日本血吸虫表皮膜蛋白的研究 Ⅰ.细胞免疫和体液免疫反应观察

本文报道以血吸虫表皮膜蛋白作抗原,采用淋巴细胞转化试验和ELISA方法对感染血吸虫的家免作纵向免疫反应观察,发现感染后25天淋巴细胞转化反应达高峰,40天后逐渐下降,而IgG抗体于感染后25天开始升高并维持在一个高水平,用ELIsA方法检测10例血吸虫病人均呈阳性反应,对5例正常人及35例其他寄生虫感染者血清均为阴性反应,提出表皮膜蛋白有可能用于血吸虫病的免疫诊断。     

日本血吸虫成虫表皮膜蛋白的研究——Ⅲ.ELISA法在疗效考核中的价值

用吡喹酮(100mg/kg)治疗感染日本血吸虫42d后的家兔,1周后用相同剂量的吡喹酮重复治疗1次。用成虫表皮膜抗原-酶联免疫吸附试验(TA-ELISA)和虫卵可溶性抗原-酶联免疫吸附试验(SEA-ELISA)分别检测治愈后的家兔血清中特异性IgG下降水平。结果发现家兔血清中抗TA的特异性IgG在治愈后5个月降至正常水平(OD 492nm<0.2),而抗SEA的特异性IgG仍维持在一个较高的水平(ODx=0.57),二者相比,差异有显著性意义,提示疗效考核时,TA-ELISA法优于SEA-ELISA法。     

抗日本血吸虫单抗识别曼氏血吸虫表面蛋白的研究

【目的】 证明本实验室所制备的抗日本血吸虫表面蛋白(Sj29)的单克隆抗体可识别曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29),拓宽抗Sj29单克隆抗体的用途,为今后研发检测血吸虫病的通用型试剂盒打下基础。 【方法】 通过基因工程技术和分子生物学技术扩增曼氏血吸虫表面蛋白基因(Sm29)并与T载体连接,连接产物转化至感受态细胞(大肠埃希菌),挑取单菌落,摇菌,提质粒双酶切鉴定,测序,再将测序正确的Sm29基因与真核表达载体pEGFP-C2连接,构建重组真核表达质粒,再将该重组质粒转染至真核细胞COS-1中表达,荧光显微镜观测转染效率。最后用蛋白质印迹技术和细胞爬片免疫组化两种方法验证抗Sj29单克隆抗体和兔日本血吸虫感染血清能否识别Sm29蛋白。 【结果】 经酶切后,琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,所得的条带的位置及大小均与目的基因的位置及大小相一致,并且目的基因测序结果的相似度为99%,其中1%突变的碱基为无义突变类型,对蛋白的表达没有影响。荧光显微镜下观察转染效率为30%~40%。用日本血吸虫表面蛋白(Sj29)和曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29)分别作为一抗进行蛋白质印迹,其结果显示此株抗Sj29单克隆抗体均能识别上述两种蛋白,并且其识别日本血吸虫表面蛋白(Sj29)的位置位于20 kd左右,而其识别曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29)的位置位于55 kd左右,这两种结果均符合预期结果。以抗Sj29的单克隆抗体和日本血吸虫感染的兔血清分别为一抗作免疫组化,其结果均呈阳性,其对照组分别以PBS和正常兔血清为一抗,结果均呈阴性。说明抗Sj29的单抗不仅可以识别Sm29蛋白,同时感染兔血清中的抗体也可以识别曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29),进一步提高了以后研发检测血吸虫病通用试剂盒的可行性。 【结论】 抗Sj29单克隆抗体能识别Sm29蛋白,为今后研发检测血吸虫循环抗原的通用型试剂盒打下基础。     

