100单克隆抗体的方法.方法 使用Waters UPLC超高效液相色谱仪,Applied Biosystem的PA ImmunoDetection Sensor Cartridge(2.1×30 mm,20μm)色谱柱,柱温30℃,检测波长280 nm,进样体积10μL,以流动相A(10 mmol/L PBS含0.15 mmol/L NaCl,pH 7.2)-流动相B(0.15 mmol/L NaCl,pH 2.6)进行梯度洗脱,流速0.5 mL/min.结果 在0.034~2.200 mg/mL浓度,线性相关系数r2为0.9999,浓度与峰面积间呈良好的线性关系;检测限为0.01 mg/mL,定量限为0.07 mg/mL;回收率为98.18%~99.16%;重复性RSD为0.1%~1.9%;在8 h内,每个2 h测定发酵液中抗体的含量,FM U100抗体峰面积RSD为1.8%;在流动相A pH变化±0.2、流动相B NaCl比例变化±5%、柱温变化±5℃ 、检测波长变化±5 nm、流速相对值变化±20%时,FM U100抗体峰峰面积RSD为1.7%(n=12);检测方法符合系统适应性要求.     

樟柳碱在Beagle犬血清中的药动学研究

目的建立高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)测定Beagle犬血清中樟柳碱的分析方法。方法采用沉淀及萃取相结合的方法提取样品,LC-MS分析方法,选择负离子测定模式,测定Beagle犬单剂量iv樟柳碱0.2mg/kg后樟柳碱的血药浓度。结果该方法线性、回收率和重现性良好,批内、批间变异系数均在10%以内,样品提取后24h内稳定,灵敏度可达到1ng/mL,出峰时间为3.1min,Cmax为(145.07±32.63)ng/mL,tmax为(0.04±0.06)h,AUC(0-t)为(361.10±26.01)mg·h/mL,CL为(5.56±0.41)L/h,t1/2为(1.67±0.34)h,Vd为(13.39±3.05)L。结论此方法简便、快速,专属性强,灵敏度高,能够准确测定血中氢溴酸樟柳碱,有实际意义。     

人血浆中头孢克洛高效液相色谱法与微生物法测定

目的:比较高效液相色谱法(HPLC)和微生物法测定头孢克洛血药浓度的差异。方法:10名健康受试者单剂量口服头孢克洛胶囊500mg,分别用HPLC法和微生物法测定血浆中药物浓度。结果:HPLC法线性范围为0.125~16mg·L-1,回收率为(93.34±5.94)%~(96.80±4.38)%,日内、日间相对偏差(RSD)分别为4.17%~6.36%和5.64%~9.09%;微生物法线性范围为0.125~16mg·L-1,回收率为(93.21±5.80)%~(95.62±4.23)%,日内、日间RSD分别为4.17%~6.03%和6.57%~8.70%;2种方法测定的受试者平均血药浓度和主要药动学参数差异无统计学意义。结论:2种方法精密度和回收率基本一致,均可用于头孢克洛血药浓度的测定。     

HPLC-MS/MS法测定血浆中华法林对映异构体浓度

目的 建立高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定人血浆中华法林对映异构体的浓度。方法 以乙酸乙酯为萃取剂,采用MS Chiral? MS-OD(50×2.1 mm, 3 μm)为手性柱,流动相为甲醇∶水∶甲酸=85∶15∶0.05,流速为0.18 mL/min。采用负离子模式,电喷雾离子源（ESI）,以萘普生为内标定量,华法林和内标的检测离子对质荷比分别为（m/z）307.2→160.9和（m/z）228.9→185.1。结果 R-华法林批内精密度,其相对标准偏差(RSD)为3.2%~5.8%,批间RSD为2.5%~5.1%;方法回收率(96.1±5.6)%~(105.4±4.7)%,提取回收率80.7%~84.4%,内标基质效应校准后的基质效应RSD<10%;S-华法林批内精密度RSD为3.7%~5.2%,批间RSD为3.2%~4.8%;方法回收率(98.3±5.1)%~(103.7±3.8)%,提取回收率81.3%~84.6%,内标基质效应校准后的基质效应RSD<10%。最低定量限均为0.1 μg/mL。结论 本文建立的方法准确、灵敏、可靠,可用于人血浆中华法林对映体的拆分和血药浓度的测定。     

同位素示踪微量法测定白血病细胞DNA-甲基转移酶活性

目的:建立3H标记同位素示踪微量分析法用于白血病细胞MTase活性测定,并评价其准确性、敏感性及可靠性;了解急性白血病患者骨髓细胞MTase活性改变的规律。方法:以Poly[d(IC)d(IC)]为甲基受体,3HSAM为甲基供体,测定骨髓单个核细胞和白血病细胞系的MTase活性。以细胞裂解蛋白作用2h所得的每分计数值表示酶活性。每次测定设不加Poly[d(IC)d(IC)]的阴性对照,以HL60细胞MTase活性为100%,所测样本值均和其相比,以相对数表示结果。结果:当细胞裂解蛋白质量在0.25～7.5μg之间时,本法线性良好,Y每分计数=2864X+142(r=0.998,P<0.01)。方法灵敏度为2.4×104Bq,批间变异系数11.4%(n=9),批内变异系数5.9%(n=4)。15例急性白血病MTase活性平均值为(9.1±4.6)%,较11例非恶性血液病对照组[平均(2.1±1.6)%]明显升高。11例缓解期急性白血病MTase活性平均(4.1±2.6)%,和对照组无明显区别。结论:同位素微量分析法测定MTase活性灵敏度高、重复性好。MTase活性增高是急性白血病的高发现象。急性白血病缓解后MTase活性下降。MTase活性测定可能对监测白血病病情变化有一定意义。     

风湿病人群硫唑嘌呤代谢酶基因型与药物耐受性的关系

目的 探讨风湿病患者硫嘌呤甲基转移酶（TPMT）基因型与硫唑嘌呤耐受性的关系。方法采用等位基因特异性的聚合酶链反应（AS-PCR）方法和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测200例风湿病患者4种常见TPMT突变等位基因TPMT^＊2（G238C）、TPMT^＊3A（A719G／G460A）、TPMT^＊3B（G460A）和TPMT^＊3C（A719G）。194例患者使用了硫唑嘌呤（剂量50～150mg／d）,并随访观察3个月。结果在200例风湿病患者中检测到4例TPMT^＊3C杂合子,没有检测到TPMT^＊2、TPMT^＊3B、TPMT^＊3A型突变。基因型频率：野生型基因纯合子为98％,杂合子TPMT^＊1／TPMT^＊3C为2％。风湿病患者突变等位基因频率为1％。4例TPMT^＊3C杂合子TPMT活性平均值为（2．44±1．2）U／ml红细胞,196例野生型基因纯合子TPMT活性平均值为（12．24±6．8）U／ml红细胞。TPMT^＊3C杂合子的酶活性均值显著低于野生型基因纯合子,差异有统计学意义。194例使用硫唑嘌呤的患者中18例出现骨髓抑制,2例为严重造血系统危象,6例合并出现肝功能损害。4例TPMT^＊3C杂合子患者除1例未使用硫唑嘌呤外,其余3例均在用药后1个月内出现骨髓抑制,包括2例严重造血系统危象。结论存在TPMT突变等位基因的患者对硫唑嘌呤不耐受,可能发生严重造血系统危象。在用药前检测TPMT基因型对提高治疗的安全性有重要意义。     