日本血吸虫重组SjTsp2/Sj29 ku蛋白疫苗对小鼠免疫效果的研究

目的探讨日本血吸虫重组Tsp2/Sj29 ku表膜蛋白疫苗对小鼠的抗病免疫效果。方法 pet32a/SjTsp2/Sj29 ku重组菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG)诱导表达,制备纯化的重组蛋白。29只6周龄雌性昆明鼠随机分为蛋白疫苗组、硫氧还蛋白组和空白对照组,前两组各10只,空白对照组9只。蛋白疫苗组,第一次免疫每鼠经背部皮下多点注射用等体积弗氏完全佐剂乳化的50μg SjTsp2/Sj29 ku重组表膜蛋白,第12、24天每鼠皮下多点再次注射用等体积弗氏不完全佐剂乳化的50μg该重组蛋白。硫氧还蛋白组的免疫方法同蛋白疫苗组。空白对照组用生理盐水代替蛋白,免疫方法同前。末次免疫后第10天,每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±2)条。于感染45 d后剖杀全部实验小鼠,计算减虫率和减卵率。眼眶取血,分离血清,间接性ELISA法检测IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗体亚型,同时检测血清细胞因子γ干扰素( IFN-γ)、白介素4( IL-4)水平。结果 pet32a/SjTsp2/Sj29 ku菌经IPTG诱导可大量表达,经变性、复性获得纯化的日本血吸虫Tsp2/Sj29 ku重组表膜蛋白。蛋白疫苗组与空白对照组比较,减虫率和减卵率显著升高( P<0.05)。硫氧还蛋白组与空白对照组之间比较,减虫率和减卵率差异均无统计学意义( P>0.05)。蛋白疫苗组小鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG2b显著高于空白对照组(P<0.05),而IgG3和IgM较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。蛋白疫苗组小鼠血清IFN-γ、IL-4细胞因子显著高于空白对照组( P<0.01)。结论日本血吸虫 Tsp2/Sj29 ku重组表膜蛋白疫苗对小鼠抗感染有一定的保护性;该重组蛋白免疫引起的是 Th1/Th2混合型免疫反应。     

紫外线照射日本血吸虫尾蚴疫苗保护性抗原的筛选

目的：分析经紫外线照射处理后日本血吸虫尾蚴蛋白的差异性表达，并从中筛选出有效的保护性抗原组分。方法：收集尾蚴，制备抗原，进行SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，与照射尾蚴免疫血清和正常感染血清分别进行免疫印渍(Western blot)试验，比较两反应条带的差异性，筛选出惟有免疫血清所能识别的特有的抗原组分，并测定其分子量。结果：在童虫抗原中发现一条能被免疫血清所识别的特异性抗原条带，并测得其分子量为75kDa。结论：紫外线照射致弱尾蚴可诱导宿主产生特异性抗体，被该抗体所识别的抗原分子量为75kDa。     

未成熟日本血吸虫卵的组分蛋白及其免疫学特性的研究

应用SDS－PAGE对日本血吸虫4周、5周和6周－SEA进行分析,分别出现21、14和20条组分蛋白带,三者间既有共同组分又存在差异,显示出不同的分子基础。于攻击感染后0～8周作动态观察,ELIB结果表明,4周－SEA及其免疫鼠血清的免疫学特性与5周－SEA和6周－SEA存在一定差异,其中被4周－SEA免疫鼠血清识别的72．4～68．5ku蛋白宽带至攻击感染后6～8周消失,与该抗原免疫鼠肝内虫卵数减少、虫卵发育延缓及肉芽肿缩小（在6周前）及后来的恢复（8周）基本一致。     

免疫抑制剂对日本血吸虫发育及抗体水平的影响

分别使用一定剂量的地塞米松和环磷酰胺处理日本血吸虫病免，结果血吸虫荷分别减少20．5％，36．7％，雌雄比值最低降至0．58，抗体滴下降明显，第12周时的肉芽肿体积较第8周的缩小了一半。表明免疫抑制剂对血吸虫发育，抗体和虫卵肉芽肿形成均有显著的抑制作用，提示血吸虫病血清学检测出现假阴性可能与宿主免疫功能低下有关。     