高效液相色谱/质谱/质谱法测定血浆中3种常用药物的浓度

目的:建立测定血浆中卡马西平、苯妥英钠、茶碱浓度的高效液相色谱/质谱/质谱分析方法。方法:①液相色谱流动相为甲醇-0.01 mmol/L乙酸铵水溶液(60∶40),流速0.2 mL/min;色谱柱为SYMMETRY C18(2.1 mm×50 mm,3.5μm),柱温30℃。②质谱电喷雾电离源,采用多反应监测方式进行检测,卡马西平质荷比237→194,苯妥英钠253→182,茶碱181→124。血浆样本经固相萃取小柱萃取处理后进样分析。结果:卡马西平在(1~20)μg/mL浓度范围内线性关系良好,萃取回收率100.9%~107.0%。日内误差(RSD)小于2.0%;苯妥英钠在(2~40)μg/mL浓度范围内线性关系良好,萃取回收率96.5%~102.4%。RSD小于1.9%;茶碱在(2~40)μg/mL浓度范围内线性关系良好,萃取回收率95.8%~106.0%,RSD小于3.0%。结论:本方法具有特异性高,灵敏度好,测定快速等优点。     

HPLC法间接测定肿瘤患者外周血DPD的活性

目的 建立高效液相色谱法(HPLC)间接测定肿瘤患者外周血二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)活性的方法.方法 采用HPLC法测定肿瘤患者血浆中内源性物质二氢尿嘧啶(H2U)和尿嘧啶(U)的比值,间接估算DPD的活性.色谱柱:Xterra RPC18 (250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钠(pH4.0),比例为5∶95;流速为1.0 mL/min,H2U和U检测波长分别为204 nm、260 nm.结果 H2U线性范围为62.5 ～2 000μg/L,线性方程为:Y=7.48×10 -4X+ 1.24×10-1,r=0.999 7(n=6),批内RSD小于7.7％,批间RSD小于13.8％,方法学回收率为99.63％ ～ 103.02％;U线性范围为15.625 - 500 μg/L,线性方程为:Y=3.42×10-3X+2.58×10-2,r=0.999 3(n=6),批内RSD小于8.3％,批间RSD小于13.4％,方法学回收率为98.38％～109.08％.结论 本方法可用于肿瘤患者外周血DPD活性的常规监测.     

体外循环术中自体血洗涤回输对机体红细胞免疫及肾功能的影响

目的探讨体外循环心脏直视手术中自体血洗涤回输对机体红细胞免疫及肾功能的影响。方法32例心脏瓣膜置换患者,分为自体血洗涤回输实验组及体外循环剩余机血、库存红细胞回输的对照组(各16例)。体外循环术中采用血液处理机将失血回收、洗涤处理后回输。分别于术前,术后12 h、24 h、72 h及7 d抽取肝素抗凝的外周静脉血,比较两组红细胞免疫功能即红细胞C3b受体花环率(C3bRR)、红细胞免疫复合物花环率(RBCICR),血浆游离血红蛋白含量(FHB),尿蛋白,肌酐清除率(Ccr)。记录两组术后输注的库存红细胞及血浆量。结果(1)实验组术后12、24、72 h,7d RBC-C3bRR(14．3％±4．7％、15．9％±3．6％、16．6％±2．8％、19．9％±4．1％),RBC-ICR (8．7％±1．9％、9．2％±2．0％、9．5％±2．6％、12．0％±2．0％)均明显高于对照组RBC-C3bRR (10．7％±2．4％、11．3％±3．0％、12．3％±3．5％、14．5％±2．0％),RBC-ICR(5．9％±1．4％、6．0％±1．8％、7．0％±1．7％、8．7％±2．7％),受损红细胞免疫功能恢复较快,明显优于对照组(均P< 0．05)。(2)实验组术后12 h,24 h FHB(0．41g／L±0．13 g／L、0．03 g／L±0．02 g／L)明显低于对照组(1．02 g／L±0．23 g／L、0．54 g／L±0．09 g／L)(P<0．01),术后24 h尿蛋白(0．19 g／d±0．08 g／d)明显低于对照组(0．32 g／d±0．07 g／d,P<0．05)。(3)实验组术后24 h肌酐清除率(68 ml·min-1·1．73 m-2±10 ml·min-1·1．73 m-2)明显高于对照组(45 ml·min-1·1．73 m-2±4 ml·min-1·1．73 m-2,P<0．01)。(4)实验组术后输库存红细胞量(2．0 U±1．1 U)明显低于对照组(7．4 U±2．3 U, P<0．01)。结论体外循环术中自体血洗涤回输后在促进机体受损红细胞免疫功能的恢复和减少对肾功能损害方面明显优于回输体外循环剩余机血和库存红细胞。     