日本血吸虫循环免疫复合物中抗原的鉴定

用低浓度ＰＥＧ（ＭＷ６０００）提取的日本血吸虫感染兔血清中循环免疫复合物（ＣＩＣ）直接免疫家兔，制备ＣＩＣ兔血清。采用酶联免疫印迹技术（ＥＩＴＢ）分析鉴定日本血吸虫ＣＩＣ中抗原成份。结果表明，ＣＩＣ中成虫及其排泄分泌物源性抗原成份有１７种，虫卵源性抗原成份有５种。且ＩＦＡＴ方法分析ＣＩＣ中抗原成份定位于成虫表膜及肠腔上皮。     

日本血吸虫外分泌蛋白、跨膜蛋白基因筛选与无缝克隆

目的:探讨无缝克隆技术在构建日本血吸虫基因重组质粒中的应用价值。方法:从血吸虫基因组数据库中筛选含有信号肽或跨膜结构域的基因,截取胞外段大于110个氨基酸残基的基因片段。根据无缝克隆技术原理,设计引物。以日本血吸虫基因组DNA为模板,进行PCR扩增。纯化后的PCR产物与线性化载体p ET32c(+)/Bam HⅠ+XhoⅠ以摩尔比6∶1混和,利用Seamless cloning enzyme在25℃反应30 min。化学法将连接产物转至大肠杆菌Trans 5α,菌落PCR筛选阳性克隆。提取质粒,Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切验证后送测序。测序结果用DNAStar进行序列分析。结果:通过生物信息学软件分析,在日本血吸虫基因组数据库中共筛选到278个含有信号肽或跨膜结构域且胞外段大于110个氨基酸残基的目标基因。对其中41个单一外显子的基因进行了无缝克隆引物设计和合成。PCR成功扩增到33个基因片段,并与线性化的p ET32c(+)进行无缝克隆连接。经菌落PCR和酶切验证获得28个阳性重组质粒。测序显示28个插入基因片段序列正确。结论:利用Seamless克隆技术成功获取了一批含有日本血吸虫基因或基因片段的重组质粒,省去了传统的酶切、连接、去磷酸化等手段,节省了时间,提高了效率,为后续的日本血吸虫免疫组学的高通量抗原筛选和鉴定奠定了基础。     

日本血吸虫新基因的克隆及分析

目的：克隆并分析日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）新基因,提供有效的疫苗候选分子。方法：用Sj雄虫可溶性抗原免疫家兔血清为探针筛选Sj成虫cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果：共筛选得11个阳性克隆,经分析有2个新基因,分别是Sj-P8（GenBank注册号AF517843）和Sj肌球蛋白cDNA序列（GenBank注册号AY770506）,分别编码含75个氨基酸的跨膜蛋白和含212个氨基酸的蛋白片断。结论：Sj-P8和Sj肌球蛋白cDNA序列可能为日本血吸虫疫苗的研究提供有价值的材料。     

日本血吸虫亲免素基因的扩增及序列分析

【目的】研究日本血吸虫亲免素基因编码序列的结构及进行初步的功能预测。【方法】用5’端和3’端锚定PCR从尾蚴库中扩增，以获取日本血吸虫中国大陆株亲免素基因完整的开放阅读框(open reading frame，ORF)；用生物信息学技术确认其是否为亲免素编码基因并进行结构功能的初步分析和预测。【结果】用5’端和3’端锚定PCR从尾蚴库中获得了亲免素基因5’端和3’端所缺序列，得到的亲免素基因cDNA的总序列长为1438bp，其ORF长1296bp，编码431个氨基酸。利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫亲免素基因的完整cDNA序列。并用RT-PCR从日本血吸虫尾蚴mRNA扩增出亲免素基因的ORF。【结论】成功获得了日本血吸虫亲免素编码基因的全长cDNA，为进一步的功能研究打下了基础。     

日本血吸虫尾蚴细胞对小鼠免疫保护性的初步研究

多年来,人们一直试图建立血吸虫病主要致病原的持续分裂细胞系,即体外培养血吸虫细胞,但未获得满意的结果。血吸虫细胞在体外难以传代及分类培养,到目前为止尚未找到一种有效的裂变剂。1997年,李靓如等以细胞工程学技术完成了猪囊尾蚴细胞系的建立及其生物学性质的研究,并产生了一个寄生蠕虫系。用相同技术,我室成功地对日本血吸虫尾蚴细胞进行体外培养研究。目前,尾蚴细胞已培养至第五代,用其作抗原检测31例血吸虫病人的阳性率为90．3％,检测30例正常人血清的假阳性率为6．7％在此基础上,本研究用第五代尾蚴细胞作免疫原,观察了在小鼠体内抗日本血吸虫的免疫保护效果。     

曼氏血吸虫与日本血吸虫交叉免疫原性的血清学实验研究

以曼氏血吸虫的虫卵和成虫免疫家兔后所产生的特异性抗体,可用以日本血吸虫虫卵、尾蚴和成虫为抗原分别进行的COP,CHR和ELACIEP测出,表明两种人体血吸虫存有显著的交叉抗原成分。应用此种血清交叉反应性,以检测抗异种人体血吸虫的抗体,似有效而可取的,可用以辅助诊断援外回国人员是否感染国外人体血吸虫病。     

日本血吸虫重组抗原的诱导表达及其免疫学活性鉴定

为了筛选和发现日本血吸虫新的疫苗候选抗原分子我们构建了日本血吸虫抗原ＰＳｊ＾５１４与表达载体ｐＧＥＸ－１λｔ重组体，表达克隆ｐＧＳｊ２４。对工程菌的诱导表达及表达产物分析证实，特异性表达产物是分子量约为２２ｋＤａ的两条十分接近的蛋白带。该蛋白可溶性蛋白，表达方式为分离表达，可被日本血吸虫免疫兔血清，感染兔血清及病人血清特异地识别。     

紫外线减毒尾蚴活疫苗预防小鼠日本血吸虫感染有效照射剂量及免疫次数的研究

本文以小鼠为实验对象,探讨了紫外线减毒尾蚴活疫苗预防日本血吸虫感染的有效照射剂量和有效免疫次数。现予以报道。1 材料与方法1.1 实验动物 选用本校实验动物中心提供的中国昆明种10周龄雌性小鼠,随机分组。1.2 紫外线减毒尾锄活疫苗的制备 取武汉市东西湖区自然感染日本血吸虫的阳性钉螺,按常规法     

三种吸虫抗原与日本血吸虫抗原之间的交叉反应性及其表位研究

采用免疫标记技术（ＴＥＳ一ＩＥＳＴ、ＡＷＡ一ＩＥＳＴ和ＴＥＳ一ＩＦＡＴ）及酶联免疫印渍技术（ＥＬＩＢ）对卫氏并殖吸虫，华支睾吸虫和姜片虫成虫可溶性抗原与日本血吸虫卵和成虫可溶性抗原之间的交叉反应性及其表位分子基础进行了研究。７１０份上述３种吸虫病人血清与日本血吸虫抗原之间的交叉反应率分别为３．９％（１０／２５９），４．２％（１１／２６１）和３．２％（６／１９０）．用ＥＬＩＢ对上述吸虫组分抗原分析结果表明，卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫和姜片虫抗原与日本血吸虫抗原之间的交叉反应表位分子量分别为９７～７６ｋｕ，４０～１４．５ｋｕ和１０６～１４ｋｕ，华支睾吸虫和姜片虫成虫抗原之间显示６７～１４ｋｕ，范围的交又反应表位分子量。本研究为今后纯化抗原，提高血清学方法的特异性和敏感性，提供了重要依据。