肾移植受者TPMT和ITPA基因多态性与硫唑嘌呤所致不良反应关系的研究

目的探讨硫嘌呤甲基转移酶（TPMT）和三磷酸肌苷焦磷酸酶（ITPA）基因多态性与硫唑嘌呤（AZA）所致各种不良反应的关系。方法应用高效液相色谱法（HPLC）Ng定155例肾移植受者红细胞TPMT和ITPA活性,采用等位基因特异性的PCR（ASPCR）和限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测TPMT＊2、＊3A、＊3B和＊3C四种基因型,采用实时荧光定量PCR和PCR-RFLP的方法分别检测ITPA 94C〉A和IVS2＋21A〉C两种基因型,分析TPMT和ITPA活性和基因多态性与AZA所致不良反应的关系。结果155例肾移植受者中,120例患者未发生不良反应,将其作为对照组,平均TPMT活性为（37．26±11．60）U,平均ITPA活性为（97．9±34．7）U。另外35例患者由于发生了不良反应而停用AZA或减少了AZA的剂量。其中12例患者产生了血液毒性,平均TPMT活性为（22．92±10．67）U,明显低于对照组（P〈0．05）,其中仅2例患者为TPMT＊3C突变基因杂合子,AZA所致的血液毒性主要与患者红细胞TPMT活性低下有关。18例患者产生了肝脏毒性,其TPMT和ITPA活性离散度较大,其均值分别与对照组比较均无统计学差异（P〉0．05）。其中仅发现2例TPMT＊3C和4例ITPA94C〉A突变基因杂合子,TPMT和ITPA活性和基因多态性与AZA所致的肝脏毒性无明显相关性。5例患者产生了胃肠紊乱症状（包括1例患者同时产生了肝脏毒性）,其中有2例患者ITPA活性缺乏,为ITPA94C〉A突变基因纯合子,另外3例患者ITPA活性较低,为ITPA94C〉A突变基因杂合子。剩余1例患者出现了流感样症状,ITPA活性缺乏,为ITPA94C〉A突变基因纯合子。ITPA活性缺乏或ITPA94C〉A基因突变纯合子患者极易发生AZA所致胃肠紊乱症状和流感样症状的不良反应。结论一在服用AZA之前,对患者TPMT活性进行测定,有利于避免AZA所致血液毒性的发生。而对患者进行ITPA活性和基因多态性检测,有利于避免AZA所致的胃肠紊乱和流感样症状的产生,使AZA的使用更加安全、合理。     

血浆中萘丁美酮活性代谢物的反相高效液相色谱法测定

为研究萘丁美酮的相对生物利用度,建立了用反相高效液相色谱法测定血浆中萘丁美酮的活性代谢物６－甲氧基－２萘乙酸（ＭＮＡ）溶液的方法。实验结果表明,以萘普生作内标,甲醇：０．０２ｍｏｌ／Ｌ醋酸盐缓冲液（ｐＨ３．０）为７４．２６作流动相,用ＹＷＧ－Ｃ１８柱有良好的分离效果;血浆样品在ｐＨ３．０醋酸盐缓冲液存在下,用二氯甲烷萃取,回收率高,在２７０ｎｍ波长下检测杂质峰少。该法标准曲线在０．５～６４ｍｇ／Ｌ     

老年鼠海马自由基与学习记忆关系的研究

目的　探讨老年鼠海马自由基与学习记忆的关系。方法　测试 116只雄性Sprague Dawley大鼠在水迷宫中的学习记忆成绩 ,其中老年鼠 4 6只、青年鼠 36只和成年鼠 34只 ,大鼠海马透析测定各组海马中的羟自由基和超氧化物歧化酶 (SOD)的含量 ,进行海马CA1和CA4段形态学检查 ,探讨自由基对海马细胞和学习记忆的影响。结果　老年鼠海马SOD活性 (U·g-1·min-1)为 4 10± 5 0 ,青年鼠为 880± 6 2 ,成年鼠为 86 0± 6 0。老年鼠比青年鼠和成年鼠海马自由基显著增加 (P <0 0 0 1) ,老年鼠海马细胞数目比对照组显著减少 (P <0 0 0 1) ,导致学习记忆成绩下降 (P <0 0 1)。结论老年鼠学习记忆能力的下降与自由基显著增加和海马神经元数量下降成正相关。     

高效液相色谱法同时测定血浆中的肾上腺素和去甲肾上腺素

为同时测定人血浆中肾上腺素和去甲肾上腺素浓度,建立了高效液相色谱－电化学检测方法,采用ＹＷＧ－Ｃ１８分析柱,３,４－二羟在苄胺作内标,以０．０５ｍｏｌ／Ｌ醋酸盐结冲液（ｐＨ３．０）－甲醇－０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ－Ｎａ２（７８：２０：２）为流动相,每１Ｌ流动相含ＳＤＳ２００ｍｇ,流速为１．０ｍｌ／ｍｉｎ。去甲肾上腺素和肾上腺素及内标的保留时间分别为７．３、８．３和１０．４分钟,线性范围均为３１     

肢体与心肌缺血后处理对兔急性心肌缺血再灌注损伤的对比研究

目的探讨在体状态下,肢体缺血后处理是否具有减轻心肌缺血再灌注损伤的作用,并探讨其机制。方法在新西兰大白兔心肌缺血再灌注模型,给予冠状动脉左前降支(LAD)30 m in缺血,180 m in再灌注。所有动物随机分为4组(每组10只):(1)对照组;(2)心肌缺血预处理组;(3)心肌缺血后处理组;(4)肢体缺血后处理组;在缺血前、后及再灌注结束后分别测定血浆磷酸肌酸激酶(CK)和丙二醛(MDA)活性;实验结束后,测定心肌梗死面积并检测心肌组织髓过氧化物酶(MPO)活性。结果心肌缺血预处理组、心肌缺血后处理组和肢体缺血后处理组心肌梗死面积分别为15.5%±1.7%、16.2%±2.0%、17.1%±1.7%,均明显低于对照组(31.5%±1.3%,P<0.01);再灌注3h末血浆CK活性,肢体缺血后处理组与对照组分别为18.0 IU/g±1.6 IU/g与45.6 IU/g±5.5IU/g(P<0.01);缺血预处理组、缺血后处理组和肢体缺血后处理组在再灌注3h末MDA活性分别为2.12μmol/m l±0.30μmol/m l、2.17μmol/m l±0.24μmol/m l和2.16μmol/m l±0.33μmol/m l,均明显低于对照组(3.49μmol/m l±0.32μmol/m l(P<0.01);心肌缺血预处理组、心肌缺血后处理组和肢体缺血后处理组中性粒细胞在缺血心肌的聚集程度,即组织MPO活性分别为1.43 U/100 g±0.32U/100 g、2.26 U/100 g±0.28 U/100 g和2.45 U/100 g±0.28 U/100 g,均较对照组(5.44 U/100 g±0.46 U/100 g)明显降低(P<0.01)。结论对于已经缺血的心肌,在再灌注前给予肢体短暂缺血再灌注处理具有与心肌缺血预处理相似的心肌保护作用。这种远隔器官缺血后处理心肌保护作用可能与减轻活性氧的损伤及抗氧化作用加强有关。